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1、熒光定量PCR技術在 臨床檢測中的應用,中山大學 中山醫(yī)學院生物化學教研室 達安基因股份有限公司首席科學家 朱振宇 醫(yī)學博士、教授、博士生導師 Tel：13922430138，02037656430,九十年代中期PCR臨床應用在國內(nèi)全面展開 1998年 熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測,1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功實驗發(fā)明了PCR 1985 關于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在Science上 發(fā) 表 1989 12月Science雜志將PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名為第一個“年度分子”。 19
2、93 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry,1995 Perkin Elmer 公司研制出熒光定量PCR技術,循環(huán)次數(shù) DNA的鏈數(shù) 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10億,PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關系,PCR循環(huán),PCR特點：高效擴增、忠實復制,靈敏度高 快捷 簡便 對樣品純度要求低 可以相對定量,PCR反應的特點,Ct值的意義,Ct值與重復性 同一樣本在相同條件下同時進行96次擴增,FQ-PCR,Ct值與濃度 不同的模板達到熒光域值時的Ct值不
3、同,感染性疾病的診斷 母嬰傳播的控制與觀察 遺傳疾病的診斷 腫瘤的診斷 法醫(yī)學鑒定,熒光定量PCR的臨床應用,早期診斷 病情評估和預后判斷 抗病毒藥物療效的觀察、指導 新藥驗證,一 感染性疾病 1. 病原體含量與病情之間的關系 2. 病原體含量與用藥之間的關系 3. 藥物及療法的研究與開發(fā) 4. 新的病原體分子診斷標準 5. 新的愈后指標 6. 傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預測與預防,臨床應用,臨床應用,二 腫瘤 1. 腫瘤標志物：癌胚抗原、同功酶、抗體、激素、細胞因子、受體等 2. 腫瘤相關基因表達的檢測：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉移基因及轉移抑制基因,三 遺傳病 1. 等位基因檢測 2. 多基因遺傳
4、病的突變檢測 3. 基因表達異常所致遺傳病檢測,熒光定量PCR在病原體檢測中的應用,一 肝炎病毒定量檢測 二 性病病原體檢測 三 結核桿菌及呼吸道病原體檢測 四 優(yōu)生優(yōu)育(TORCH)相關項目檢測,臨床應用,肝炎病毒定量檢測 HBV HCV,臨床應用,（一） 乙型肝炎病毒結構及特點,HBsAg：是HBV感染的主要標志 HBsAb：保護性抗體 HBcAg：僅存于感染的肝細胞核內(nèi)， 一般不存在于血循環(huán)中 HBcAb: 非保護性抗體，HBcAb-IgM 提示HBV處于復制狀態(tài) HBeAg：HBV復制及強感染性的指標 HBeAb：有一定的保護作用，預后良好,HBV,HBV,（二） HBV-DNA與“兩
5、對半”,1. “兩對半” ：機體的免疫反應狀態(tài)；,2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學指標不能 反應體內(nèi)病毒復制水平與感染程度。,FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質DNA，是 病毒存在和復制的最可靠、最直接的指標。,3. 血清學指標()不能排除HBV感染。,HBV,（二） HBV-DNA與“兩對半”,4. 也可能出現(xiàn)HBsAg()，HBV-DNA()。,5. HBsAb () 、 HBcAb () 、 HBeAb ()三抗體陽性 與HBV DNA 2.5 103 copy /ml 結果解釋。,HBV,(三) HBV-DNA定量檢測的臨床意義,3. HBV-DNA定量與預后
