人用狂犬病疫苗的免疫機(jī)制、毒株及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：重慶狂犬抗體檢測(cè)指南

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1、泓域健康/重慶狂犬抗體檢測(cè) 人用狂犬病疫苗的免疫機(jī)制、毒株及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 一、 人用狂犬病疫苗的免疫機(jī)制、毒株及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 狂犬病病毒RNA編碼核蛋白（N）、M1、M2、病毒包膜糖蛋白（G）和L五種蛋白，其中G蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原，可有效刺激特異性輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）增生，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。G蛋白特異性抗體是狂犬病疫苗最重要的保護(hù)性抗體，免疫效果主要依賴其抗原表位、結(jié)構(gòu)、蛋白折疊及糖基化等。N蛋白也是一種有效的保護(hù)性抗原，能夠刺激B細(xì)胞和Th細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫。磷蛋白（P）可誘導(dǎo)CTL，但保護(hù)作用較弱。機(jī)體在接種狂犬病疫苗約7天左右產(chǎn)生IgM抗體，在約

2、14天后產(chǎn)生IgG抗體并迅速升高。IgM和IgG抗體均具有中和病毒的能力，有些中和抗體能進(jìn)入感染狂犬病病毒的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)抑制病毒復(fù)制。CTL的高峰出現(xiàn)在免疫后12天，可清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的狂犬病病毒，Th細(xì)胞可增強(qiáng)抗核蛋白和糖蛋白抗體，也能增加保護(hù)效果。但Suss的研究認(rèn)為細(xì)胞免疫在狂犬病中的作用不明。 由于狂犬病病毒核蛋白序列高度保守，氨基酸同源性達(dá)78%至93%，故病毒之間在核殼體水平上存在著廣泛的抗原交叉反應(yīng)?？袢〔《镜闹饕乖课粸镚蛋白外功能區(qū)，當(dāng)其氨基酸同源性>74%時(shí)，病毒之間能夠交叉中和，為同一遺傳譜系內(nèi)的病毒；膜外區(qū)的氨基酸同源性<62%時(shí)，則無(wú)交叉中和反應(yīng)。目前疫苗株均屬

3、于遺傳譜系I，對(duì)遺傳譜系II中的病毒感染不具保護(hù)作用。 現(xiàn)已經(jīng)有十余個(gè)種類或基因型的狂犬病病毒屬病毒被描述為狂犬病的病原體。目前為止，遺傳譜系I的狂犬病病毒是引起人狂犬病的最常見(jiàn)的病毒型別，也是至今應(yīng)用于狂犬病疫苗生產(chǎn)的唯一病毒種類。故現(xiàn)有疫苗可能無(wú)法為遺傳譜系I外的其他血清型病毒感染提供保護(hù)。因此，用于疫苗的病毒種類必須慎重選擇。生產(chǎn)用毒種應(yīng)是在實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)和減毒，并具有穩(wěn)定生物學(xué)特性的固定毒株，其歷史和來(lái)源應(yīng)確證清楚，并經(jīng)過(guò)全面的特征性檢定，符合國(guó)家相關(guān)文件的要求。病毒滅活后制成的疫苗對(duì)人體安全且能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用。WHO推薦用于疫苗生產(chǎn)的病毒固定毒株包括PasteurVir

4、us、Pitman-Moore、Vnukovo-32、Flury雞胚細(xì)胞低傳代株和CTN株等。 人用狂犬病疫苗應(yīng)符合WHO生物制品標(biāo)準(zhǔn)專家委員會(huì)（ECBS）制定的指導(dǎo)原則中對(duì)疫苗特性、生產(chǎn)及質(zhì)量控制的要求。用于制備疫苗的細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)來(lái)源于健康動(dòng)物，動(dòng)物來(lái)源品系清楚。根據(jù)現(xiàn)行《中國(guó)藥典》的要求，動(dòng)物必須是清潔級(jí)或以上的動(dòng)物。所用動(dòng)物應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)檢測(cè)要求的相關(guān)規(guī)定。人二倍體及傳代細(xì)胞應(yīng)在限定代次內(nèi)使用。病毒在細(xì)胞（或胚蛋）中增殖后，將收獲的病毒進(jìn)行濃縮、純化、滅活，加入保護(hù)劑凍干而成。細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的最低效價(jià)為在效期內(nèi)每一劑肌注劑量達(dá)2．5IU以上，由NIH法檢測(cè)確定。ELISA

