《重組DNA技術(shù)》PPT課件

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1、 第 十 章 目 錄 第 一 節(jié)自 然 界 的 DNA的 重 組 DNA Recombination DNA重 組細(xì) 菌 的 基 因 轉(zhuǎn) 移 與 重 組接 合 作 用 、 轉(zhuǎn) 化 作 用 、 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 作 用轉(zhuǎn) 座 重 組 （ 自 學(xué) ）同 源 重 組特 異 位 點(diǎn) 的 重 組 （ 自 學(xué) ） 發(fā) 生 在 同 源 序 列 間 的 重 組 稱 為 同 源 重 組 ，又 稱 基 本 重 組 。 是 最 基 本 的 DNA重 組 方 式 ，通 過 鏈 的 斷 裂 和 再 連 接 ， 在 兩 個(gè) DNA分 子 同源 序 列 間 進(jìn) 行 單 鏈 或 雙 鏈 片 段 的 交 換 。 以 E.coli的 同

2、源 重 組 為 例 ， 了 解 同 源 重 組機(jī) 制 的 Holliday模 型 。一 、 同 源 重 組 Holliday模 型 中 ， 同 源 重 組 主 要 4個(gè) 關(guān) 鍵 步 驟 兩 個(gè) 同 源 染 色 體 DNA排 列 整 齊 一 個(gè) DNA的 一 條 鏈 斷 裂 、 并 與 另 一 個(gè) DNA對(duì) 應(yīng) 的 鏈 連 接 ， 形 成 Holliday中 間 體 通 過 分 支 移 動(dòng) 產(chǎn) 生 異 源 雙 鏈 DNA Holliday中 間 體 切 開 并 修 復(fù) ， 形 成 兩 個(gè) 雙 鏈重 組 體 DNA， 分 別 為 ：片 段 重 組 體拼 接 重 組 體 Holiday中 間 體5

3、35 353 53 53 5 55 3335 5 55 333 3 5 5 55 333 3 5 5 55 3333 5 5 55 333 3 內(nèi) 切 酶(ruvC)內(nèi) 切 酶(ruvC) DNA連 接 酶 DNA連 接 酶片段重組體拼接重組體 目 錄 二 、 細(xì) 菌 的 基 因 轉(zhuǎn) 移 與 重 組接 合 作 用轉(zhuǎn) 化 作 用轉(zhuǎn) 導(dǎo) 作 用細(xì) 胞 融 合 （ 一 ） 接 合 作 用當(dāng) 細(xì) 胞 或 細(xì) 菌 通 過 菌 毛 相 互 接 觸 時(shí) ， 質(zhì) 粒DNA從 一 個(gè) 細(xì) 胞 （ 細(xì) 菌 ） 轉(zhuǎn) 移 至 另 一 細(xì) 胞（ 細(xì) 菌 ） ， 這 種 DNA轉(zhuǎn) 移 稱 為 接 合 作 用 。質(zhì) 粒 細(xì)

4、 菌 染 色 體 外 的 小 型 環(huán) 狀 雙 鏈 DNA分 子 可 接 合 質(zhì) 粒 如 F 因 子 (F factor) （ 二 ） 轉(zhuǎn) 化 作 用通 過 自 動(dòng) 獲 取 或 人 為 地 供 給 外 源 DNA，使 細(xì) 胞 或 培 養(yǎng) 的 受 體 細(xì) 胞 獲 得 新 的 遺 傳 表 型 ，稱 為 轉(zhuǎn) 化 作 用 。 例 ： 溶 菌 時(shí) ， 裂 解 的 DNA片 段 被 另 一 細(xì) 菌 攝 取 。 （ 三 ） 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 作 用當(dāng) 病 毒 從 被 感 染 的 細(xì) 胞 （ 供 體 ） 釋 放 出來 、 再 次 感 染 另 一 細(xì) 胞 （ 受 體 ） 時(shí) ， 發(fā) 生 在供 體 細(xì) 胞 與 受 體 細(xì) 胞