6、a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌變的幾率明顯高于含量低者,1. HBV-DNA定量與HBV復制水平及傳染性,2. HBV-DNA定量與乙肝藥物療效 a. 專家提出103 copy /ml做為陰性或臨床治愈標準 b. HBV-DNA定量分析與干擾素治療(前、中、后) c. 拉咪呋啶,HBV感染與干擾素治療,治療前： a: 治療前HBV低水平復制者對干擾素的反應性明 顯優(yōu)于高水平復制者。 b: 治療前HBV DNA 含量特別高者大多沒有療效。 c: HBsAg轉陰的幾乎都是那些治療前血清HBV DNA 含量較低者。,HBV感染與干擾素治療,治療中： a: 病毒復制水平迅速降低者，有望治
7、愈。 b: 相反，治療期間HBV DNA復制水平下降較慢， 或下降幅度較小，或者變化不明顯者，大多是 干擾素治療無效。,HBV感染與干擾素治療,治療后： a: 治療結束后，采用PCR定量法檢測，HBV DNA 103 copy/ml 者，可能不再復發(fā)。 b: 終止治療后HBV DNA 仍保持較低水平者， 反跳的可能性較大。,Poor Response to IFN Therapy,CHRONIC HEPATITIS B,拉咪呋啶： 有顯著降低高病毒載量作用，近期療效頗有優(yōu)勢，但是長期使用可導致HBV變異，患者易出現(xiàn)耐受性，而且容易出現(xiàn)停藥后反彈。,HBV感染與拉咪呋啶治療,拉米夫定抑制血清HB
8、V DNA,HBV,(三) HBV-DNA定量檢測的臨床意義,4. HBV-DNA定量有助于指導懷孕與孕期，哺乳期檢查,6. 血液制品和獻血員的篩選,病毒特點： 1. 單正鏈RNA病毒 2. E1和E2區(qū)基因高度變異性,（一）丙型肝炎病毒特點,HCV,感染特點： HCV在血中含量極微 輸血后肝炎主要致病因子 免疫學標志僅有抗-HCV，非中和抗體，產(chǎn)生時間不一 有一部分人感染HCV后，不產(chǎn)生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%) 疫苗研制尚不成功,單鏈RNA,(二) HCV-RNA定量檢測的臨床意義,1. 早期診斷 a. 臨床以 80 copy/ml做為無感染或治愈標準。 b. HCV感染1
9、-3W，即可檢出HCV-RNA的存在。 c. 嚴格篩選獻血員 ,提高對窗口期感染者的檢出率。 d. 醫(yī)療糾紛中的“舉證倒置”，病人入院前后進行HCV-RNA檢測。,HCV,HCV,(二) HCV-RNA定量檢測的臨床意義,2. HCV-RNA載量與抗-HCV滴度、ALT水平之間的相關性。 抗-HCV滴度和ALT異常率隨著HCV-RNA載量升高而增加。,3. HCV-RNA是評價抗病毒治療效果的重要指標。,4. 慢性丙型肝炎長期抗-HCV陽性，這時如果進行HCV-RNA 定量檢測可以鑒別活動性、復制程度。,二 常見性傳播疾病病原體,一 淋球菌（NGH） 二 沙眼衣原體（ CT ） 三 解脲脲原體
10、（UU） 四 梅毒螺旋體（TP） 五 單純庖疹病毒（HSV） 六 乳頭瘤病毒（HPV） 七 人類免疫缺陷病毒（HIV） 八 EV71 A16 通用型,STD,艾滋病,艾滋病是英文AIDS（Acquired Immunity Deficiency Syndrome) 的中文譯音，全稱是“獲得性免疫缺陷綜合征”。它可以由人類免疫缺陷病毒（HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus ），又稱艾滋病病毒引起的疾病。當病毒侵入人體后，經(jīng)一段時間的潛伏期，破壞人體的免疫力，從而發(fā)病，病死率高，是一種嚴重的傳染病。,艾滋病是一種有明確病原體的可通過人之間一定傳播途徑傳
