海洋酸化對脊尾白蝦抗氧化酶活性研究

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1、海洋酸化對脊尾白蝦抗氧化酶活性研究 海洋酸化對脊尾白蝦抗氧化酶活性研究 2019/01/28 摘要：采用高純度ＣＯ２和空氣的混合氣體調(diào)配試驗所需酸化海水，研究不同海水酸化條件脅迫對脊尾白蝦超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、過氧化氫酶（ＣＡＴ）、谷胱甘肽過氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）活性和丙二醛（ＭＤＡ）濃度的影響．結(jié)果表明，１０００μＬ／ＬＣＯ２酸化組ＳＯＤ，ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，其中ＳＯＤ和ＣＡＴ活性分別在７ｄ和１４ｄ時受到顯著誘導（Ｐ＜０．０５）

2、，而ＧＳＨ－Ｐｘ活性在７ｄ和１４ｄ時顯著高于對照組（Ｐ＜０．０５）；１９００μＬ／Ｌ酸化組ＳＯＤ，ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性在暴露過程中受到不同程度的抑制，其中ＳＯＤ活性在１４ｄ和２８ｄ時均顯著低于對照組（Ｐ＜０．０５），ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性均在１４ｄ時受到顯著抑制（Ｐ＜０．０５）；１０００μＬ／Ｌ和１９００μＬ／ＬＣＯ２酸化組的ＭＤＡ濃度均呈現(xiàn)先增加后回落的趨勢，１０００μＬ／Ｌ組在１４ｄ時ＭＤＡ濃度顯著增加（Ｐ＜０．０５），而１９００μＬ／Ｌ組則在７ｄ和１４ｄ時ＭＤＡ濃度均顯著高于對照組（Ｐ＜０．０５）且在１４ｄ時達到最大值．由此可見，海洋酸化對脊尾白蝦的抗氧化酶活性具有明顯的刺激作用，

3、且在輕度酸化脅迫時抗氧化酶活性受到誘導，而在較高強度的酸化脅迫時其活性被抑制． 關鍵詞：海洋酸化；脊尾白蝦；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；谷胱甘肽過氧化物酶；丙二醛 引言 自工業(yè)革命以來，化石燃料燃燒等人類活動導致大氣中ＣＯ２從工業(yè)革命前的２８０μＬ／Ｌ增長至２０１３年的３９４μＬ／Ｌ，增長了約４０％［１］．據(jù)ＩＰＣＣ（聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會）預測，２１００年大氣中ＣＯ２將會達到１０００μＬ／Ｌ，表層海水ｐＨ將繼續(xù)下降０．３～０．４；至２３００年時有可能達到１９００μＬ／Ｌ，ｐＨ可能將再下降０．７～０．８［２－３］．多年來，人們認為海洋酸化

4、的進程是緩慢而不易察覺的，但調(diào)查結(jié)果大大超乎人們的預料．據(jù)調(diào)查，在海洋酸化的影響下，意大利那不勒斯附近海域的有孔蟲種類急劇減少，由２４種減少到６種［４］．美國Ｔａｔｏｏｓｈ島附近海域海水ｐＨ實際上升的平均速度也比預測的速度快１０倍以上［５］．由此可見，海洋酸化正以人們無法估計的速度加劇影響著海洋化學變化，對海洋生物的生存及海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡構(gòu)成嚴重的威脅．目前，對海洋酸化的研究主要集中在海洋酸化對無脊椎動物（腔腸動物、軟體動物、棘皮動物、節(jié)肢動物）及魚類的生長率、成活率、鈣化率、感官能力、繁殖能力等的影響方面［６－７］，特別是關于海洋酸化對海洋生物的受精、胚胎早期發(fā)育及幼體存活率影響開展了較多

5、的研究．研究表明，海洋酸化會導致許多無脊椎動物的早期胚胎和幼體發(fā)育遲緩，甚至產(chǎn)生致畸、致死效應．劉文廣等［８］的研究結(jié)果表明海洋酸化對馬氏珠母貝的受精率無顯著影響，但會導致其幼蟲發(fā)育受阻，存活率降低．在甲殼動物中也存在類似的現(xiàn)象，如海洋酸化處理帝王蟹（Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ）胚胎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有４％的眼變大和５％的卵黃變小，而且平均孵化周期延長３３％；酸化處理幼體時，其存活率下降［９］．但不同物種間甚至同一物種的不同發(fā)育階段對海洋酸化的響應也存在差異．如在同樣的較高ＣＯ２濃度條件下，梅氏長海膽（Ｅｃｈｉｎｏｍｅｔｒａｍａｔｈａｅｉ）和馬糞海膽（Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ

6、ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ）的受精率有所不同［１０］．由此可見，生長環(huán)境的差異和不同海洋生物自身機能、生活習性及發(fā)育特點等方面的不同使不同海洋生物產(chǎn)生了不同的酸堿調(diào)節(jié)能力，其機制也存在很大的差異．脊尾白蝦（Ｅｘｏｐａｌａｅｍｏｎｃａｒｉｎｉｃａｕｄａ）是我國沿海重要的經(jīng)濟蝦類之一，具有環(huán)境適應性廣、繁殖周期短、生長速度快等優(yōu)點，而且能在室內(nèi)通過控溫促使其繁育而不受季節(jié)的影響，可以在較短的時間內(nèi)獲得不同發(fā)育時期的試驗材料．因此，脊尾白蝦是一種理想的測試生物體，可用于監(jiān)測和評價海洋水體環(huán)境和質(zhì)量變化．本文研究脊尾白蝦在海水酸化暴露脅迫下，體內(nèi)超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、過氧化氫酶（ＣＡＴ）和谷胱甘肽過

7、氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）等酶活性的變化及其體內(nèi)丙二醛（ＭＤＡ）濃度的變化，評價ＳＯＤ，ＣＡＴ，ＧＳＨ－Ｐｘ和ＭＤＡ作為海水酸化暴露的生物標志物的適用性，為預測未來海洋酸化對海洋生物和生態(tài)系統(tǒng)的影響提供依據(jù)． １材料與方法 １．１試驗材料脊尾白蝦取自連云港忠玉水產(chǎn)養(yǎng)殖場，蝦體長（４．９７０．１４）ｃｍ，體質(zhì)量（２．７５０．１２）ｇ．試驗前選擇健康的脊尾白蝦放入室內(nèi)水族箱中馴養(yǎng)７ｄ以上，馴養(yǎng)期間，每日換水一次，并在自然死亡率低于２％的情況下選擇身體健康、大小基本一致的脊尾白蝦供試驗用． １．２海水酸化暴露試驗ＣＯ２體積分數(shù)分別設定為４００μＬ／Ｌ（對

8、照組）、１０００μＬ／Ｌ和１９００μＬ／Ｌ，對應的ｐＨ分別為８．１，７．７和７．４．采用“一種獲取不同二氧化碳濃度的裝置”（ＺＬ２０１７２０５７８６１７．０）將空氣與純ＣＯ２氣體混合得到相應ＣＯ２體積分數(shù)的混合氣體，通入到３０Ｌ養(yǎng)殖容器的過濾（０．４５μｍ微孔濾膜過濾）海水中，待海水酸化穩(wěn)定后用于試驗．將馴養(yǎng)后的１８０尾脊尾白蝦隨機分到９個養(yǎng)殖容器中，每個養(yǎng)殖容器內(nèi)放置２０尾，每個ＣＯ２體積分數(shù)組設置３個重復．在酸化海水暴露期間的１，３，７，１４和２８ｄ時分別?。澄参r，解剖后取肝胰腺置于離心管中，做好標記并在－２０℃冰箱中冷凍保存． １．３組織勻漿制備及酶活性測定將各個時期取樣

9、的肝胰腺在冰浴中與質(zhì)量分數(shù)０．８６％的生理鹽水（配方）用玻璃勻漿器制成質(zhì)量分數(shù)１０％的勻漿，４℃１００００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，取上清液用于總蛋白、ＳＯＤ活性、ＣＡＴ活性、ＧＳＨ－Ｐｘ活性及ＭＤＡ濃度測定．１．３．１總蛋白的測定采用南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍法總蛋白（ＴＰ）測試盒的操作步驟測定組織蛋白含量，用于計算ＳＯＤ，ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ酶活性及ＭＤＡ濃度．１．３．２ＳＯＤ，ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性的測定按南京建成生物工程研究所提供的ＳＯＤ測試盒（ＷＳＴ－１法）、ＣＡＴ測試盒（可見光法）和ＧＳＨ－Ｐｘ測試盒（比色法）的操作步驟測定該３種酶的活性．１．３．３ＭＤＡ濃度的測定按