5、 之 間 的 DNA轉(zhuǎn) 移 及 基 因重 組 即 為 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 作 用 。 噬 菌 體 的 生 活 史 溶 菌 生 長(zhǎng) 途 徑溶 源 菌 生 長(zhǎng) 途 徑例 目 錄 目 錄 第 二 節(jié) 基 因 工 程DNA Recombination Technique 重 組 DNA技 術(shù) 的 發(fā) 展 史 年 G.J.Mendel的 豌 豆 雜 交 試 驗(yàn) 1944年 O.T.Avery的 肺 炎 球 菌 轉(zhuǎn) 化 實(shí) 驗(yàn)1973年 美 國(guó) 斯 坦 福 大 學(xué) 的 科 學(xué) 家 構(gòu) 建 第 一 個(gè) 重 組 DNA分 子1977年 美 國(guó) 南 舊 金 山 由 博 耶 和 斯 旺 森 建 立 世 界 上 第 一 家 遺

6、 傳 工程 公 司 ， 專 門 應(yīng) 用 重 組 DNA技 術(shù) 制 造 醫(yī) 學(xué) 上 重 要 的 藥 物 。1980年 開 始 建 造 第 一 家 應(yīng) 用 重 組 DNA技 術(shù) 生 產(chǎn) 胰 島 素 的 工 廠1997年 英 國(guó) 羅 林 研 究 所 成 功 的 克 隆 了 多 莉 n 相 關(guān) 概 念n DNA克 隆n 工 具 酶n 目 的 基 因n 基 因 載 體n 基 本 原 理 n 重 組 DNA技 術(shù) 與 醫(yī) 學(xué) 的 關(guān) 系主 要 內(nèi) 容 克 隆 (clone)來 自 同 一 始 祖 的 相 同 副 本 或 拷 貝 的 集 合 。獲 取 同 一 拷 貝 的 過 程 稱 為 克 隆 化 (clo

7、ning)，即 無 性 繁 殖 。（ 一 ） DNA克 隆 技 術(shù) 水 平 ： 分 子 克 隆 即 DNA 克 隆 細(xì) 胞 克 隆個(gè) 體 克 隆 （ 動(dòng) 物 或 植 物 ） DNA克 隆應(yīng) 用 酶 學(xué) 的 方 法 ， 在 體 外 將 各 種 來 源 的 遺 傳物 質(zhì) （ 同 源 的 或 異 源 的 、 原 核 的 或 真 核 的 、 天 然的 或 人 工 的 DNA） 與 載 體 DNA接 合 成 一 具 有 自 我復(fù) 制 能 力 的 DNA分 子 復(fù) 制 子 ， 繼 而 通 過 轉(zhuǎn) 化或 轉(zhuǎn) 染 宿 主 細(xì) 胞 ， 篩 選 出 含 有 目 的 基 因 的 轉(zhuǎn) 化 子細(xì) 胞 ， 再 進(jìn) 行 擴(kuò)

8、 增 提 取 獲 得 大 量 同 一 DNA分 子 。 也 稱 基 因 克 隆 或 重 組 DNA 。 生 物 技 術(shù) 工 程 : 基 因 工 程 、 蛋 白 質(zhì) 工 程 、酶 工 程 、 細(xì) 胞 工 程 等目 的 分 離 獲 得 某 一 感 興 趣 的 基 因 或 DNA 獲 得 感 興 趣 基 因 的 表 達(dá) 產(chǎn) 物 （ 蛋 白 質(zhì) ）基 因 工 程 (genetic engineering) 實(shí) 現(xiàn) 基因 克 隆 所 用 的 方 法 及 相 關(guān) 的 工 作 稱 基 因 工 程 ，又 稱 重 組 DNA工 藝 學(xué) 。 （ 二 ） 工 具 酶n 限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶n DNA聚 合

9、 酶 n 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶n T4DNA連 接 酶n 堿 性 磷 酸 酶 n 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶n Taq DNA聚 合 酶 重 組 DNA技 術(shù) 中 常 用 的 工 具 酶工 具 酶 功 能限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 識(shí) 別 特 異 序 列 ， 切 割 DNADNA連 接 酶 催 化 DNA中 相 鄰 的 5磷 酸 基 和 3羥 基 末 端 之 間 形 成 磷 酸二 酯 鍵 ， 使 DNA切 口 封 合 或 使 兩 個(gè) DNA分 子 或 片 段 連 接DNA聚 合 酶 合 成 雙 鏈 cDNA分 子 或 片 段 連 接 缺 口 平 移 制 作 高 比 活 探 針 DNA序 列 分 析 填