11、播的慢性傳染病，屬于傳染病防治法中規(guī)定的乙類傳染病,HIV病毒：多亞型和多變異,HIV-1和HIV-2 M組、O組和N組 亞性型：A-K CRF：基因重組亞型，主要是HIV-1型 毒株亞型監(jiān)測的意義 不同亞型與不同傳播途徑的關系：B主要通過男性同性性行為和靜脈注射吸毒傳播，C主要異性性接觸傳播 流行地理和傳播線路的分析：東南亞區(qū)域的C亞型和B亞型 重組亞型傳播效力變化及對流行的影響：東歐的B/A重組流行、泰國的A/E重組,艾滋病病毒在外界的抵抗力,HIV病毒一旦離開宿主細胞在外界環(huán)境中生存能力很快消失 HIV對環(huán)境中的物理因素和化學因素抵抗力均較弱，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多 對H
12、BV有效得消毒和滅活方法均適用于HIV,典型進展者：8-10年潛伏期后成為艾滋病人，80% -90% 快速進展者：CD4細胞2-5年內(nèi)迅速下降，HIV病毒載量一直維持較高水平，而且分離的HIV有均一性。 長期存活者（又稱長期不進展者）：維持15年以上，而且CD4計數(shù)維持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。,HIV感染的三種結局,艾滋病的診斷,HIV感染者：確定HIV感染的個體 抗體檢測：初篩和確認 輔助診斷 艾滋病病人：臨床診斷標準見國家標準HIV/AIDS的診斷標準和防治原則 GB16000-1995,熒光定量PCR的應用為艾滋病的初篩和輔助 檢查提供了有力的工具,NGH,淋球菌感染
13、與致病,1. 人是淋球菌的惟一宿主。,2. 發(fā)病率最高，在所STD疾病中，高達60%左右。,3. 發(fā)病趨勢： a. 男性多于女性。 b. 城市走向農(nóng)村， c. 高收入階層向低收入階層擴展,4. 人對淋球菌感染無天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。,5. 如母親為淋病患者，嬰兒出生時易患上淋球菌性結膜炎,CT,沙眼衣原體感染與致病,1. 嚴格的細胞內(nèi)寄生。,2. 不僅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原體。,3. 近年來在歐美等國，沙眼衣原體的感染率和危害 性已超過淋球菌而居STD之首。,4. 在我國，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。,5. 泌尿生殖道感染，妨礙妊娠。,6
14、. 盆腔感染，可致生殖能力損害。,UU,解脲脲原體感染與致病,合成尿素酶，分解尿素,2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率僅次于衣原 體感染，居第二位。,3. 流產(chǎn)超過4次以上者，檢出率高達80%。,4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。,5. 與男性不育相關。男性不育患者精液中，脲原體檢出率高達66.6。檢出率隨精子數(shù)減少和精子活動力下降而升高。,1. 非培養(yǎng)或形態(tài)學檢查的診斷技術，快速、特異、敏感。 2. 對無癥狀或癥狀輕者，可以早期確診。 3. 對NGH、CT、UU 等混合感染者，診斷和鑒別診斷。 4. 指導用藥、考核療效。,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,NGH/CT/
15、UU,NGH/CT/UU,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,5. 不孕不育、優(yōu)生優(yōu)育。 6. 流行病學調查，為性傳播疾病的監(jiān)控提供依據(jù)。 7. CT、UU是FDA批準的PCR檢測試劑盒，可作為首選 方法，在臨床推廣應用。,人乳頭瘤病毒感染與致病,1. HPV具有宿主和組織特異性，只能感染人的皮膚和黏膜上皮細胞，人是HPV的惟一宿主。 2. 有100多個型。 3. 低危型：HPV 6、11引起良性病變 (尖銳濕疣、喉乳頭瘤等),HPV,人乳頭瘤病毒感染與致病,HPV,4. 高危型：HPV 16、18引起惡性腫瘤 (宮頸癌、 肛門癌、口腔癌等) 5. 免疫原性低，易形成持續(xù)性感染。 6.