5、法檢測(cè)糖蛋白等其他體外測(cè)定方法目前仍處于實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證階段，但該方法已用于生產(chǎn)過(guò)程中抗原含量的控制。疫苗需經(jīng)臨床前研究及臨床試驗(yàn)，企業(yè)需獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的生產(chǎn)許可證方可生產(chǎn)疫苗。WHO建議對(duì)新申請(qǐng)注冊(cè)的疫苗，在臨床試驗(yàn)中檢測(cè)0、14、28/30、180、360天血清中和抗體水平。已經(jīng)獲準(zhǔn)生產(chǎn)的人用狂犬病疫苗需按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局的要求申請(qǐng)批簽發(fā)，僅有獲得批簽發(fā)合格證的狂犬病疫苗批次方可上市使用。 二、 凍干人用狂犬病疫苗（Vero細(xì)胞）批簽發(fā)量較多 按照培養(yǎng)基質(zhì)分品種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，目前Vero細(xì)胞狂犬病疫苗是主流產(chǎn)品。凍干人用狂犬病疫苗（Vero細(xì)胞）的批簽發(fā)量為6201．

6、29萬(wàn)支，市占率為75．27%;人用狂犬病疫苗（Vero細(xì)胞）的批簽發(fā)量為1103．18萬(wàn)支，市占率為13．39%;地鼠腎細(xì)胞狂犬病疫苗的批簽發(fā)量為534．57萬(wàn)支，市占率為6．49%;最后是人二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗的批簽發(fā)量為399．31萬(wàn)支，市占率為4．85%。 由此來(lái)看，二代狂犬病疫苗（Vero細(xì)胞基質(zhì)）仍然占據(jù)主導(dǎo)地位，三代狂犬病疫苗（人二倍體細(xì)胞基質(zhì)）正在逐步崛起。 三、 常用細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病疫苗比較 我國(guó)已上市的狂犬疫苗產(chǎn)品根據(jù)使用細(xì)胞基質(zhì)不同可分為：二倍體細(xì)胞、Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）、地鼠腎細(xì)胞及雞胚細(xì)胞，其中Vero細(xì)胞是目前應(yīng)用最為廣泛的動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)，Vero細(xì)胞更

7、容易生產(chǎn)和儲(chǔ)存，狂犬病毒表達(dá)滴度高，因此，Vero細(xì)胞狂犬疫苗具有生產(chǎn)控制水平高、產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本較低的優(yōu)勢(shì)。但Vero細(xì)胞屬于傳代細(xì)胞，高濃度的Vero細(xì)胞DNA存在致腫瘤風(fēng)險(xiǎn)。此外，市場(chǎng)上的Vero細(xì)胞狂犬病疫苗均使用動(dòng)物來(lái)源的血清和胰酶，產(chǎn)品存在外源病毒因子污染風(fēng)險(xiǎn)。 人二倍體細(xì)胞疫苗是第三代狂犬病疫苗，與動(dòng)物細(xì)胞相比，人二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗具備天然的安全性優(yōu)勢(shì)，無(wú)致腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，雜質(zhì)去除要求低，被世界衛(wèi)生組織稱為預(yù)防狂犬病的黃金標(biāo)準(zhǔn)疫苗，是目前國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)狂犬病疫苗的有力補(bǔ)充，尤其適用于過(guò)敏體質(zhì)者、老人及兒童等免疫力偏低的人群。但人二倍體細(xì)胞存在培養(yǎng)難度高，狂犬病毒表達(dá)滴度低等問(wèn)題，因此人二

8、倍體細(xì)胞狂犬病疫苗產(chǎn)量較低、生產(chǎn)成本高。 目前，我國(guó)獲批簽發(fā)上市的人用狂犬病疫苗企業(yè)共有8家。2018-2020年，我國(guó)利用Vero細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)的人用狂犬疫苗批簽發(fā)數(shù)量占比最大，保持在90%左右；人二倍體細(xì)胞狂犬疫苗整體呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。 四、 狂犬病疫苗批簽發(fā)量呈現(xiàn)平穩(wěn)波動(dòng)的態(tài)勢(shì) 由于狂犬病患病高死亡率，狂犬病疫苗使用接種尤為剛性，人用狂犬病疫苗是我國(guó)常年批簽發(fā)量較大的疫苗品種之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)狂犬疫苗每年的批簽發(fā)總量維持在6000-8000萬(wàn)支，即1200-1600萬(wàn)人份（4-5針/人份），2020年我國(guó)全年批簽發(fā)各類狂犬疫苗大約8238萬(wàn)劑，較2019年同期增長(zhǎng)40．04%。2