10、補(bǔ) 3末 端Klenow片 段 又 名 DNA聚 合 酶 I大 片 段 ， 具 有 完 整 DNA聚 合 酶 I的 53聚 合 、 35外 切 活 性 ， 而 無 53外 切 活 性 。 常 用 于cDNA第 二 鏈 合 成 ， 雙 鏈 DNA 3末 端 標(biāo) 記 等反 轉(zhuǎn) 錄 酶 合 成 cDNA 替 代 DNA聚 合 酶 I進(jìn) 行 填 補(bǔ) ， 標(biāo) 記 或 DNA序 列 分 析多 聚 核 苷 酸 激 酶 催 化 多 聚 核 苷 酸 5羥 基 末 端 磷 酸 化 ， 或 標(biāo) 記 探 針末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 在 3羥 基 末 端 進(jìn) 行 同 質(zhì) 多 聚 物 加 尾堿 性 磷 酸 酶 切 除 末 端

11、磷 酸 基 限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶定 義限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 (RE)是 識(shí) 別 DNA的 特 異 序列 , 并 在 識(shí) 別 位 點(diǎn) 或 其 周 圍 切 割 雙 鏈 DNA的 一 類 內(nèi)切 酶 。 GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC GBam H 作 用 與 甲 基 化 酶 共 同 構(gòu) 成 細(xì) 菌 的 限 制 -修 飾系 統(tǒng) ， 限 制 外 源 DNA， 保 護(hù) 自 身 DNA。分 類 、 、 （ 基 因 工 程 技 術(shù) 中 常 用 型 ） 第 一 個(gè) 字 母 取 自 產(chǎn) 生 該 酶 的 細(xì) 菌 屬 名 ， 用 大 寫 ；第 二 、 第 三 個(gè) 字 母 是 該

12、 細(xì) 菌 的 種 名 ， 用 小 寫 ；第 四 個(gè) 字 母 代 表 株 ；用 羅 馬 數(shù) 字 表 示 發(fā) 現(xiàn) 的 先 后 次 序 。命 名 H in d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流 感 嗜 血 桿 菌 d株 的 第 三 種 酶 類 酶 識(shí) 別 序 列 特 點(diǎn) 回 文 結(jié) 構(gòu) (palindrome) 切 口 ： 平 端 切 口 、 粘 端 切 口 Bam HGTCCAG GCCTAG GATCC GGGATCCCCTAGGH indGTCGACCAGCTGGACCTG平 端 切 口 粘 端 切 口 同 功 異 源 酶來 源 不 同 的 限 制 酶 ， 但

13、 能 識(shí) 別 和 切 割同 一 位 點(diǎn) ， 這 些 酶 稱 同 功 異 源 酶 。GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC GBam H GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC GBst 同 尾 酶有 些 限 制 性 內(nèi) 切 酶 雖 然 識(shí) 別 序 列 不 完 全相 同 ， 但 切 割 DNA后 ， 產(chǎn) 生 相 同 的 粘 性 末 端 ，稱 為 同 尾 酶 。 這 兩 個(gè) 相 同 的 粘 性 末 端 稱 為 配伍 未 端 。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G ATCTAG GATCT A （ 三 ） 目 的 基 因n cD

14、NA n 基 因 組 DNA目 的 基 因 分 離 獲 得 某 一 感 興 趣 的 基 因 或 DNA 獲 得 感 興 趣 基 因 的 表 達(dá) 產(chǎn) 物 （ 蛋 白 質(zhì) ） （ 四 ） 基 因 載 體定 義 為 攜 帶 目 的 基 因 ， 實(shí) 現(xiàn) 其 無 性 繁 殖 或表 達(dá) 有 意 義 的 蛋 白 質(zhì) 所 采 用 的 一 些 DNA分子 。常 用 載 體質(zhì) 粒 DNA噬 菌 體 DNA病 毒 DNA 克 隆 載 體 (cloning vector)為 使 插 入 的 外 源 DNA序 列 被 擴(kuò) 增 而 特 意設(shè) 計(jì) 的 載 體 稱 為 克 隆 載 體 。表 達(dá) 載 體 (expression