16、 新生兒產(chǎn)道感染。,HPV,1. 對典型病例可以明確診斷。 2. 對臨床表現(xiàn)和組織病理改變都不典型的病例同樣可以做出診斷。 3. 對亞臨床和隱性HPV感染做出診斷。 4. 基因分型。 5. 考核療效與預后。 6. 病毒載量與患癌癥風險。,HPV,熒光定量PCR檢測HPV的意義,HPV,手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）,為全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有流行的報道。 1957年在加拿大首次報告，新西蘭Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson從患者糞便和咽拭中分離出CoxA16，同時患者血清抗體有四倍增長,初步查明CoxA16為本病
17、病原； 1959年提出HFMD命名，HFMD在全球廣泛流行，無明顯的地域分布。 之后世界各地均經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、?？刹《竞虴V 71引起的手足口病流行。 發(fā)熱, 不適, 咽喉腫痛, 口腔、手、腳側面及掌心、屁股出現(xiàn)小泡 傳染性極高 病程約1周,HFMD的病原,手足口病可由多種腸道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分?？刹《竞涂滤_ 奇B組病毒, 以CoxA16 和 EV71最為常見 傳播途徑: 糞-口途徑傳播: 唾液與糞便; 呼吸道傳播: 空氣飛沫; 接觸傳播 皰疹液中含大量病毒，皰疹破潰后病毒排出。 HFMD為全球性傳染病，在全球廣泛分布，無明
18、顯的地域分布, 但 近年EV71在東南亞一帶流行, 引起較多的重癥和死亡病例。 在80年代和90年代，中國手足口病的流行主要以 CoxA16為主，2008年，CoxA16 和EV71 共循環(huán)引起手 足口病爆發(fā), EV71在大部分省市為優(yōu)勢病毒。,人腸道病毒感染的一般致病機制,致病特點,隱性感染多見，很少引起腹瀉，嬰幼兒、免疫力低下的成人易感。 病毒在機體腸道中增殖，很少引起腸道癥狀，是以消化道為原發(fā)灶的全身感染。 不同人腸道病毒可引起相同癥狀，同一種人腸道病毒可引起不同臨床表現(xiàn)。 感染過程中形成病毒血癥。,中國HFMD的流行,1981年，我國在上海首次報道了HFMD病例 1987年在中國分離到
19、CVA16 1995年以來，我國陸續(xù)在武漢、深圳、上海、重慶、山東和安徽等地的HFMD患者中分離到EV71病毒。 2007年，山東發(fā)生了手足口病爆發(fā)流行，累計報告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。實驗室檢測發(fā)現(xiàn)EV71是引起山東臨沂HFMD的主要病原，同時還檢測到Echo3 和/或 CVA16。 2008年全國出現(xiàn)HFMD爆發(fā)流行,以HEV71為優(yōu)勢,CVA16還有其它EV共循環(huán)引起,加強HFMD病原檢測和監(jiān)測的十分必要,依據(jù)臺灣1998-2008和中國大陸2007-2008年的經(jīng)驗 掌握手足口病病原譜，特別是EV71感染所占的比例，對析 判斷HFMD疫情導致重癥和死亡的比例有重
20、要的科學參考價值。,手足口病的實驗室檢測,手足口病的診斷一般是通過采集適當?shù)呐R床標本后進行基因檢測、抗原檢測、血清學抗體檢測、病毒分離和病毒鑒定，如果沒有采到合格的臨床標本，或無法進行實驗室檢測。 很多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細胞系對不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時期腸道病毒的流行株也不同。 通常用于腸道病毒分離的細胞系為RD、HEp-2、Vero等，聯(lián)合使用上述的兩種或更多細胞有助于分離到更多的腸道病毒。,病毒實驗室檢測類型-病毒實驗室診斷方法,檢測抗體/抗原,檢測病毒,檢測核酸,ELISA/HI/PA,蛋白印跡,病毒分離,ELISA,電鏡,中和試驗,RT-PCR,實時熒光
21、定量PCR,套式PCR,LAMP,免疫熒光,基因芯片,每種方法 各有優(yōu)勢, 依據(jù)病毒 來定檢測策略,New molecular tools for epidemiology studies and diagnosis,三 結核桿菌與呼吸道病原體檢測,TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia MP：Mycoplasmal pneumonia SARS：severe acute respiratory syndrome H1N1甲型流感 呼吸道合胞病毒,結核桿菌流行現(xiàn)狀（1）,羅伯特科赫（），德國細菌學家，結核桿菌發(fā)現(xiàn)者 結核病是一個全球性的問題，近年來
