《《細(xì)胞的換液與傳代》PPT課件.ppt》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《《細(xì)胞的換液與傳代》PPT課件.ppt（28頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。
1、,細(xì)胞系與細(xì)胞克隆,,教學(xué)目的：,1、掌握傳代培養(yǎng)的概念和方法 2、了解細(xì)胞系的建立過程 3、掌握克隆細(xì)胞的幾種方法,細(xì)胞系cell line：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代后即成。 有限細(xì)胞系finite cell line: 不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限。 連續(xù)細(xì)胞系continuous cell line：可連續(xù)傳代的細(xì)胞系，即已建成的細(xì)胞系。 細(xì)胞株cell strain：通過選擇法和克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)和標(biāo)志的培養(yǎng)物。,有關(guān)概念,一、傳代培養(yǎng)（passage）,概念：無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶。,（一）傳代培養(yǎng)的方法 1、從生長(zhǎng)器皿上解離
2、細(xì)胞的方法： 1）震蕩法。 2）胰蛋白酶消化法 3）胰蛋白酶-檸檬酸鹽 4）用EDTA洗細(xì)胞再用胰蛋白酶-檸檬酸鹽處理 5） EDTA洗再用胰蛋白酶-EDTA消化 6） EDTA洗再用胰蛋白酶-膠原酶配合檸檬酸鹽或 EDTA消化 7）機(jī)械刮削法（scraping） 8）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1-1.0 1mg/ml),2.單層培養(yǎng)細(xì)胞的一般傳代步驟:,倒出舊液,,PBS洗滌,,胰蛋白酶消化,吸出消化液,,,加入培養(yǎng)液,,吹散細(xì)胞,,計(jì)數(shù),,稀釋,,培養(yǎng),離心法：離心后去上清，加培養(yǎng)液，吹 打，傳代。 直接傳代法：將細(xì)胞慢慢沉淀，將上清吸去1/2-2/3，加培養(yǎng)基，
3、傳代。,3、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng),(二) 傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng),1、傳代時(shí)機(jī)與傳代培養(yǎng)的細(xì)胞密度：細(xì)胞沒生長(zhǎng)到足以覆蓋的瓶底壁的大部分表面前，不要急于傳代。 2、傳代數(shù)或代數(shù)：指對(duì)培養(yǎng)物傳代的次數(shù)。 3、盡量少傳代，避免轉(zhuǎn)化。,二、細(xì)胞系的建立,正常細(xì)胞系建立的程序包括： 原代培養(yǎng) 第一次傳代 常規(guī)傳代和凍存、 復(fù)蘇等階段。,,,,細(xì)胞系的維持,細(xì)胞系檔案要記錄好：組織來源、培養(yǎng)基要求、傳代時(shí)間等； 傳代換液有規(guī)律，否則會(huì)引起生物學(xué)特性改變； 多種細(xì)胞維持傳代，要防止交叉污染； 要有充足的凍存儲(chǔ)備，防止因污染造成絕種；另外，細(xì)胞暫時(shí)不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。,1、證明細(xì)胞系的種
4、系。染色體分析、同工酶分析、DNA指紋技術(shù)。 2、明確細(xì)胞系的組織來源 細(xì)胞抗原標(biāo)記的方法 3、細(xì)胞是否是正常細(xì)胞，有無發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞二倍體特征，惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞為異倍體。 4 、 細(xì)胞有無交叉污染 。同工酶方法是快速有效的，每一個(gè)細(xì)胞系在瓊脂糖電泳上有特異的同工酶帶型。DNA指紋技術(shù)也可以鑒定。,鑒定細(xì)胞系的內(nèi)容：,三 、細(xì)胞克隆,細(xì)胞克?。╟lone）是指單個(gè)細(xì)胞通過有絲分裂形成的細(xì)胞群體，他們的遺傳特性相同。 細(xì)胞克隆化培養(yǎng)（cell cloning culture）：又稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)，是指將單個(gè)細(xì)胞在一定支持物上增殖培養(yǎng)而產(chǎn)生細(xì)胞群落的過程。,（一）克隆培養(yǎng)技術(shù),稀釋鋪板法 飼養(yǎng)
5、層克隆法 膠原膜板 瓊脂克隆法等,,分類：,1.稀釋鋪板法：最常用 消化低密度細(xì)胞懸液制備接種標(biāo)記與培養(yǎng)分離擴(kuò)大培養(yǎng)觀察移植瓶或皿內(nèi)培養(yǎng),稀釋鋪板法圖解,,注意事項(xiàng)： 1）確保一個(gè)細(xì)胞 2）輪廓清晰完整，體積適宜健康 3）不需換液,2、飼養(yǎng)層克隆法 飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell）：也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過射線或絲裂霉素C處理過的供其它細(xì)胞附著的細(xì)胞層。成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。 注意：3周內(nèi)飼養(yǎng)細(xì)胞即死亡，要及時(shí)應(yīng)用,飼養(yǎng)層克隆圖解,3、膠原膜板或血纖維蛋白膜板克隆法： 1）膠原膜板或血纖維蛋白膜板的制備 2）消化、稀釋、接種和培養(yǎng)待克隆細(xì)胞 血纖維蛋白膜板制備 A液：0.2g凝
6、血酶,100ml培養(yǎng)液 B液:250mg 牛血纖維蛋白原、800mg NaCl、25mg 檸檬酸鈉、1000毫升雙蒸水 A：B=4：1,4、瓊脂克隆法： 用于病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞、惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 2%瓊脂母液--45水浴--混合成0.33%瓊脂培養(yǎng)液加入試管內(nèi) 2.5ml-- 45水浴,,瓊脂克隆法圖解,5、在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆化 2%瓊脂母液--45水?。ō傊敢汉?倍濃度培養(yǎng)液）--1：1混合-- 45水浴鋪板細(xì)胞懸液內(nèi)加等體積的1.5%甲基纖維素混合后鋪于瓊脂層上培養(yǎng),,在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆化圖解,（二）影響克隆形成率的因素,克隆形成率 (cloning efficiency
7、)是指向底物接種單細(xì)胞懸液能形成細(xì)胞小群的百分?jǐn)?shù),影響因素： 1、細(xì)胞密度。10個(gè)/ml 2、培養(yǎng)液。HamF12k 3、血清 4、飼養(yǎng)細(xì)胞 5、激素和生長(zhǎng)因子：胰島素，地塞米松，EGF，BFGF。 6、CO27、適應(yīng)性生長(zhǎng)基質(zhì)：膠原層，血漿纖維蛋白層，多聚右旋賴氨酸，纖維連接蛋白，瓊脂,（三）克隆的分離,,克隆化環(huán)分離法,,2、射線照射分離克隆法 將培養(yǎng)瓶倒置放于X射線或 鈷60源下，用2mm厚的鉛片蓋住選中的克隆。 3、懸浮細(xì)胞克隆分離 24孔板加入1ml培養(yǎng)液用毛細(xì)吸管吸取群落吹入培養(yǎng)板內(nèi),1、概念：細(xì)胞系，細(xì)胞株，傳代培養(yǎng)，細(xì)胞克隆，克隆形成率 2、鑒定細(xì)胞系應(yīng)包含的內(nèi)容 3、常見的克隆培養(yǎng)技術(shù)有哪幾種，簡(jiǎn)要敘述其技術(shù)要點(diǎn) 4、影響克隆形成率的因素 5、克隆分離的方法和技術(shù)要點(diǎn),作業(yè),,,謝謝大家！,
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