15、 vector) 為 使 插 入 的 外 源 DNA序 列 可 轉(zhuǎn) 錄 翻 譯 成多 肽 鏈 而 特 意 設(shè) 計(jì) 的 載 體 稱 為 表 達(dá) 載 體 。 載 體 的 選 擇 標(biāo) 準(zhǔn)n 能 自 主 復(fù) 制 ；n 具 有 兩 個(gè) 以 上 的 遺 傳 標(biāo) 記 物 ， 便 于 重 組 體的 篩 選 和 鑒 定 ；n 有 克 隆 位 點(diǎn) （ 外 源 DNA插 入 點(diǎn) ） ， 常 具 有多 個(gè) 單 一 酶 切 位 點(diǎn) ， 稱 為 多 克 隆 位 點(diǎn) ； n 分 子 量 小 ， 以 容 納 較 大 的 外 源 DNA。 1. 質(zhì) 粒 (plasmid)特 點(diǎn) 能 在 宿 主 細(xì) 胞 內(nèi) 獨(dú) 立 自 主 復(fù)

16、制 ； 帶 有 某些 遺 傳 信 息 , 會(huì) 賦 予 宿 主 細(xì) 胞 一 些 遺 傳 性 狀 。 目 錄 噬 菌 體 DNA改 造 系 統(tǒng) gt系 列 （ 插 入 型 ， 適 用 cDNA克 隆 ）EMBL系 列 （ 置 換 型 ， 適 用 基 因 組 克 隆 ）2. 噬 菌 體 (phage) M13噬 菌 體 DNA改 造 系 統(tǒng) （ 含 lacZ基 因 ）M13mp系 列pUC系 列 M13噬 菌 體 pUC系 列 的 物 理 圖 譜 3. 粘 性 質(zhì) 粒 (cosmid) 酵 母 人 工 染 色 體 (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì) 菌 人 工 染

17、 色 體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動(dòng) 物 病 毒 DNA改 造 的 載 體（ 如 腺 病 毒 ， 腺 病 毒 相 關(guān) 病 毒 ， 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 ）其 他 二 、 重 組 DNA技 術(shù) 基 本 原 理克 隆 基 本 過 程目 的 基 因 的 獲 取 DNA導(dǎo) 入 受 體 菌外 源 基 因 與 載 體 的 連 接 克 隆 載 體 的 選 擇 和 構(gòu) 建重 組 體 的 篩 選 克 隆 基 因 的 表 達(dá) 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程 目 錄 （ 一 ） 目 的 基 因 的 獲 取1. 化 學(xué) 合 成 法要 求 ： 已 知

18、目 的 基 因 的 核 苷 酸 序 列 或 其 產(chǎn) 物 的氨 基 酸 序 列 。2.基 因 組 DNA文 庫(kù) (genomic DNA library)3. cDNA文 庫(kù) (cDNA library)4. 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) （ 見 第 22章 ） * 1、 化 學(xué) 合 成 法 獲 取 目 的 基 因由 已 知 氨 基 酸 序 列 推 測(cè) 可 能 的 DNA序 列 組 織 或 細(xì) 胞 染 色 體 DNA基 因 片 斷 克 隆 載 體重 組 DNA分 子含 重 組 分 子 的 轉(zhuǎn) 化 菌限 制 性 內(nèi) 切 酶受 體 菌 基

19、因 組 DNA文 庫(kù)存 在 于 轉(zhuǎn) 化 細(xì) 胞 內(nèi)由 克 隆 載 體 所 攜 帶 的 所有 基 因 組 DNA的 集 合* 2、 從 基 因 組 DNA文 庫(kù) 獲 取 目 的 基 因 目 錄 （ 二 ） 克 隆 載 體 的 選 擇 和 構(gòu) 建若 將 外 源 基 因 連 接 到 復(fù) 制 子 (基 因 載 體 )上 ,外 源 DNA就 可 以 作 為 復(fù) 制 子 的 一 部 分在 受 體 細(xì) 胞 內(nèi) 復(fù) 制 .在 基 因 克 隆 中 基 因 載 體 的 選 擇 與 構(gòu) 建 是一 項(xiàng) 技 術(shù) 性 很 強(qiáng) 的 工 作 ,直 接 影 響 到 基因 克 隆 的 成 敗 . （ 三 ） 外 源 基 因 與