22、在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)流行，且呈增長的趨勢,TB,結核桿菌流行現(xiàn)狀（2）,我國結核病的疫情僅次于印度而居世界第二位 2000年，全國人口結核感染率為44.5%，其中1544歲人群占了53 ，每年約有25萬人死于結核病,結核桿菌引起的感染,肺部感染：原發(fā)性肺結核，開放性肺結核。 肺外感染：腦、腎、骨、關節(jié)、生殖結核、腸結核、結核性腹膜炎、全身性結核。,常規(guī)結核病實驗室診斷方法及不足,1. 痰涂片作抗酸染色：陽性率低 、費時 2. 細胞培養(yǎng)“金標準”：周期太長(3-4W) 3. 血清學診斷： a. 接種BCG可出現(xiàn)陽性 b. 不能區(qū)分活動性結核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人 c. 交叉反應，假陽性 不能早期
23、診斷！容易漏診、誤診！,TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,1. 能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強 2. 早期、快速、準確地診斷結核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液肺結核 血液播散性結核和各臟器的結核病 腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)結核病 宮頸拭子、尿道拭子泌尿生殖道結核病,TB,3. 熒光定量PCR檢出結核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。 4. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標本中結核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢 ，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù),TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,CP、MP感
24、染可致咽炎、支氣管炎和肺炎，潛伏期約2-3周，通常起病較緩慢。持續(xù)性咳嗽。,肺炎衣原體(CP)、肺炎支原體(MP)感染與致病,CP/MP,MP肺炎約占非細菌性肺炎的1/3以上，或各種原因 引起的肺炎的l0。,MP感染與小兒支氣管哮喘密切相關。,CP感染與冠心病存在密切的關系,肺癌、支氣管擴張患者中CP感染率相對較高,熒光定量PCR用于非典型性肺炎的診斷,意義：1. 直接檢測病原體，早期、快速、特異診斷非典 型性肺炎。 2. 治療方案與細菌、病毒感染的治療方案不同 3. 流行病學調查。 TB、MP、CP已被許多醫(yī)院尤其是婦幼保健醫(yī)院和兒童醫(yī)院納為肺部感染的常規(guī)檢測項目,MP/CP/SARS,甲型
25、H1N1流感,流行性感冒簡稱流感，是由甲、乙、丙三種流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。甲型流感病毒根據(jù)其表面(H和N)結構及其基因特性的不同又可分成許多亞型，至今甲型流感病毒已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個亞型(H1-H16)，神經(jīng)氨酸酶9個亞型(N1-N9)。,“豬流感”更名為“甲型H1N1流感” 世界衛(wèi)生組織4月30日宣布，從當日起，該組織不再使用“豬流感”一詞指代當前疫情，而開始使用“A（H1N1）型流感”一詞。與之相對應，我國的官方文件從5月1日起相繼用“甲型H1N1流感”代替原來的“人感染豬流感”。 世界衛(wèi)生組織發(fā)言人說，之所以更改叫法，是因為“豬流感”一詞容易誤導消費者，美國和墨西哥等國的豬肉
26、及豬肉制品已明顯受到其他國家進口禁令影響。 世界衛(wèi)生組織的聲明說，根據(jù)目前掌握的科學依據(jù)，此次流行的病毒僅在人際間傳播，尚無證據(jù)表明它在豬群內(nèi)傳播，或由豬向人傳播，也無證據(jù)表明人因食用豬肉或相關產(chǎn)品染病。,病 原 學,甲型H1N1流感病毒屬于正粘病毒科，典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80 nm120 nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA 和M2蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼, 呈螺旋狀對稱, 直徑為10nm。甲型H1N1流感病毒為單股負鏈RNA 病毒，基因組約為13.6 kb，由大小不等的8 個獨立片段組成。,流行病學特點,傳染源 主要為病豬和攜帶病毒的豬，
