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1、第3節(jié)聚合酶鏈式反應技術,1.記住PCR技術的原理。 2.簡述PCR技術的基本操作。 3.說出PCR技術的應用。,一,二,三,一、DNA片段的擴增 1.概念 PCR技術是體外酶促合成特定DNA片段的一種方法。 2.擴增條件 按照DNA復制所需條件,在體外酶促合成DNA時,必須具備待擴增的目的DNA(DNA合成的模板)、合成DNA時所需的特異引物和原料4種三磷酸脫氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、起酶促作用的耐熱Taq DNA聚合酶和作為反應介質(zhì)的緩沖溶液。,四,,,,,,,,,一,二,三,3.原理 根據(jù)DNA的理化特性,在高溫條件下,雙鏈DNA解旋變?yōu)閱捂淒NA(變性);低溫
2、條件下單鏈DNA又可恢復為雙鏈DNA(復性);中溫條件下能進行DNA合成,使DNA鏈延伸。由此,PCR反應過程一般采取“高溫變性低溫復性中溫延伸”三個步驟,促使DNA進行復制。以上述反應作為一個周期,循環(huán)進行,使目的DNA得以迅速擴增,得到大量的目的DNA片段。,四,,,,,,,,,,,一,二,三,四,二、瓊脂糖凝膠電泳檢測 瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便的快速分離、純化和鑒定DNA的方法。瓊脂糖凝膠具有大小一致的剛性濾孔,帶有大量負電荷的DNA分子在外加電場的作用下可以通過這些濾孔向正極泳動。DNA片段在凝膠中的泳動速率主要取決于其分子的大小,因此 大小一致的DNA分子會在凝膠的一定位置形
3、成DNA條帶。,,,,,,一,二,三,四,三、DNA片段的擴增和瓊脂糖凝膠電泳的方法步驟 1.DNA片段的PCR擴增 (1)把PCR反應體系的各種藥品加入冰浴的EP管中,混合均勻后 低速離心。每管加入30 L無菌石蠟油。 (2)將EP管放入PCR熱循環(huán)儀中,輸入并運行反應程序。 2.擴增產(chǎn)物的檢測 制作電泳膠板加樣電泳觀察。,,,,一,二,三,四,四、PCR影響因素 在PCR實驗中,需要擴增的DNA片段的大小決定延伸的時間,片段較大,中溫延伸的時間就要相應延長;引物的堿基數(shù)量和組成則決定著復性溫度的選擇,如果引物越短,A、T含量越多,PCR反應的復性溫度就越低,反之引物長度較長,G、C含量較
4、高,則需要設計較高的復性溫度。Taq DNA聚合酶在PCR擴增過程中也存在大約為110-5的出錯概率,而且隨著循環(huán)數(shù)的增加,其活性也逐漸降低。因此,PCR擴增循環(huán)次數(shù)并非越多越好,一般控制在2535個循環(huán)。,,,,,,,,一,二,三,四,思考： 2014年埃博拉疫情在非洲蔓延,隨后生物科學研究工作者迅速研制出了埃博拉病毒檢測試劑盒,使得能夠快速診斷出埃博拉患者。那么,埃博拉病毒檢測試劑盒所需的大量埃博拉病毒基因是怎樣獲得的呢? 提示:采用PCR技術對埃博拉病毒的基因迅速擴增產(chǎn)生的。,1.PCR技術與DNA的復制 PCR反應通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。PCR反應的實質(zhì)就是DNA復制,
5、所以PCR反應與DNA復制的原理相同,計算方法也大體相同。例如:PCR反應中的目的片段一般以2n的方式積累,其中n為反應循環(huán)次數(shù)。一個DNA片段在30次循環(huán)后反應物中大約有10億個這樣的片段。,2.PCR的常見問題 PCR實驗很容易出現(xiàn)假陽性(檢測出非目的片段的擴增,而未檢測出目的片段的擴增)或假陰性(未檢測出任何片段的擴增)的結果。 PCR技術高度靈敏,極其微量的靶基因污染都會造成非目標DNA片段的大量擴增,因此模板DNA的污染是PCR出現(xiàn)假陽性結果的主要原因。此外,樣品中存在靶基因的類似序列也可能造成假陽性結果。為了避免因污染而造成的假陽性結果,PCR操作時要注意做到隔離操作區(qū),分裝試劑,
6、簡化操作程序,使用一次性吸頭等。,出現(xiàn)假陰性結果的常見原因有Taq DNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制;引物設計不合理;提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關、PCR系統(tǒng)的建立欠妥當及循環(huán)次數(shù)不夠,等等。當實驗中出現(xiàn)假陰性的情況時,應首先在原來擴增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶,并增加510次循環(huán)。為了防止假陰性結果的出現(xiàn),在選用Taq DNA聚合酶時,要注意用活力高、質(zhì)量好的酶。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度的要求不高,但也不允許有機試劑的污染。所以,在提取DNA模板時,應特別注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物。PCR擴增的先決條件以及特異性的高低,很大程度上取決于引物與靶DNA的互補情況