20、載 體 的 連 接1. 粘 性 末 端 連 接方 式 ： (1)同 一 限 制 酶 切 位 點(diǎn) 連 接(2)不 同 限 制 酶 切 位 點(diǎn) 連 接配 伍 末 端 連 接非 配 伍 末 端 連 接 Bam H 切 割 反 應(yīng) GGATCC CCTAGG T4 DNA連 接 酶15CGATCC GGCCTAG目 的 基 因 用 Bam H 切 割GCCTAGGCCTAG GATCCGGATCCG載 體 DNA用 Bam H 切 割GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG重 組 體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載 體 自 連

21、 目 的 基 因 自 連 同一限制酶切位點(diǎn)連接 目 錄 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G ATCTAG GATCT A不 同 限 制 酶 切 位 點(diǎn) （ 配 伍 末 端 ） 的 連 接配 伍 末 端 的 連 接 情 況 和 同 一 限 制 酶 切 位點(diǎn) 連 接 相 似 。 不 同 限 制 酶 切 位 點(diǎn) （ 非 配 伍 末 端 ） 的 連 接GAATTCCTTAAG AGATCTTCTAGAEco R 切 割 位 點(diǎn) GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l 切 割 位 點(diǎn)AATTCG ATCTAG AATTCGGATCTA A

22、ATTCG ATCTAGEcoR + Bg l雙 酶 切 Eco R + Bg l雙 酶 切G CTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連 接 酶15C重 組 體 目 錄 2. 平 端 連 接適 用 于 ： 限 制 性 內(nèi) 切 酶 切 割 產(chǎn) 生 的 平 端粘 端 補(bǔ) 齊 或 切 平 形 成 的 平 端 目 的 基 因 載 體限 制 性 內(nèi) 切 酶 限 制 性 內(nèi) 切 酶T4 DNA連 接 酶15C重 組 體 載 體 自 連 目 的 基 因 自 連 目 錄 3. 同 聚 物 加 尾 連 接在 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 (terminal transferase)的作 用 下 ， 在

23、 DNA片 段 末 端 加 上 同 聚 物 序 列 、制 造 出 粘 性 末 端 ， 再 進(jìn) 行 粘 端 連 接 。 53 35載 體 DNA53 35目 的 基 因限 制 酶 或 機(jī) 械 剪 切 限 制 酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核 酸 外 切 酶 -核 酸 外 切 酶末 端 轉(zhuǎn) 移 酶+ dATP 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶+ dTTPT(T) nTA(A)nA A(A)nA T(T)nTT4 DNA連 接 酶15C重 組 體 目 錄 4. 人 工 接 頭 (linker)連 接由 平 端 加 上 新 的 酶

24、切 位 點(diǎn) ， 再 用 限 制 酶 切除 產(chǎn) 生 粘 性 末 端 ， 而 進(jìn) 行 粘 端 連 接 。 人工接頭及其應(yīng)用 CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3- Eco R Eco R Eco REco R目 錄 受 體 菌 條 件安 全 宿 主 菌 （ 從 大 腸 桿 菌 K-12改 造 ）限 制 酶 和 重 組 酶 缺 陷處 于 感 受 態(tài)導(dǎo) 入 方 式 轉(zhuǎn) 化 轉(zhuǎn) 染 感 染（ 四 ） 重 組 DNA導(dǎo) 入 受 體 菌 （ 五 ） 重 組 體 的 篩 選 1. 直 接 選 擇 法(1) 抗 藥 性 標(biāo) 記 選 擇(2) 標(biāo) 志 補(bǔ) 救 (marker rescue)(3) 分 子

25、雜 交 法原 位 雜 交Southern印 跡 2. 免 疫 學(xué) 方 法如 免 疫 化 學(xué) 方 法 及 酶 免 檢 測(cè) 分 析 等 ( 插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇 目 錄 互 補(bǔ) 目 錄 互補(bǔ)的檢測(cè) 目 錄 原位雜交 目 錄 Southern印 跡 目 錄 雞 的 肌 球 蛋 白 的 克 隆 和 檢 出 目 錄 重 組 DNA技 術(shù) 操 作 過 程 可 形 象 歸 納 為 小 結(jié)分 分 離 目 的 基 因 切 限 制 酶 切 目 的 基 因 與 載 體接 拼 接 重 組 體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn) 入 受 體 菌 篩 篩 選 重 組 體 重 組 DNA技 術(shù) 操 作 的 主 要 步 驟載 體質(zhì) 粒 噬 菌 體