27、感染豬流感病毒的人也被證實可以傳播病毒。感染這種病毒的動物均可傳播。 傳播途徑 主要為呼吸道傳播，也可通過接觸感染的豬或其糞便、周圍污染的環(huán)境或氣溶膠等途徑傳播。某些毒株如H1N1可在人與人之間傳播，其傳染途徑與流感類似，通常是通過感染者咳嗽或打噴嚏等。,易感人群 普遍易感?；颊叨鄶?shù)年齡在25歲至45歲之間，目前報道以青壯年為主，應注意老人和兒童。,臨床表現(xiàn),潛伏期一般1至7天左右，較流感、禽流感潛伏期長。 人感染甲型H1N1流感后的早期癥狀與普通人流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等，有些還會出現(xiàn)腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等。,部分患者病情可迅速進展，來勢兇猛
28、、突然高熱、體溫超過39，甚至繼發(fā)嚴重肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細胞減少、腎功能衰竭、敗血癥、休克及Reye綜合征、呼吸衰竭及多器官損傷，導致死亡。,實驗室檢查,外周血象：白細胞總數(shù)一般不高或降低。重癥患者多有白細胞總數(shù)及淋巴細胞減少，并有血小板降低； 血清學診斷：可使用間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免疫法等； 反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）：由于PCR技術具有簡便、快速、靈敏、特異性強等特點，已用于豬流感病毒基因的檢測和分子流行病學調查等；,4 病毒分離：從患者呼吸道標本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或氣管吸出物、痰或肺組織）分離甲型H1N1流感病毒。常
29、用的方法有雞胚接種法和細胞培養(yǎng)法?，F(xiàn)有的診斷方法中，病毒分離法是較敏感的，但需要2-3周時間。,人感染豬流感的診斷標準,醫(yī)學觀察病例：曾到過甲型H1N1流感疫區(qū)，或與病豬及甲型H1N1流感患者有密切接觸史，1周內(nèi)出現(xiàn)流感臨床表現(xiàn)者。列為醫(yī)學觀察病例者，對其進行7天醫(yī)學觀察（根據(jù)病情可以居家或醫(yī)院隔離）。,2 疑似病例：曾到過疫區(qū)，或與病豬及甲型H1N1流感患者有密切接觸史（也可流行病學史不詳），1周內(nèi)出現(xiàn)流感臨床表現(xiàn)，呼吸道分泌物、咽試子、痰液、血清H亞型病毒抗體陽性或核酸檢測陽性。,臨床診斷病例：被診斷為疑似病例，且與其有共同暴露史的人被診斷為確診病例者。 確診病例：從呼吸道標本或血清中分離
30、到特定病毒；RT-PCR對上述標本檢測，有甲型H1N1病毒RNA存在，經(jīng)過測序證實，或兩次血清抗體滴度4倍升高，可確診為人感染甲型H1N1流感。,四 TORCH感染特點與檢測,TOX : Toxoplasma gondii RV: Rubella virus CMV: Human cytomegalovirus HSV: Herpes simplex virus,TORCH,TORCH感染特點,1. 母-胎傳播的主要病原體 2. 引起胎兒畸形新生兒缺陷的重要原因 3. 自然狀態(tài)下呈隱性感染 4. 懷孕、多次輸血、AIDS等易發(fā)生顯性感染 5. 可致多發(fā)性、全身性感染 6. 只有風疹可獲得長久的
31、免疫力，可用疫苗預防,TORCH,(一) 弓形蟲感染與致病,滋養(yǎng)體如弓形 ，廣泛分布，人獸共患。 寄生在有核細胞中，貓和貓科動物是終宿主 易感者多，免疫者少 我國智力低下兒的弓形蟲感染率28 畸形兒的弓形蟲抗體IgM陽性率12.25 艾滋病患者約有2080合并弓形蟲感染 ，造成艾滋病死亡的一個重要并發(fā)病,TORCH TOX,人群自然感染率達到60-90%，多為隱性感染 免疫功能低下(懷孕、多次輸血、器官移植、AIDS)發(fā)生顯性感染 可發(fā)生垂直傳播，是宮內(nèi)感染和胎兒畸形的主要病毒之一 圍生期感染 血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可檢出病毒,(二) 人巨細胞病毒感染與致病,TORCH-CMV,風疹是