7、,尤其需要保證引物的3端與靶基因互補。,PCR的原理及應用 【例題1】 下列有關PCR的描述,不正確的是() A.是體外酶促合成特定DNA片段的一種技術 B.引物一般采用人工合成的單鏈DNA片段 C.PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加 D.擴增對象是氨基酸序列 解析:PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術,它能以極少量的DNA為模板,以四種三磷酸脫氧核苷酸為原料,在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3端連接脫氧核苷酸,短時間迅速復制上百萬倍的DNA片段,其擴增產(chǎn)物以指數(shù)方式增加。 答案:D,題型一,題型二,【例題2】 標準的PCR過程一般分為變性、復性、延伸三大步,這三大步需要的溫度依次是() A.9
8、4 、40 、72 B.72 、40 、94 C.40 、94 、72 D.80 、40 、72 解析:當溫度上升到9498 時,雙鏈DNA變性成單鏈,稱之為變性;當溫度迅速下降到4060 時,引物通過堿基互補配對與單鏈DNA結合;當溫度上升到72 左右時,溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈,稱為延伸。 答案:A,題型一,題型二,題型一,題型二,解析:從土壤中分離微生物的一般流程是土壤取樣制備培養(yǎng)基分裝制備土壤稀釋液接種培養(yǎng)觀察。該實驗步驟沒有問題,但在前五步操作中都沒有進行無菌操作,因而無法說明分解纖維素的微生物一定來
9、自于土壤。 答案:(1)取樣工具應提前滅菌;不能用蒸餾水,應用無菌水;該操作應在火焰旁進行。 (3)培養(yǎng)基分裝并加濾紙條后應滅菌。 (4)在稀釋土壤溶液的過程中,每一步都要在火焰旁。 (5)接種應在無菌條件下進行。,題型一,題型二,PCR基本操作與產(chǎn)物測定 【例題3】 在PCR實驗操作中,下列說法不正確的是 () A.在擴增產(chǎn)物的檢測中需配制質(zhì)量分數(shù)為10%的瓊脂糖凝膠,制成電泳膠板 B.離心管的蓋子一定要蓋嚴,防止液體外溢 C.在檢測時,需將膠板浸入溴化乙錠溶液染色510 min D.離心的目的是使反應液集中在離心管底部,提高反應效果 解析:在擴增產(chǎn)物的檢測中,需配制質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝
10、膠,制作成電泳膠板。 答案:A,1,2,3,4,1.有關PCR技術,下列敘述不正確的是() A.用于PCR的引物長度通常為2030個核苷酸 B.在用PCR技術擴增DNA時,DNA的復制過程與細胞內(nèi)DNA的復制類似 C. PCR反應只需一定的緩沖溶液和DNA模板以及四種三磷酸脫氧核苷酸 D. PCR一般經(jīng)歷2530個循環(huán),每個循環(huán)分為變性、復性、延伸 答案:C 解析:PCR反應中需要的條件有模板(DNA分子)、原料(4種三磷酸脫氧核苷酸)、酶(耐高溫DNA聚合酶)、引物和一定的緩沖液等。,5,6,1,2,3,4,2.引物的作用是() A.打開DNA雙鏈 B.催化合成DNA子鏈 C.使DNA聚合酶
11、能夠從引物的3端開始復制DNA D.提供模板 答案:C 解析:DNA分子的復制具有方向性,即只能從引物的3端開始,從子鏈的5端向3端延伸。引物的作用是與DNA聚合酶結合促使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始復制DNA。,5,6,1,2,3,4,3.使用PCR儀進行DNA擴增的具體實驗操作順序應為 () 設計好PCR儀的循環(huán)程序按配方準備好各組分用微量移液器在離心管中依次加入各組分進行PCR反應離心使反應液集中在離心管底部 A. B. C. D. 答案:C 解析:使用PCR儀進行DNA擴增前,首先按照PCR體系配方,依次將各組分加入離心管離心,使反應液集中于試管底部,然后再設計好PCR儀的循環(huán)程序
12、進行PCR反應。,5,6,1,2,3,4,4.利用PCR技術擴增目的基因的過程中,需加入() A.耐高溫的解旋酶以保證DNA雙鏈完全解開 B.2種已知核苷酸序列的引物以保證核苷酸鏈的延伸 C.4種足量的核糖核苷酸以保證目的基因的擴增 D.一定量的鹽酸和氫氧化鈉溶液以維持pH的穩(wěn)定 答案:B 解析:在PCR過程中,解旋是通過加熱到94 實現(xiàn)的,不需要加入解旋酶。PCR過程中以解開的DNA的兩條鏈為模板,因此需要2種已知序列的引物分別與兩條模板鏈結合(注意由于DNA分子的兩條鏈是反向的,2種引物會分別在DNA的兩端與互補的模板鏈結合)。PCR反應的原料是4種三磷酸脫氧核苷酸。反應溶液體系的pH依靠
13、磷酸緩沖液維持穩(wěn)定。,5,6,1,2,3,4,5,6,5.要使PCR反應在體外條件下順利地進行,需要嚴格地控制() A.氧氣的濃度 B.酸堿度 C.溫度 D.大氣的濕度 答案:C,1,2,3,4,5,6,6.生物技術的迅速發(fā)展,給社會帶來了較大的經(jīng)濟效益,受到社會廣泛重視。請回答下列生物技術方面的問題。 (1)Taq耐熱菌的發(fā)現(xiàn)和分離為基因工程的發(fā)展作出了突出貢獻。從培養(yǎng)液或自然環(huán)境分離Taq耐熱菌需要在條件下培養(yǎng);從Taq耐熱菌中分離的酶是PCR技術的關鍵酶。 (2)1993年,美國科學家Mullis因發(fā)明了PCR技術而獲得了諾貝爾化學獎。PCR過程中必需的條件包括DNA聚合酶、模板DNA、能量、4種游離的三磷酸脫氧核苷酸、緩沖溶液和;在生物體內(nèi)復制必需,而在PCR技術中不需要的成分是。 答案:(1)高溫熱穩(wěn)定DNA聚合 (2)引物解旋酶,
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