甘肅省武威市高中生物 第5章 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 5.2 多聚酶鏈式反應(yīng)課件 新人教版選修1 .ppt

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1、多聚酶鏈式反應(yīng)PCR,一、實驗原理:,PCR又稱多聚酶鏈式反應(yīng),是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法,主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成:即在高溫下,待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板;而后在低溫情況下,兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結(jié)合,形成部分雙鏈;在Taq酶的最適溫度(72)下,以引物3端為合成的起點,以單核苷酸為原料,Mg2+存在下,沿模板以53方向延伸,合成DNA新鏈。這樣,每一雙鏈的DNA模板,經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進行,每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板

2、,每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍,PCR產(chǎn)物得以指數(shù)形式迅速擴增,經(jīng)過2530個循環(huán)后,理論上可使基因擴增數(shù)百萬倍。,DNA模板:反應(yīng)中DNA量在50ng200ng左右。且DNA純度較高,以增加反應(yīng)特異性。dNTP:反應(yīng)體系中達100M200M。Mg2+:Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右,濃度太低Taq酶活力降低;太高反應(yīng)特異性降低。引物:根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計。引物約20堿基左右;G+C含量在4070之間;引物內(nèi)部不能有回該序列;引物端不能互補。Taq酶:它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶,在95時30分鐘還有50活力。,說明,PCR過程示意

3、圖,二、實驗所需器材和試劑器材:臺式高速離心機,恒溫水浴鍋,PCR擴增儀,瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng),凝膠成像系統(tǒng),Eppendorf離心管,PCR小管,試劑:引物1,引物2,dNTPmix,10XPCRBuffer,TaqDNA聚合酶,EB,上樣緩沖液,marker,瓊脂糖,TBE緩沖液,三、實驗步驟,1:加樣按次序在PCR小管中加入下列試劑(50ul體系):5ul10XPCRBuffer4uldNTPmix2ul引物12ul引物23ul模板1ulTaqDNApolymerase加水到總體積50ul,注意事項:同時設(shè)立對照組(對照組不加模板DNA),2、按以下參數(shù)進行PCR擴增(對于不同的PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)置不同的反應(yīng)條件)944分鐘9430秒5130秒進行30個循環(huán)7230秒725分鐘4,,將實驗組與對照組放入PCR儀,按設(shè)定好的條件進行擴增,3、擴增結(jié)束后,取5ul產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以觀察結(jié)果,PCR結(jié)果示意圖,四、作業(yè),1,圖示實驗結(jié)果2,掌握PCR原理、學(xué)會分析實驗結(jié)果,

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