26、 病 毒 目 的 基 因 （ 外 源 基 因 ）基 因 組 DNA cDNA 人 工 合 成 PCR產(chǎn) 物限 制 酶 消 化開 環(huán) 載 體 DNA 目 的 基因連 接 酶重 組 體轉(zhuǎn) 化 體 外 包 裝 ， 轉(zhuǎn) 染帶 重 組 體 的 宿 主篩 選 表 型 篩 選 酶 切 電 泳 鑒 定 菌 落 原 位 雜 交 目 錄 表 達(dá) 體 系 的 建 立表 達(dá) 載 體 的 構(gòu) 建受 體 細(xì) 胞 的 建 立表 達(dá) 產(chǎn) 物 的 分 離 純 化（ 六 ） 克 隆 基 因 的 表 達(dá) 1. 原 核 表 達(dá) 體 系 （ E.coli表 達(dá) 體 系 最 為 常 用 ）標(biāo) 準(zhǔn) ： 選 擇 標(biāo) 志 強(qiáng) 啟 動(dòng) 子 翻

27、譯 調(diào) 控 序 列 多 接 頭 克 隆 位 點(diǎn)E.coli表 達(dá) 體 系 的 不 足 不 宜 表 達(dá) 真 核 基 因 組 DNA不 能 加 工 表 達(dá) 的 真 核 蛋 白 質(zhì)表 達(dá) 的 蛋 白 質(zhì) 常 形 成 不 溶 性 包 涵 體 (inclusion body) 很 難 表 達(dá) 大 量 可 溶 性 蛋 白 大 鼠 胰 島 素 原 cDNA的 表 達(dá) 和 分 泌 目 錄 優(yōu) 點(diǎn) ： 可 表 達(dá) 克 隆 的 cDNA及 真 核 基 因 組 DNA可 適 當(dāng) 修 飾 表 達(dá) 的 蛋 白 質(zhì)表 達(dá) 產(chǎn) 物 分 區(qū) 域 積 累缺 點(diǎn) ： 操 作 技 術(shù) 難 、 費(fèi) 時(shí) 、 不 經(jīng) 濟(jì)轉(zhuǎn) 染 將 表

28、達(dá) 載 體 導(dǎo) 入 真 核 細(xì) 胞 的 過 程方 法 ： 磷 酸 鈣 轉(zhuǎn) 染DEAE葡 聚 糖 介 導(dǎo) 轉(zhuǎn) 染電 穿 孔 脂 質(zhì) 體 轉(zhuǎn) 染 顯 微 注 射 2. 真 核 表 達(dá) 體 系 酵 母 、 昆 蟲 、 乳 類 動(dòng) 物 細(xì) 胞 表 達(dá) 載 體 pFASTBACI 的 物 理 圖 譜 目 錄 目 錄 （ 一 ） 疾 病 基 因 的 發(fā) 現(xiàn) 與 克 隆根 據(jù) 基 因 定 位 克 隆 之 并 研 究 其 性 質(zhì) ， 而 認(rèn)識(shí) 疾 病 的 分 子 機(jī) 制 。三 、 重 組 技 術(shù) 與 醫(yī) 學(xué) 的 關(guān) 系（ 二 ） 生 物 制 藥 重 組 DNA醫(yī) 藥 產(chǎn) 品產(chǎn) 品 功 能組 織 胞 漿 素 原

