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1、實時定量 PCR （ qRT-PCR） 實時定量 PCR （ qRT-PCR） Polymerase Chain Reaction（ PCR） 聚合酶鏈式反應 偉大的天才發(fā)現！ Kary B. Mullis 1989年美國 Science雜志列 PCR 為十 余項重大科學發(fā)明之首 ,比喻 1989年為 PCR爆 炸年 ,Mullis榮獲 1993年度諾貝爾化學獎。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫 度 （ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復 13步 2530輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復性 子鏈延伸
2、 DNA加倍 DNA 變 性 形 成2 條 單 鏈 PCR的基本原理 PCR的基本原理 模板 DNA 94 50-65 引物 1 引物 2 DNA引物 72 PCR的基本原理 引物 1 引物 2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 第 1輪結束 94 第 2輪開始 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 50-65 Taq Taq Taq Taq 72 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 第 2輪結束 PCR基本原理 Mg2+ 模板 引物 dNTP DNA 聚合酶 PCR PCR反應 基本
3、要素 1、 單、雙鏈 DNA， cDNA均可 2、 不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合 酶抑制劑 DNA結合蛋白類 3、 一般 100ng DNA模板 /100L,模板濃度 過高會導致反應的非特異性增加 （ 1）模板 1、引物濃度一般為 0.1-0.5 mol/L，濃度過高易 導致模板與引物錯配 ,反應特異性下降 2、引物的設計 （ 2）引物 （ 3） Taq DNA聚合酶 1、酶的用量一般為 0.5-2.5 U/50 l， 2、酶量增加使反應特異性下降 ;酶量過少 影響反應產量。 （ 4） Mg2+ 1、 Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑，一般用量為 0.5mmol/L-2.5mmol/L
4、反應體系。 2、 Mg2+濃度過低會使 Taq酶活性喪失、 PCR產量下降； Mg2+過高影響反應特異性。 3、 Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中 dNTP、 EDTA等的濃度影響反應中游離的 Mg2+濃度。 1、 dNTP濃度取決于擴增片段的長度 2、四種 dNTP濃度應相等 3、濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則 降低反應產量 4、 dNTP可與 Mg2+結合，使游離的 Mg2+濃度下降， 影響 DNA聚合酶的活性。 （ 5） dNTP (1)變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 ,94 30-40s (2)退火 溫度由 引物長度 和 GC含量 決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特
5、異性結 合 ;降低溫度可增加反應的靈敏性。 循環(huán)參數 （ 3）延伸 68-75, 一般為 72 延伸時間由擴增片段長度決定 （ 4）循環(huán)次數 主要取決于模板 DNA的濃度 ,一般為 25-35次 次數過多 ,擴增效率降低 ,錯誤摻入率增加 常用 PCR反應體系 (以 HiFi Taq為例 ) 模板 1.0 L 上游引物 0.5 L 下游引物 0.5 L 10X HiFi Buffer（ +Mg2+） 2.5 L dNTPs 2.0 L HiFi Taq酶 0.2-0.3 L ddH2O 補足 25 L 共 25 L 常用 PCR反應條件 94 2-5min 94 30-40s Tm 30-45
6、s 72 1min/1kb 72 10min 12 + 25-35個循環(huán) 幾種常用 PCR技術 RT-PCR (Reverse Transcription PCR) 反向 PCR (Reverse PCR) RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends) qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR) 基因 mRNA 蛋白質多肽鏈 RT-PCR (反轉錄 PCR) DNA水平 RNA水平 蛋白水平 RT-PCR基本原理 mRNA AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT Reverse Transcription mRNA A
7、AAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT cDNA RT-PCR一般步驟 1、 RNA提取 RNA質量的檢測 一般 RT-PCR要求提取的 RNA要有較高的 完整性 和 純度 完整性檢測（ 1%瓊脂糖膠電泳） 純度檢測（ OD260/280） OD260/280一般介于 1.9-2.1之間，小于 1.9 時蛋白污染；大于 2.1時 RNA發(fā)生降解 2 8 S 1 8 S 5 S 2、反轉錄 RT-PCR一般步驟 在冰盒上加入以下試劑： 組成 體積 隨機引物 或 Oligo dT） 1L 1-5g Total RNA xL DEPC-Treated H2O yL 體系配制完成后瞬時離心，
8、 70 反應 5min,然后迅速轉移至冰盒，冰浴 2-5min, 此步驟的作用是 去除 mRNA的二級結構 。 RT-PCR一般步驟 組成 體積 5X Buffer 4L dNTPs 1L RNAse inhibitor 1L M-MLV 1L DEPC-Treated H2O xL 1、混勻， 42 ， 90min 2、 70 ， 10min，終止反應 3、 A3檢測 在冰盒上加入以下試劑： 反向 PCR (reverse） PCR) 已知序列 未知序列 未知序列 反向 PCR是用反向的互補引物來擴增兩引物以外 的 DNA片段對某個已知 DNA片段兩側的未知序列 進行擴增 。 可對未知序列擴