9、021年第一季度，狂犬病疫苗批簽發(fā)量為1439萬(wàn)支，同比增長(zhǎng)30．19%。 五、 當(dāng)前狂犬疫苗發(fā)展面臨的問(wèn)題與困境 疫苗的質(zhì)量直接關(guān)系到國(guó)家公共衛(wèi)生健康與安全，下一代人類疫苗通常是為了減少不良事件或提高現(xiàn)有疫苗的功效而開(kāi)發(fā)的。目前上市的幾款狂犬疫苗在預(yù)防狂犬病方面已經(jīng)取得了巨大的成功，但仍然存在一定的局限性，因此仍然需要利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)完善。 疫苗本身開(kāi)發(fā)模式具有特殊性：研發(fā)即生產(chǎn)。車間產(chǎn)能的持續(xù)迭代背后存在大量時(shí)間成本、審批成本，產(chǎn)量決定了臨床規(guī)模及商業(yè)化規(guī)模。 血清問(wèn)題：無(wú)血清培養(yǎng)是狂犬疫苗研制中世界性的技術(shù)難題，疫苗生產(chǎn)均使用動(dòng)物來(lái)源的牛血清和豬胰酶，產(chǎn)品存在外源病毒因

10、子污染風(fēng)險(xiǎn)，給后續(xù)產(chǎn)品生產(chǎn)帶來(lái)挑戰(zhàn)。降血清至無(wú)血清是國(guó)內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)共同的研究趨勢(shì)。 二倍體狂犬疫苗安全性強(qiáng)，為狂犬疫苗未來(lái)主要發(fā)展趨勢(shì)之一。但存在成本高、制備困難、產(chǎn)量低、大規(guī)模培養(yǎng)難度較大等技術(shù)問(wèn)題。 免疫程序的選擇：世衛(wèi)組織已經(jīng)批準(zhǔn)了不同的方案，例如兩點(diǎn)皮內(nèi)注射（0，3和7天）；單點(diǎn)肌肉注射（0，3，7天和第14-28天之間）和3周肌肉注射（0天x2，7天x1和21天x1）疫苗接種。目前國(guó)內(nèi)狂犬病疫苗接種程序所采用的是肌內(nèi)接種，即五針?lè)ǎ?，3，7，14，28天）和2-1-1法（0天x2，7天x1和21天x1）。選擇最佳的免疫接種程序可有效降低成本和劑量。 中國(guó)的犬?dāng)?shù)超過(guò)1億只，其

11、中大部分在農(nóng)村散養(yǎng)。消除狂犬病必須免疫動(dòng)物，而與歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家的動(dòng)物普遍免疫不同，中國(guó)接種疫苗的動(dòng)物比例較少。因此，人用狂犬病疫苗屬于剛性需求。隨著人均可支配收入的增加，國(guó)內(nèi)民眾將愈發(fā)重視對(duì)疾病的預(yù)防和管理。隨著中國(guó)人均可支配收入快速增長(zhǎng)，人們付費(fèi)接種疫苗的意愿和能力也將隨之提高。此外，教育程度的提升會(huì)提高狂犬病疫苗接種率，這將促進(jìn)人用狂犬病疫苗的銷量增長(zhǎng)。 未來(lái)隨著國(guó)內(nèi)企業(yè)在疫苗領(lǐng)域研發(fā)投入的加大，優(yōu)質(zhì)的技術(shù)+充足的產(chǎn)能，將助力患者的可及性持續(xù)提升，推動(dòng)狂犬疫苗長(zhǎng)期可持續(xù)發(fā)展。 狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患傳染病。幾乎所有溫血?jiǎng)游锒紝?duì)狂犬病毒易感，其中犬類是主要宿主。狂犬病主要通過(guò)動(dòng)