29、 激 活 劑 抗 凝血 液 因 子 VIII 促 進(jìn) 凝 血顆 粒 細(xì) 胞 -巨 噬 細(xì) 胞 集 落 剌 激 因 子 剌 激 白 細(xì) 胞 生 成促 紅 細(xì) 胞 生 成 素 剌 激 白 細(xì) 胞 生 成生 長(zhǎng) 因 子 (bFGF, EGF) 刺 激 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 與 分 化生 長(zhǎng) 素 治 療 侏 儒 癥胰 島 素 治 療 糖 尿 病干 擾 素 ( 1b, 2a, 2b, ) 抗 病 毒 感 染 及 某 些 腫 瘤白 細(xì) 胞 介 素 激 活 、 剌 激 各 類 白 細(xì) 胞 超 氧 化 物 歧 化 酶 抗 組 織 損 傷單 克 隆 抗 體 利 用 其 結(jié) 合 特 異 性 進(jìn) 行 診 斷 試 驗(yàn) 、

30、腫瘤 導(dǎo) 向 治 療乙 肝 疫 苗 (CHO, 酵 母 ) 預(yù) 防 乙 肝口 服 重 組 B亞 單 位 菌 體 霍 亂 菌 苗 預(yù) 防 霍 亂 目 錄 基 因 診 斷 (genetic diagnosis)是 利 用 分 子 生物 學(xué) 及 分 子 遺 傳 的 技 術(shù) 和 原 理 ， 在 DNA水 平分 析 、 鑒 定 遺 傳 疾 病 所 涉 及 基 因 的 置 換 、 缺 失或 插 入 等 突 變 。（ 三 ） 基 因 診 斷基 本 過 程 區(qū) 分 或 鑒 定 DNA的 異 常分 離 、 擴(kuò) 增 待 測(cè) 的 DNA片 斷 標(biāo) 準(zhǔn) . 能 正 確 擴(kuò) 增 靶 基 因 ；. 能 準(zhǔn) 確 區(qū) 分 單

31、 個(gè) 堿 基 的 差 別 ；. 本 底 或 噪 聲 低 ， 不 干 擾 DNA的 鑒 定 ;. 便 于 完 全 自 動(dòng) 化 操 作 ， 適 合 大 面 積 、大 人 群 普 查 。 （ 四 ） 基 因 治 療定 義 基 因 治 療 (gene therapy)是 向 有 功 能 缺 陷的 細(xì) 胞 補(bǔ) 充 相 應(yīng) 功 能 的 基 因 ， 以 糾 正 或 補(bǔ) 償其 基 因 的 缺 陷 ， 從 而 達(dá) 到 治 療 的 目 的 。方 式 體 細(xì) 胞 基 因 治 療 (somatic cell gene therapy)性 細(xì) 胞 基 因 治 療 (germ line gene therapy) 1.

32、產(chǎn) 前 診 斷2. 攜 帶 者 測(cè) 試3. 癥 候 前 診 斷4. 遺 傳 病 易 感 性（ 五 ） 遺 傳 疾 病 的 預(yù) 防 目 錄 轉(zhuǎn) 基 因 技 術(shù)采 用 基 因 轉(zhuǎn) 移 技 術(shù) 使 目 的 基 因 整 合 入 受 精卵 細(xì) 胞 或 胚 胎 干 細(xì) 胞 ， 然 后 將 細(xì) 胞 導(dǎo) 入 動(dòng) 物 子宮 ， 使 之 發(fā) 育 成 個(gè) 體 。 轉(zhuǎn) 基 因 被 導(dǎo) 入 的 目 的 基 因轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 (transgenic animal) 目 的 基 因 的 受 體 動(dòng) 物轉(zhuǎn) 基 因 技 術(shù) 目 錄 目 錄 目 錄 n 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 是 動(dòng) 物 整 體 水 平 研 究 目 的 基因 的

33、 生 物 技 術(shù) ， 特 點(diǎn) 是 “ 分 子 及 其 細(xì) 胞水 平 的 操 作 ， 組 織 及 動(dòng) 物 整 體 水 平 表 達(dá) ” 目 錄 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 構(gòu) 建 過 程n 轉(zhuǎn) 基 因 載 體 的 構(gòu) 建n 將 轉(zhuǎn) 基 因 載 體 導(dǎo) 入 受 精 卵 細(xì) 胞 或 者 胚 胎干 細(xì) 胞n 將 轉(zhuǎn) 基 因 受 精 卵 或 胚 胎 干 細(xì) 胞 植 入 假 孕小 鼠 子 宮 中n 對(duì) 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 進(jìn) 行 鑒 定 目 錄 轉(zhuǎn) 基 因 的 技 術(shù) 方 法n DNA顯 微 注 射 法n 克 隆 法n 胚 胎 干 細(xì) 胞 技 術(shù)n 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 介 導(dǎo) 的 基 因 轉(zhuǎn) 移n 精 子 載 體