10、南京建成生物工程研究所提供的ＭＤＡ測試盒（ＴＢＡ法）操作步驟測定組織中ＭＤＡ濃度． １．４數(shù)據(jù)處理酶活性用“平均數(shù)標準偏差（ｍｅａｎｓＳＤ）”表示．試驗結(jié)果使用ＳＰＳＳ２２．０統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用方差分析（ＡＮＯＶＡ）法分析試驗組與對照組之間差異，并用Ｓｔｕｄｅｎｔ－Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌ’ｓ檢驗法分析組間顯著性，Ｐ＜０．０５表示差異顯著． ２結(jié)果與分析 ２．１海水酸化對脊尾白蝦ＳＯＤ活性的影響由圖１可見，隨著暴露時間的延長，１０００μＬ／Ｌ酸化組的脊尾白蝦ＳＯＤ活性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢．暴露１ｄ和７ｄ時１０００μＬ／Ｌ酸化組ＳＯＤ活性與

11、對照組之間的差異并不顯著（Ｐ＞０．０５）；暴露１４ｄ時酸化組ＳＯＤ活性受到顯著誘導（Ｐ＜０．０５）且達到最大值；暴露２８ｄ時，其ＳＯＤ活性高于對照組，但差異不顯著（Ｐ＞０．０５）．暴露于１９００μＬ／Ｌ酸化組的脊尾白蝦ＳＯＤ活性在暴露過程中受到不同程度的抑制．１ｄ和７ｄ時１９００μＬ／Ｌ組與對照組的ＳＯＤ活性無顯著差異（Ｐ＞０．０５）；１４ｄ和２８ｄ時１９００μＬ／Ｌ組ＳＯＤ活性均顯著低于對照組（Ｐ＜０．０５），且在１４ｄ時達到最低值． ２．２海水酸化對脊尾白蝦ＣＡＴ活性的影響不同程度酸化暴露對脊尾白蝦ＣＡＴ活性的影響如圖２所示．暴露于１０００μＬ／ＬＣＯ２的脊尾白蝦ＣＡＴ活性

12、表現(xiàn)為先升后降的趨勢，在１ｄ時１０００μＬ／Ｌ組與對照組的ＣＡＴ活性無顯著差異；在７ｄ時ＣＡＴ活性受到顯著誘導（Ｐ＜０．０５）且達到最大值；１４ｄ和２８ｄ時１０００μＬ／Ｌ組ＣＡＴ活性高于對照組，但差異不顯著（Ｐ＞０．０５）．暴露于１９００μＬ／ＬＣＯ２的脊尾白蝦ＣＡＴ活性隨著暴露時間延長先抑制后逐漸回升．暴露１ｄ和７ｄ時酸化組ＣＡＴ活性略低于對照組，但差異不顯著（Ｐ＞０．０５）；暴露１４ｄ時酸化組ＣＡＴ活性受到顯著抑制（Ｐ＜０．０５）且達到最低值；暴露２８ｄ時酸化組ＣＡＴ活性低于對照組，但無顯著差異（Ｐ＞０．０５）． ２．３海水酸化對脊尾白蝦ＧＳＨ－Ｐｘ活性的影響由圖３可以看

13、出，隨著暴露時間的延長，１０００μＬ／Ｌ酸化組脊尾白蝦ＧＳＨ－Ｐｘ活性呈現(xiàn)先增加后逐漸下降的趨勢．暴露１ｄ時酸化組ＧＳＨ－Ｐｘ活性與對照組無顯著差異；７ｄ和１４ｄ時酸化組ＧＳＨ－Ｐｘ活性顯著高于對照組（Ｐ＜０．０５），且在７ｄ時達到最大值；暴露２８ｄ時酸化組ＧＳＨ－Ｐｘ活性雖然高于對照組，但差異不顯著（Ｐ＞０．０５）．暴露于１９００μＬ／Ｌ酸化組的脊尾白蝦ＧＳＨ－Ｐｘ活性與ＳＯＤ及ＣＡＴ活性類似，在暴露過程中受到不同程度的抑制．１ｄ和７ｄ時１９００μＬ／Ｌ組與對照組的ＧＳＨ－Ｐｘ活性無顯著差異；１４ｄ時１９００μＬ／Ｌ酸化組ＧＳＨ－Ｐｘ活性受到顯著的抑制（Ｐ＜０．０５）且達到最低值；２８ｄ時１