9、增后進行分析 ,如探索鄰接已知 DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長 cDNA的克隆 ,擴增基因文庫的插入 DNA；建立基 因組步移文庫。 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 反向 PCR原理 cDNA 末端快速擴增技術 (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)是一種基于 PCR技術從 低豐度的轉錄本中快速擴增 cDNA 的 5和 3 末端的有效方法 ,以其簡單、快速、廉價等優(yōu) 勢而受到越來越多的重視。 RACE (rapid-amplification of cDNA ends) AAAAAAAA mRNA 接頭序列 AAAAAA
10、AA mRNA GeneRacer 3Primer GSP2 GeneRacer 3Nested Primer NGSP2 Reverse transcription GeneRacer Oligo dT Primer TTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG cDNA TTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG 已知片段 RACE 3RACE原理 mRNA AAAAAA mRNA NNNNNNNNNNN AAAAAA Oligo dT Reverse Transcription NGSP1 Ge
11、neRacer 5Nested Primer GSP1 GeneRacer 5 Primer GeneRacer RNA Oligo Sequence NNNNNNNNNNN 接頭序列 TTTTTT NNNNNNNNNNN cDNA mRNA AAAAAA NNNNNNNNNNN 已知片段 5RACE原理 qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR) 通過 熒光染料 或熒光標記的特異性 探針 ,對 PCR產物進行標記跟蹤 ,實時在線監(jiān)控反應過 程 ,結合相應的軟件可以對結果進行分析 ,計 算待測樣品的初始模板量。 內摻式染料 SYBR Green I 序列特異性探針
12、 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特異性探針 Amplifluor (Intergen) 1、 SYBR Green 法 SYBR Green 工作原理 SYBR Green法優(yōu)缺點 融解曲線（ dissociation curve） 正常 有非特異 性擴增 2、 TaqMan探針法 作 用 機 理 TaqMan TaqMan法與 SYBR Green I的 比較 幾個重要概念 基線（ Baseline） 熒光閾值（ threshold） 熒光閾值（ threshold） 是在熒光擴增曲線上 人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號 指數
13、擴增階段任意位置上，一般熒光域值的 設置是基線（背景）熒光信號的標準偏差的 10 倍。熒光域值是 PCR3 15個循環(huán)熒光信 號標準差的 10倍，熒光域值設定在 PCR擴增 的指數期。 Ct值（ threshold value ） 每個反應管內的熒光信號到達設定 的域值時所經歷的循環(huán)數被稱為 Ct 值。 研究表明，各模板的 Ct值與該模板 的 起始拷貝數 的對數存在線性關系， 起始拷貝數越多， Ct值越小。反之 亦然。 定量 PCR的數學原理 熒光定量 PCR的解析方法 相對定量 內參基因 目的基因 1 2 0.2 內參基因 內參基因 ： qRT-PCR時，每個標本都要做對 應的內參，而且每次
14、都是管家基因，一般用 -actin，有時也用 GAPDH。 管家基因 ：又稱 持家基因 (house-keeping genes)生物體各類細胞中都表達，其產物是 對維持細胞基本生命活動所必需的蛋白質編 碼的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基 因與核糖體蛋白基因等。是為維持細胞基本 生命活動所需而時刻都在表達的基因。 內參基因的選擇 理想的內參基因應該滿足以下條件 ： 1、不存在假基因，以避免基因 DNA的擴增 2、高度或中度表達，排除低表達 3、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織（如正常細 胞和癌細胞），而且其表達量是近似的，無顯著性 差別 4、表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關 5、其穩(wěn)定
15、的表達水平與目標基因相似 6、不受任何內源性或外源性因素的影響，如不受 任何實驗處理措施的影響 常用內參基因 家蠶常用內參基因 Actin3 GAPDH sw22934 數據 處理（ Ct法） qRT-P C R的優(yōu)點及限制因素 qRT-PCR不僅實現了 PCR從定性到定量的 飛躍，而且與常規(guī) PCR相比，它具有 操作簡 便 、 快速高效 、 敏感性 高 、 特異性 強 、有效 解決了 PCR污染 的問題、 自動化程度高 等特 點 qRT-PCR限制因數 實驗費用昂貴，需要設置多組重復和對照 怎樣避免擴增基因組 DNA、如何消除和評定由于樣品處理、 儀器的差異和個人操作而帶來的誤差以及如何更準
16、確定量 基因？ 值得指出的是， qRT-PCR只能定量 mRNA水平，但 mRNA水平可能不能反映細胞中蛋白水平，因為在轉錄后 還有諸多調節(jié)因素。 要準確而全面的了解機體的表達水平，除了分析 mRNA水 平外，還需要免疫組織化學和生物化學實驗的數據。 更多關于 qRT-PCR的信息，請參照 ： 引物設計 常用引物設計軟件： primer Premier， Oligo 序列應位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同 源序列 引物長度： 17-25bp 堿基盡可能隨機分布 , GC%： 40%-60% 盡量避免 錯配（ False Priming)、引物二聚體 (Dimer)和 發(fā)夾結構（ Hairpin） 引物設計 引物長度： 17-25bp GC%: 40-60% Tm:60 （ Primer Premier 5.0） 產物長度： 80-300bp,100-200bp最佳
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