活性氧脅迫促進(jìn)枯草芽孢桿菌WSHDZ01過量合成過氧化氫酶

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1、活性氧脅迫促進(jìn)枯草芽孢桿菌WSHDZ-01 過量合成過氧化氫酶,生物工程學(xué)報(bào) 2009, May 25; 25(5): 786-792 姚丹丹, 劉立明, 李江華, 華兆哲, 堵國成, 陳堅(jiān),OUTLINE,摘要 簡介 研究材料與方法 結(jié)果與討論 結(jié)論,摘 要: 研究了乙醇和H2O2 脅迫對芽孢桿菌(Bacillus sp.) WSHDZ-01 過量合成過氧化氫酶(Catalase, 簡稱CAT)的影響。在Bacillus sp.WSHDZ-01 培養(yǎng)體系中添加2.0%(V/V)乙醇, 胞內(nèi)過氧化氫酶酶活達(dá)到11151U/mL, 是對照組的2.5倍。而在培養(yǎng)體系中添加0.3%(V/V)H2O2

2、, 則使胞內(nèi)過氧化氫酶不斷分泌到胞外,胞外酶占總酶活比率增加至27%?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn),分別以不添加脅迫物(a)、乙醇脅迫(b)、H2O2 脅迫(c)為對照,在培養(yǎng)體系中維持持續(xù)的乙醇和H2O2 脅迫,結(jié)果表明:1)胞外酶比例達(dá)82.5%;2)發(fā)酵周期縮短為42 h,比對照a延長了6 h,比對照b和c分別縮短了8h和6h;3)生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到470 U/(mLh), 比對照a提高了18.6%,為過氧化氫酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。,過氧化氫酶簡介,過氧化氫酶(Catalase, 簡稱CAT)通過催化H2O2分解為H2O 與O2 而作為一種酶類清除劑廣泛應(yīng)用于紡織、食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè), 具有反應(yīng)條件溫和

3、、催化效率高等優(yōu)點(diǎn)。前期研究中通過營養(yǎng)和環(huán)境條件優(yōu)化, 顯著提高了Bacillus sp. WSHDZ-01發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的酶活, 但難以進(jìn)一步提高酶活。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的核心原因在于沒有深入理解生物體系過量積累過氧化氫酶的機(jī)理。過氧化氫酶在生物體內(nèi)以鐵卟啉為輔基, 催化H2O2 分解而清除體內(nèi)的H2O2, 使細(xì)胞免受活性氧的毒害, 是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一?；诖? 作者考慮: 能否將細(xì)胞置于活性氧脅迫的非正常生長環(huán)境下, 促使微生物細(xì)胞為了抵御這一脅迫而不斷過量合成過氧化氫酶？常見的思路是在培養(yǎng)體系中添加乙醇和H2O2 。Bacillus sp.WSHDZ-01 能利用乙醇為唯一碳源微弱

4、生長, 并進(jìn)而在體內(nèi)生成活性氧3(圖1),基于這一思路, 作者研究了乙醇(內(nèi)源)和H2O2 脅迫(外源)對Bacillus sp. WSHDZ-01 過量合成胞內(nèi)和胞外酶的影響, 并證實(shí)了同時(shí)采用內(nèi)外源氧化脅迫的策略能有效地促進(jìn)過氧化氫酶生產(chǎn)。,研究材料與方法,結(jié)果與討論,當(dāng)乙醇濃度為2.0% (V/V),與未添加的對照組比較, 過氧化氫酶總酶和胞內(nèi)酶活分別提高了126%和150%. Bacillus sp.WSHDZ-01 能利用乙醇為唯一碳源微弱生長。然而, 圖2 表明, 細(xì)胞濃度隨著乙醇濃度的增加而逐漸降低, 當(dāng)乙醇濃度為1.0%和2.0%時(shí), 細(xì)胞濃度分別下降13%和16.2%。這表明

5、乙醇的添加對菌體生長有一定 抑制作用。,1.乙醇促進(jìn)胞內(nèi)過氧化氫酶合成,進(jìn)一步分析添加2.0%乙醇后每隔20 min 胞內(nèi)酶活和總酶活的變化情況(圖3)發(fā)現(xiàn), 隨著乙醇脅迫時(shí)間延長, 胞內(nèi)酶活占總酶活的比例不斷增加。乙醇促進(jìn)Bacillus sp.WSHDZ-01 過量合成過氧化氫酶的可能機(jī)制在于:1) 作為碳源促進(jìn)細(xì)胞生長; 2) 在細(xì)胞內(nèi)生成大量活性氧, 迫使細(xì)胞過量合成過氧化氫酶以清除活性氧所引起的毒性。,1.乙醇促進(jìn)胞內(nèi)過氧化氫酶合成,2 乙醇持續(xù)脅迫加強(qiáng)CAT 的合成,圖4 乙醇消耗速率(A)與添加時(shí)間(B)對過氧化氫酶發(fā)酵的影響,圖4B), 發(fā)現(xiàn)與對照組(未添加) 比較, 過氧化氫

6、酶總酶活分別提高了54%、37%和16%;這一結(jié)果表明, 持續(xù)的乙醇脅迫能更有效地提高過氧化氫酶的合成效率?；诙啻畏峙砑右掖寄苊黠@提高CAT 產(chǎn)量以及不同階段乙醇的消耗速率(圖4A),作者分階段恒速流加乙醇以使Bacillus sp.WSHDZ-01 處于持續(xù)活性氧脅迫下, 結(jié)果如圖5A、5B 所示, 過氧化氫酶總 酶活(28 990 U/mL)和胞內(nèi)酶活(9691 U/mL)均達(dá)到最大值。,2. H2O2 促進(jìn)胞外過氧化氫酶合成,考慮到微生物細(xì)胞合成CAT 的生理機(jī)制是抵御活性氧的傷害, 為了進(jìn)一步促進(jìn)CAT 的生成,將對數(shù)生長后期(12 h)的Bacillus sp.WSHDZ-01

