過氧化氫酶活性的測定

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1、 過 氧 化 氫 酶 活 性 的 測 定 碘 量 法實 驗 三 學(xué) 時 ： 3 生 物 體 內(nèi) 重 要 的 三 種 氧 化 酶 類 ， 其 作 用 均 是清 除 體 內(nèi) 自 由 基 ：POD： 過 氧 化 物 酶SOD： 超 氧 化 物 歧 化 酶CAT： 過 氧 化 氫 酶 1、 掌 握 碘 量 法 測 定 過 氧 化 氫 酶 活 性 的 原理 和 方 法 ； 2、 了 解 過 氧 化 氫 酶 的 作 用 。 一 、 實 驗 目 的 ： 植 物 在 逆 境 下 或 衰 老 時 ， 由 于 體 內(nèi) 活 性 氧 代 謝 加 強(qiáng) 而 使 H2O2發(fā) 生 累 積 。 H2O2可 進(jìn) 一 步 生 成

2、氫 氧 自 由 基 （ OH） 。 氫 氧 自 由 基 （ OH） 是 化 學(xué) 性 質(zhì) 最 活 潑 的 活 性 氧 ， 可 以 直 接 或間 接 地 氧 化 細(xì) 胞 內(nèi) 核 酸 ， 蛋 白 質(zhì) 等 生 物 大 分 子 ， 并 且 有 非 常高 的 速 度 常 數(shù) ， 破 壞 性 極 強(qiáng) ， 可 使 細(xì) 胞 膜 遭 受 損 害 ， 加 速 細(xì)胞 的 衰 老 和 解 體 。 過 氧 化 氫 酶 (catalase； CAT)可 以 清 除 H2O2、 分 解 氫 氧 自 由 基 ，保 護(hù) 機(jī) 體 細(xì) 胞 穩(wěn) 定 的 內(nèi) 環(huán) 境 及 細(xì) 胞 的 正 常 生 活 ， 因 此 CAT是植 物 體 內(nèi) 重

3、 要 的 酶 促 防 御 系 統(tǒng) 之 一 ， 其 活 性 高 低 與 植 物 的 抗逆 性 密 切 相 關(guān) 。二 、 實 驗 原 理 : CAT活 性 大 小 以 一 定 時 間 內(nèi) 分 解 的 H2O2量 來 表 示 ： 在 一 定 條 件 下 ， CAT能 把 H2O2分 解 為 H2O和 O2。 當(dāng) CAT與H2O2反 應(yīng) 一 定 時 間 (t)后 ， 再 用 碘 量 法 測 定 未 分 解 的 H2O2， 以鉬 酸 銨 作 催 化 劑 ， H2O2與 KI反 應(yīng) ， 放 出 游 離 碘 ， 然 后 用 硫 代硫 酸 鈉 滴 定 碘 ， 反 應(yīng) 式 為 ： H2O2（ 余 ） +2KI+

4、H2SO4- I2+K2SO4+2H2O I2 +2Na2S2O3 - 2NaI+Na2S4O6（ 連 二 硫 酸 鈉 ） 用 硫 代 硫 酸 鈉 分 別 滴 定 空 白 液 (可 求 出 總 的 H 2O2量 )和 反 應(yīng)液 (可 求 出 未 分 解 的 H2O2量 )， 再 根 據(jù) 二 者 滴 定 值 之 差 求 出 分解 的 H2O2量 。 二 、 實 驗 原 理 : 1、 實 驗 材 料 ： 三 葉 草2、 儀 器 ： (1) 滴 定 管 (2)研 缽 (3) 容 量 瓶 (4)移 液 管 (5)三 角 瓶 (100ml) 3、 試 劑 ： （ 1） 0.05M H2O2 （ 2） 0

5、.2M Na2S2O3 （ 3） 1.8M H2SO4 （ 4） 1.5%淀 粉 溶 液 （ 5） 10%（ NH4)6Mo7O24 （ 6） 20% KI （ 7） CaCO3， 石 英 砂 三 、 實 驗 材 料 、 儀 器 和 試 劑 ： 1、 酶 液 提 取 ： 稱 取 0.5g三 葉 草 ， 加 少 量 石 英 砂 ， CaCO3， 2ml水 ， 研 成 勻 漿 ，移 入 50ml容 量 瓶 ， 沖 洗 研 缽 數(shù) 次 ， 定 容 ， 靜 置 ， 過 濾 。 2、 酶 促 反 應(yīng) ： （ 1） 取 錐 形 瓶 2個 ， 編 號 A， B， 各 加 入 10ml酶 液 ， 之 后 立

6、即 向 A瓶中 加 入 1.8mol/L H2SO45ml， 終 止 酶 活 性 ， 作 空 白 滴 定 。（ 2） 向 A， B兩 瓶 各 加 H2O2 5ml， 搖 勻 ， 在 加 入 B瓶 那 一 刻 起 ， 記 錄 時 間 ， 5分 鐘 后 迅 速 向 B瓶 中 加 入 1.8mol/LH2SO45ml， 終 止 酶 活 性 。3、 滴 定 ： 向 A， B兩 瓶 各 加 1ml 20% KI和 3滴 （ NH 4） 6Mo7O24， 搖 勻 后 迅速 加 入 5滴 1.5%淀 粉 溶 液 ， 用 Na2S2O3進(jìn) 行 滴 定 至 藍(lán) 色 恰 好 消 失 ，記 錄 兩 次 消 耗 Na

7、2S2O3的 體 積 VA(空 白 )， VB(反 應(yīng) 液 )。 四 、 實 驗 步 驟 ： 酶 活 性 測 定管號 酶液(ml) 1.8M H2SO4(ml) 0.05MH2O2 保溫 1.8MH2SO4(ml) 20% KI溶液 (ml) 鉬 酸銨 溶液 (滴 ) 淀 粉溶 液(滴 ) 0.2MNa2S2O3溶 液 的滴 定 量A空白 10 5 5 5分鐘 - 1 3 5 VA(空 白 )=B反應(yīng) 10 - 5 5 1 3 5 VB(反 應(yīng)液 ) = 1、 被 分 解 的 H2O2量 （ mg） =（ 空 白 滴 定 值 -樣 品 滴 定 值 ） Na2S2O3摩 爾 濃 度 172、 CAT活 性 （ mg.g-1.min-1） = 被 分 解 的 H2O2量 （ mg） (總 體 積 測 定 取 液 量 ) 樣 品 重 （ g） 時 間 （ min）五 、 實 驗 結(jié) 果 與 計 算 ： 六 、 思 考 題 ：1、 本 實 驗 中 影 響 CAT活 性 測 定 的 因 素 有 哪 些 ？