34、法 等各 有 優(yōu) 點(diǎn) 和 缺 點(diǎn) ， 常 用 的 是 顯 微 注 射 和 克 隆 法 目 錄 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 的 鑒 定n Southern雜 交 確 定 外 源 基 因 的 整 合 以及 整 合 的 拷 貝 數(shù)n RT-PCR 確 定 外 源 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 和 轉(zhuǎn) 錄 水平n Western雜 交 確 定 外 源 基 因 蛋 白 質(zhì) 的表 達(dá) 情 況 n 實(shí) 時(shí) PCR（ 熒 光 定 量 PCR） 目 錄 轉(zhuǎn) 基 因 技 術(shù) 的 應(yīng) 用n （ 1） 建 立 致 病 基 因 表 達(dá) 、 調(diào) 控 的 動(dòng) 物 模型n （ 2） 動(dòng) 植 物 新 品 種 的 培 育n （ 3） 各 種 基

35、因 工 程 產(chǎn) 品 的 制 備n （ 4） 探 討 生 殖 細(xì) 胞 的 基 因 治 療 方 法 目 錄 目 錄 核 轉(zhuǎn) 移 技 術(shù) 即 動(dòng) 物 整 體 克 隆 技 術(shù) ， 將 動(dòng) 物 體 細(xì) 胞核 全 部 導(dǎo) 入 另 一 個(gè) 體 的 去 胞 核 的 受 精 卵 內(nèi) ，使 之 發(fā) 育 成 個(gè) 體 ， 即 克 隆 (clone)。這 樣 的 個(gè) 體 所 攜 帶 的 性 狀 僅 來 自 一 個(gè)父 親 或 母 親 個(gè) 體 ,為 無 性 繁 殖 .1996年 ,克 隆 羊 ” 多 莉 ” 的 產(chǎn) 生 成 為 當(dāng)年 分 子 生 物 學(xué) 發(fā) 展 最 重 要 的 事 件核 轉(zhuǎn) 移 技 術(shù) 目 錄 克 隆 羊

36、“ 目 錄 目 錄 基 因 剔 除 技 術(shù)也 稱 基 因 靶 向 (gene targeting)滅 活 ，有 目 的 去 除 動(dòng) 物 體 內(nèi) 某 種 基 因 的 技 術(shù) ?；?因 剔 除 技 術(shù) 目 錄 基 因 剔 除 程 序n 將 滅 活 的 基 因 放 入 胚 胎 干 細(xì) 胞 (ES細(xì) 胞 ),使 這 一 滅 活 的 基 因 通 過 同 源 重 組 取 代 原有 目 的 基 因 ,篩 選 到 基 因 定 點(diǎn) 滅 活 的 細(xì) 胞后 ,通 過 顯 微 注 射 到 小 鼠 囊 胚 .n 細(xì) 胞 在 小 鼠 囊 胚 參 與 胚 胎 的 發(fā) 育 ,最 終 形成 嵌 合 體 小 鼠 ,由 于 一 部 分 生 殖 細(xì) 胞 來 源于 ES細(xì) 胞 ,通 過 小 鼠 培 養(yǎng) 可 獲 得 純 合 子 基因 剔 除 小 鼠 . 目 錄 基 因 轉(zhuǎn) 移 和 基 因 剔 除 技 術(shù) 在醫(yī) 學(xué) 中 的 應(yīng) 用建 立 動(dòng) 物 疾 病 可 遺 傳 的 模 型 ,探 討 疾 病 發(fā) 生 機(jī) 制 單 基 因 決 定 疾 病 模 型 進(jìn) 行 基 因 剔 除 以 模 擬 基 因 失 活 .單 基 因 疾 病 模 型 :地 中 海 貧 血 ,動(dòng) 脈 硬 化 ,老 年 癡 呆 等 多 基 因 決 定 疾 病 模 型 多 基 因 疾 病 模 型 :腫 瘤 ,高 血 壓 ,糖 尿 病