7、細(xì)胞置于不同濃度H2O2(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%(V/V))脅迫下, 以研究培養(yǎng)體系中H2O2 脅迫對細(xì)胞生長和過氧化氫酶合成的影響, 結(jié)果如圖6 所示。,由上圖可知過氧化氫酶酶活和單位細(xì)胞產(chǎn)酶的能力均隨著H2O2 脅迫濃度(00.3%, V/V)的增加而不斷提高,而細(xì)胞濃度則呈下降趨勢(圖6A)。添加0.3%(V/V)H2O2使總酶活提高到9254 U/mL (圖6A), 較對照組(未添加H2O2)提高了43.5%。繼續(xù)增加H2O2 濃度則導(dǎo)致總酶活不斷下降。另一方面,H2O2 脅迫起始時(shí)間同樣影響細(xì)胞合成過氧化氫酶的能力(圖6B):1)0h H2O2 脅迫明顯抑制

8、細(xì)胞生長和產(chǎn)酶能力(數(shù)據(jù)未列出);2)對數(shù)生長后期(12 h)后, 隨著H2O2 脅迫時(shí)間的延遲, 過氧化氫酶總酶活逐漸下降;3) H2O2 脅迫的最佳時(shí)間為12 h; 4)與乙醇類似, 持續(xù)低劑量的H2O2 脅迫能有效地提高過氧化氫酶酶活。,如前所述, H2O2 脅迫顯著提高過氧化氫酶酶活,其可能機(jī)理在于添加過氧化氫是否促進(jìn)了過氧化氫酶向胞外分泌的能力呢？為此, 作者分析了添加H2O2 2080 min 后胞內(nèi)外過氧化氫酶酶活的變化,如圖7 所示。與乙醇脅迫比較, 添加過氧化氫后胞內(nèi)過氧化氫酶的積累與對照組相比沒有明顯提高(圖7A), 而胞外酶活則明顯地提高, 且隨著脅迫時(shí)間的延長而不斷增加

9、(圖7B), H2O2 脅迫80 min 后,胞外酶活達(dá)到2500 U/mL, 比20、40、60 min 分別提高了92%、25%和8.7%。這一結(jié)果表明, 在H2O2脅迫下, Bacillus sp.WSHDZ-01 在胞內(nèi)合成大量過氧化氫酶并能有效的將其分泌到胞外, 從而促進(jìn)了過氧化氫酶總酶活的提高。,2.4 內(nèi)外源脅迫促進(jìn)過氧化氫酶積累,基于持續(xù)乙醇脅迫促使Bacillus sp.WSHDZ-01在胞內(nèi)過量合成過氧化氫酶, 而連續(xù)H2O2 脅迫則使胞內(nèi)過氧化氫酶快速高效地分泌到胞外。那么能否在促使細(xì)胞大量合成胞內(nèi)過氧化氫酶的同時(shí)采用H2O2 脅迫促使酶分泌到胞外, 從而實(shí)現(xiàn)過氧化氫酶的

10、高效生產(chǎn)？以不添加乙醇和H2O2(a); 乙醇脅迫(b); H2O2 脅迫(c) 為對照, 研究了Bacillus sp.WSHDZ-01 在持續(xù)乙醇和H2O2 脅迫下過量合成過氧化氫酶(3 L 發(fā)酵罐)的過程, 結(jié)果如下圖8 所示。發(fā)現(xiàn)混合添加脅迫物時(shí):,1)發(fā)酵10 h 后胞內(nèi)酶活迅速提高, 在28 h 達(dá)到最大值11 000 U/mL,而在H2O2 的脅迫下胞內(nèi)酶活雖達(dá)10 480 U/mL,但發(fā)酵周期延長了20 h,生產(chǎn)強(qiáng)度大幅降低;2)促使胞內(nèi)過氧化氫酶高效分泌到胞外, 胞外酶占總酶活比例達(dá)到82.5%, 比對照a、b、c分別提高了59%、16.5%、31%。乙醇連續(xù)脅迫下胞外酶活占

11、總酶活的比例最低, 胞外酶活達(dá)到最高值的時(shí)間延長至50 h;3)發(fā)酵進(jìn)行到34 h 時(shí)過氧化氫酶開始快速向胞外分泌, 44 h 時(shí)胞外酶活占總酶活的80%;4)發(fā)酵周期為42 h, 比對照a 延長了6 h,比對照b 和c 分別縮短了8h和6h;5)過氧化氫酶生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到470 U/(mLh), 比不添加脅迫物的情況提高了18.6%。,結(jié)論,采用活性氧脅迫Bacillus sp. WSHDZ-01 過量合成過氧化氫酶發(fā)現(xiàn), 在培養(yǎng)體系添加2.0%(V/V)乙醇能有效地促進(jìn)胞內(nèi)過氧化氫酶的合成, 而添加0.3%(V/V) H2O2 則使過氧化氫酶向胞外分泌。Bacillus sp. WSHDZ-01 在同時(shí)受乙醇和H2O2持續(xù)脅迫時(shí), 胞外酶比例(82.5%)和生產(chǎn)強(qiáng)度470 U/(mLh)均達(dá)到最大, 發(fā)酵周期縮短為42 h。實(shí)現(xiàn)了過氧化氫酶的高酶活(28 990 U/mL) 和高生產(chǎn)強(qiáng)度470 U/(mLh)的統(tǒng)一, 為過氧化氫酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。,THANK YOU!,