14、９００μＬ／Ｌ組ＧＳＨ－Ｐｘ活性低于對照組，但差異不顯著（Ｐ＞０．０５）． ２．４海水酸化對脊尾白蝦ＭＤＡ濃度的影響在不同ＣＯ２體積分數(shù)酸化條件下，脊尾白蝦ＭＤＡ濃度變化如圖４所示．暴露于１０００μＬ／ＬＣＯ２的脊尾白蝦ＭＤＡ濃度隨著暴露時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢．暴露１ｄ和７ｄ時ＭＤＡ濃度與對照組無顯著差異（Ｐ＞０．０５）；暴露１４ｄ時ＭＤＡ濃度顯著增加（Ｐ＜０．０５）且達到最大值；暴露２８ｄ時ＭＤＡ濃度與對照組無顯著差異（Ｐ＞０．０５）．在１９００μＬ／ＬＣＯ２酸化條件下，脊尾白蝦ＭＤＡ濃度隨著暴露時間的延長表現(xiàn)為先增加后回的趨勢．１ｄ時１９００μＬ／Ｌ組的ＭＤＡ

15、濃度低于對照組但無顯著差異（Ｐ＞０．０５）；７ｄ和１４ｄ時ＭＤＡ濃度均顯著高于對照組（Ｐ＜０．０５）且在１４ｄ時達到最大值；２８ｄ時１９００μＬ／Ｌ酸化組ＭＤＡ濃度高于對照組，但差異不顯著（Ｐ＞０．０５） ３討論 抗氧化酶系統(tǒng)在清除體內(nèi)活性氧物質(zhì)、使細胞免受氧化損傷過程中發(fā)揮著重要作用．當生物體受到外界不利因素脅迫時，其體內(nèi)將產(chǎn)生過量的活性氧，打破機體內(nèi)抗氧化防御性功能酶與活性氧自由基之間的平衡關系，過量的活性氧將攻擊各種生物大分子，引發(fā)生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，對細胞和機體產(chǎn)生毒害作用［１１］．ＳＯＤ和ＣＡＴ是生物體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶，正常情況下

16、，ＳＯＤ，ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ協(xié)同作用可以有效清除脅迫所產(chǎn)生的活性氧自由基，從而使機體細胞免受自由基損傷［１２－１４］．已有研究表明，生物體的ＳＯＤ和ＣＡＴ等抗氧化酶在不同ｐＨ的環(huán)境脅迫下，其酶活性可能會受到誘導或抑制兩種現(xiàn)象．金頭鯛（Ｓｐａｒｕｓａｕｒａｔａ）在用ＣＯ２模擬海水酸化的試驗中，ＳＯＤ活力隨酸化梯度呈現(xiàn)出規(guī)律性變化［１５］．樊甄姣等［１６］研究發(fā)現(xiàn)，略低于正常值（ｐＨ８．０）的ｐＨ脅迫下，櫛孔扇貝（Ｃｈｌａｍｙｓｆａｒｒｅｒｉ）血清中ＳＯＤ和ＣＡＴ活性明顯升高，但低ｐＨ（７．０）時，ＳＯＤ和ＣＡＴ活性受到顯著抑制．與此類似的情況在背角無齒蚌（Ａｎｏｄｏｎｔａｗｏｏｄｉａｎａ）中也

17、存在，低ｐＨ（６．０）或高ｐＨ（８．５）均會使背角無齒蚌血清中ＳＯＤ和ＣＡＴ活性有不同程度的降低［１７］；馬廣智等［１８］研究發(fā)現(xiàn)草魚（Ｃｔｅｎｏ－ｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎｉｄｅｌｌｕｓ）在低ｐＨ環(huán)境脅迫下ＳＯＤ活性被抑制．克林雷氏鯰（Ｒｈａｍｄｉａｑｕｅｌｅｎ）在ｐＨ５．０的環(huán)境下脅迫其肝、鰓和肌肉中的ＣＡＴ活力也顯著低于ｐＨ７．０對照組［１９］．本研究發(fā)現(xiàn)，１０００μＬ／ＬＣＯ２酸化組，脊尾白蝦的ＳＯＤ，ＣＡＴ及ＧＳＨ－Ｐｘ酶活性先上升后下降，３種酶活性在１ｄ時酸化組與對照組均無顯著差異，在７ｄ時ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ兩種酶活性受到顯著誘導且達到最大值，ＳＯＤ酶活性則在１４ｄ時顯著高于對照組．