12、物咬傷后，唾液中的狂犬病毒經(jīng)破損皮膚侵入體內(nèi)傳播?？袢∈瞧駷橹谷祟惒∷缆首罡叩募毙詡魅静。坏┌l(fā)病死亡率接近100%，即使治愈也會(huì)留下嚴(yán)重后遺癥。目前對(duì)狂犬病缺乏有效的治療手段，因此使用狂犬疫苗預(yù)防是關(guān)鍵。 隨著我國(guó)狂犬病預(yù)防的加強(qiáng)，發(fā)病人數(shù)及病死人數(shù)逐年下降。從發(fā)病病例來(lái)看，自2007年起，我國(guó)狂犬病發(fā)病病例逐步下降，目前，據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委數(shù)據(jù)，2021年我國(guó)狂犬病發(fā)病病例降至157例。 六、 人用+寵物用雙管齊下，助力狂犬病防控 我國(guó)對(duì)狂犬病的防控，至今已有30年。2014年，康華生物的人二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗（HDCV）獲批上市，開(kāi)啟了我國(guó)國(guó)產(chǎn)狂犬病疫苗的人源新時(shí)代。HDCV在免疫效

13、果和起效速度方面優(yōu)勢(shì)明顯，免疫持續(xù)時(shí)間可達(dá)10年，不良反應(yīng)發(fā)生率低于1%，適用全人群（包括兒童、老人及孕婦），被視為預(yù)防人類狂犬病的金標(biāo)準(zhǔn)疫苗。 此次啟動(dòng)的中國(guó)寵物狂犬病疫苗現(xiàn)狀調(diào)研項(xiàng)目將覆蓋寵物醫(yī)院、寵物美容店，通過(guò)調(diào)查每年接種疫苗的犬、貓數(shù)量，以及寵物主人對(duì)于為犬和貓接種疫苗的認(rèn)知和行為習(xí)慣，以期為狂犬病控制和預(yù)防提供新的思路和策略參考，促進(jìn)行業(yè)發(fā)展。 據(jù)透露，未來(lái)還將推出新一代、高標(biāo)準(zhǔn)、引用人用狂犬病疫苗生產(chǎn)技術(shù)的寵物狂犬病滅活疫苗，配合人二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗（HDCV），從人用和寵物用兩個(gè)方向加強(qiáng)狂犬病的防控。 在中國(guó)，狂犬?。≧abies）是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，2015－2

14、018年更是導(dǎo)致每年幾百人死亡，超過(guò)95%的人類狂犬病病例來(lái)源于患狂犬病的狗。雖然狂犬病是一種嚴(yán)重的人獸共患病，但狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）在我國(guó)現(xiàn)行動(dòng)物庫(kù)內(nèi)的循環(huán)和分布并不清楚。 七、 國(guó)內(nèi)狂犬疫苗市場(chǎng)持續(xù)增長(zhǎng) 近年來(lái)，隨著我國(guó)狂犬病預(yù)防教育普及、人用狂犬病疫苗接種數(shù)量增加，我國(guó)狂犬病預(yù)防工作取得了重大進(jìn)展，在控制狂犬病發(fā)病率方面起到了重要作用。2018年，中國(guó)人用狂犬疫苗市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到28．4億元，預(yù)計(jì)2022年將達(dá)到38．7億元的市場(chǎng)規(guī)模。 Vero細(xì)胞人用狂犬病疫苗是狂犬病疫苗市場(chǎng)的主導(dǎo)者，占據(jù)75．0%的市場(chǎng)份額；人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病疫苗和原代細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病

15、疫苗（包括地鼠腎細(xì)胞人用狂犬病疫苗和雞胚細(xì)胞人用狂犬病疫苗）分別占據(jù)18．2%和6．8%的市場(chǎng)份額。 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心報(bào)告顯示，我國(guó)狂犬病疫情主要分布在人口稠密的華中、華南、西南、華東地區(qū)。人群分布上呈三多特征：農(nóng)村地區(qū)病例較多、15歲以下兒童和50歲以上人群發(fā)病較多。中國(guó)的犬?dāng)?shù)超過(guò)1億只，其中大部分在農(nóng)村散養(yǎng)。消除狂犬病必須免疫動(dòng)物，而與歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家的動(dòng)物普遍免疫不同，中國(guó)接種疫苗的動(dòng)物比例較少。因此，人用狂犬病疫苗屬于剛性需求。隨著人均可支配收入的增加，國(guó)內(nèi)民眾將愈發(fā)重視對(duì)疾病的預(yù)防和管理。隨著中國(guó)人均可支配收入快速增長(zhǎng)，人們付費(fèi)接種疫苗的意愿和能力也將隨之提高。此外，教育程度的提升會(huì)提高狂犬病疫苗接種率，這將促進(jìn)人用狂犬病疫苗的銷量增長(zhǎng)。