32、一種世界性的病毒傳染病， 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一 出疹前1周至出疹后5天均有傳染性 人是風疹病毒的唯一宿主 風疹感染后可獲得持久的免疫力，臨床顯性再感染并不多見。,(三) 人風疹病毒感染與致病,TORCH-RV,先天性風疹感染往往發(fā)生在母體初次感染之時，可致先天性風疹綜合癥(CRS) 三聯(lián)癥：白內(nèi)障、耳聾、心臟病。 妊娠時體內(nèi)皮質類固醇激素的增加以及細胞免疫功能的減弱，這種對正常人無害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影響胎兒。,TORCH-RV,(三) 人風疹病毒感染與致病,HSV原發(fā)感染多為隱性，大多無臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn) HSV-1主要引起口唇皰疹，皰疹性結膜炎、腦炎，皮膚性皰疹
33、 HSV-2主要引起原發(fā)性生殖器皰疹 (80%) 。 HSV感染后大多數(shù)個體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復發(fā)，病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內(nèi)。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感染與致病,妊娠期婦女因HSV-1被激活，可通過胎盤感染胎兒，引起胎兒畸形、智力低下、流產(chǎn)等。 圍產(chǎn)期感染可引發(fā)新生兒皰疹，死亡率高達50%以上。 HSV常與HIV-1同時感染，并能促進病情發(fā)展，引起嚴重的局部和播散性感染。目前認為HSV是一種調節(jié)因素，能激活HIV復制 與宮頸癌關系密切。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感染與致病,常規(guī)TORCH檢測方法與不足,組織培養(yǎng)或病原體分離：慢，費力，陽性率
34、低。 血清學診斷： IgG： 人群自然感染率高達60-90%。 IgG()不能區(qū)別既住感染與現(xiàn)癥感染； 新生兒IgG()不能說明有感染。 IgM： IgM()可能是原發(fā)性感染； IgM()不能排除感染。,TORCH,局限性： 1. 不能定量分析 2. 抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響 3. 交叉反應，假陽性,熒光探針檢測TORCH的優(yōu)勢,原理：直接檢測TORCH病原體的核酸 優(yōu)點：靈敏、快速，特異 意義：早期診斷，婦幼保健、優(yōu)生優(yōu)育 1. 篩選TORCH患者，提高出生人口素質。 2. 有利于預測胎兒宮內(nèi)感染狀況及妊娠結局。 3. TORCH感染孕婦的治療效果觀察。 4. 器官移植、免疫系統(tǒng)疾病等病人
35、監(jiān)控。 5. 建立TORCH的分子診斷標準,TORCH,TORCH,TORCH檢測核酸與檢測標本的比較,檢驗報告單結果讀取,3.637E+06 檢測下限: 1000拷貝/毫升 3.637106 1.000E+03 copy/ml,如果是標本量是可以定量的，如血液、腦脊液等，則檢測結果報告為：copy/ml 如果是標本量不能定量，如分泌物等，則結果只能報告為：copy,1.親子鑒定 2.法醫(yī)物證 3.PCR-RFLP技術的法醫(yī)學應用 4.罪犯鑒定,法醫(yī)鑒定,免疫學診斷主要是抗原抗體反應，應用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學檢測存在較長的“窗口期”，不利于對疾病的早期診斷；PCR
36、方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。,疾病的早期診斷,1 乙型肝炎病毒（HBV）; 2. 丙型肝炎病毒（HCV） 3 淋球菌(NGH); 4 人類免疫缺陷病毒（HIV） 5 解脲脲原體(UU) 6 肺炎支原體(MP) 7 單純皰疹II型 8 人巨細胞病毒（HCMV） 9 人乳頭瘤病毒（HPV）6、11 10 高危型人乳頭瘤病毒（HPV 8個型） 11 沙眼衣原體(CT) 12 a-地中海貧血 13 結核分支桿菌(TB) 14 新型冠狀病毒(SARS),已獲證書,熒光定量PCR技術中國專利 國家重點新產(chǎn)品 多種熒光PCR試劑盒新藥證書 多項國家、省部級等科技進步獎 三十余項國家、省部級重點科研項目 業(yè)務遍布全國1026家醫(yī)療衛(wèi)生單位,達安烙印,
熒光定量PCR技術在臨床檢測中的應用.ppt