18、與此類似的是菲律賓簾蛤（Ｒｕｄｉｔａｐｅｓｐｈｉｌｉｐｐｉｎａｒｕｍ）在海水ＣＯ２酸化條件下，ｐＨ７．６組的ＳＯＤ活性顯著高于ｐＨ７．９對照組［２０］．這是由于ＣＯ２溶解于海水后引起水體環(huán)境ｐＨ的下降，破壞了脊尾白蝦體內(nèi)體液的酸堿平衡，而機體酸堿平衡失調(diào)伴隨氧化應激反應，同時激活抗氧化防御機制，從而影響抗氧化酶的活性［２１］．本研究中，暴露于１９００μＬ／ＬＣＯ２酸化組的脊尾白蝦，其ＳＯＤ，ＣＡＴ及ＧＳＨ－Ｐｘ酶活性則受到不同程度的抑制；該３種酶活性在１ｄ和７ｄ時酸化組與對照組均無顯著差異，而在１４ｄ時這３種酶活性均受到顯著抑制且達到最低值．這可能是隨著ＣＯ２體積分數(shù)的升高，環(huán)境ｐＨ進一步降低

19、，使機體Ｈ＋濃度增加，而多余的Ｈ＋促機體生成更多的活性氧自由基，破壞機體活性氧平衡，引起ＳＯＤ等酶活性降低［２１］．此外，本研究結(jié)果與李信書等［２２］發(fā)現(xiàn)隨著Ｃｄ和Ｃｕ濃度增加亞心形扁藻（Ｐｌａｔｙｎｏｎａｓｓｕｂｃｏｒｄｉ－ｆｏｒｍｉｓ）的ＳＯＤ酶活性也隨之增加，但濃度過高時反而下降的研究結(jié)論基本一致；與此類似的是，日本囊對蝦（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）在ｐＨ７．２水體脅迫下其ＳＯＤ的活性隨脅迫時間延長而逐漸降低［２３］．這可能是生物機體的ＳＯＤ，ＣＡＴ及ＧＳＨ－Ｐｘ等抗氧化酶活性在受到嚴重脅迫時被抑制，而在輕度脅迫時往往受到誘導而升高［２４］．樊甄姣等［１６］的研究結(jié)果也

20、表明，ｐＨ在一定范圍內(nèi)隨刺激強度的增加對櫛孔扇貝呈現(xiàn)免疫活性的正調(diào)節(jié)；但在高強度ｐＨ刺激下，免疫活性呈現(xiàn)出負調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)可能與高強度刺激引起的免疫機能疲勞或損傷有關．但Ｆｌｅｘｏｐｅｃｔｅｎｇｌａｂｅｒ扇貝暴露于ｐＨ７．４的海水酸化環(huán)境中，其消化腺和鰓組織的ＣＡＴ活性均高于對照組［２５］，厚殼貽貝（Ｍｙｔｉｌｕｓｃｏｒｕｓｃｕｓ）暴露于低ｐＨ（７．３）的海水酸化中時，其鰓組織的ＳＯＤ，ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性均受到顯著誘導［２６］．上述研究結(jié)果表明，海水酸化對機體抗氧化酶的反應是比較復雜的，具體的機理還需更加深入研究．ＭＤＡ作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)的ＭＤＡ濃度是極低的

21、，其濃度可間接反映機體的活性氧自由基和脂質(zhì)的過氧化水平，從而間接反映出細胞受損傷的程度，因此ＭＤＡ被廣泛地作為指示生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的檢測指標［２７－２８］．研究表明，在有機磷農(nóng)藥的暴露下，沼水蛙蝌蚪的ＭＤＡ濃度會隨著暴露濃度的增加而上升［２９］；磺胺類藥物暴露也會使羅非魚（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）肝臟組織的ＭＤＡ顯著提高［３０］．陶易凡等［３１］研究發(fā)現(xiàn)ｐＨ脅迫克氏原螯蝦（Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓｃｌａｒｋｉｉ）時其ＭＤＡ濃度在肝胰腺中的積累量會顯著增加．本研究結(jié)果顯示，暴露于體積分數(shù)１０００μＬ／ＬＣＯ２的脊尾白蝦ＭＤＡ濃度先升后降且暴露１４ｄ時ＭＤＡ濃度顯著增加；１９００μＬ／ＬＣＯ２時ＭＤＡ濃度先增加后減少，７ｄ和１４ｄ時ＭＤＡ濃度均顯著高于對照組且在１４ｄ達到最大值；２８ｄ時其ＭＤＡ濃度也略高于對照組．這可能是由于ｐＨ的脅迫會誘導機體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧自由基通過與生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，從而產(chǎn)生大量的ＭＤＡ［１７］，而且隨著ｐＨ的進一步降低，抗氧化酶ＳＯＤ，ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性明顯降低，使脅迫過程中產(chǎn)生的活性氧堆積而導致ＭＤＡ濃度不斷增加，導致機體免疫功能的進一步下降或受損。