北大基礎醫(yī)學生物化學課件 重組DNA技術

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1、重組重組DNA技術技術劉新文北京大學醫(yī)學部生物化學與分子生物學系劉新文，重組DNA技術第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 DNA克隆克隆(DNA cloning)：應用酶學的方法，在體應用酶學的方法，在體外將目的基因與載體外將目的基因與載體DNA結合成一具有自我復制能結合成一具有自我復制能力的力的DNA分子分子復制子，繼而通過轉化或轉染宿主復制子，繼而通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一擴增、提取獲得大量同一DNA分子的過程。分子的過程。DNA克隆又稱基因克?。寺∮址Q基因克?。╣ene cloning）。）。基因

2、工程（基因工程（genetic engineering）：）：實現(xiàn)基因克實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關的工作。又稱重組隆所采用的方法及相關的工作。又稱重組DNA技技術（術（recombinant DNA technology）劉新文，重組DNA技術一、一、克隆體系：目的基因、載體克隆體系：目的基因、載體DNA、工具酶、宿工具酶、宿主細胞等主細胞等 1、目的基因目的基因（target gene）：cDNA或或基因組基因組DNA 2、載體載體(vector)：質粒質粒、噬菌體、柯斯質粒載體、噬菌體、柯斯質粒載體、病毒和人工染色體等病毒和人工染色體等 cDNA （complementary DNA）

3、：指體外經反轉錄指體外經反轉錄合成的，與合成的，與RNA（常指常指mRNA）互補的單鏈互補的單鏈DNA,單鏈單鏈cDNA進而合成雙鏈進而合成雙鏈cDNA?；蚪M基因組DNA（genomic DNA）：代表一個細胞或生代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的所有物體整套遺傳信息的所有DNA序列，稱為基因組序列，稱為基因組DNA。劉新文，重組DNA技術質粒質粒（plasmid）：存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀：存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈雙鏈DNA分子，在細胞中可以獨立進行復制并在細分子，在細胞中可以獨立進行復制并在細胞分裂時恒定地傳給子代細胞。胞分裂時恒定地傳給子代細胞。3.1 限制性核酸內切酶限制

4、性核酸內切酶(restriction endonuclease):存存在于細菌體內，能夠識別和切割雙鏈在于細菌體內，能夠識別和切割雙鏈DNA內部特定內部特定核苷酸序列的一類核酸酶。核苷酸序列的一類核酸酶。3、工具酶：限制性核酸內切酶、連接酶、工具酶：限制性核酸內切酶、連接酶、DNA聚聚合酶、逆轉錄酶、堿性磷酸酶、末端聚合酶、合酶、逆轉錄酶、堿性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、酶、DNA酶，等酶，等 常用的是常用的是IIII類限制性內切酶類限制性內切酶 許多限制性核酸內切酶許多限制性核酸內切酶IIII的識別序列屬于回文結構的識別序列屬于回文結構劉新文，重組DNA技術配伍末端（配伍末端（compat

5、ible end）：）：不同限制性內切酶產不同限制性內切酶產生的相同粘性末端生的相同粘性末端 3.2 DNA聚合酶：大腸桿菌聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I（全酶）、全酶）、Klenow片段片段(Klenow 酶酶)、T4 DNA聚合酶以及聚合酶以及Taq酶等酶等 3.3 DNA連接酶連接酶T4 連接酶：可用于粘端與平端的連接連接酶：可用于粘端與平端的連接 4、宿主細胞：大腸桿菌、酵母、動物細胞、宿主細胞：大腸桿菌、酵母、動物細胞 劉新文，重組DNA技術第二節(jié)第二節(jié) DNA克隆的基本過程克隆的基本過程 分、切、接、轉、篩、表達分、切、接、轉、篩、表達一、一、“分分”：目的基因及載體的制備：

6、目的基因及載體的制備 1、分離基因的方法：化學合成、分離基因的方法：化學合成、PCR、基因組文庫、基因組文庫、cDNA文庫文庫 聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）：）：在反應體系中加入模板在反應體系中加入模板DNA、dNTP、特別設計的特特別設計的特異引物及耐熱的異引物及耐熱的DNA聚合酶（常用聚合酶（常用Taq酶），經多次酶），經多次變性、退火、延伸循環(huán)反應，使目的變性、退火、延伸循環(huán)反應，使目的DNA呈指數(shù)合呈指數(shù)合成的過程成的過程 劉新文，重組DNA技術cDNA文庫文庫(cDNA library)：以：以mRNA為模板，利用為模板，利

7、用反轉錄酶合成與反轉錄酶合成與mRNA互補的互補的DNA，再復制成雙鏈再復制成雙鏈cDNA片段，與適當載體連接后轉入受體菌，這些受片段，與適當載體連接后轉入受體菌，這些受體菌包含了所有體菌包含了所有cDNA信息，總稱信息，總稱cDNA文庫文庫。常用常用于篩選編碼蛋白質的結構基因。于篩選編碼蛋白質的結構基因?；蚪M基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)：利用限制利用限制性核酸內切酶將組織或細胞染色體性核酸內切酶將組織或細胞染色體DNA切割后，與切割后，與適當載體連接后轉入受體菌，這些受體菌包含了所有適當載體連接后轉入受體菌，這些受體菌包含了所有基因組基因組DNA信息，總稱

8、基因組信息，總稱基因組DNA文庫文庫 劉新文，重組DNA技術 2、常用載體：質粒、噬菌體、病毒、常用載體：質粒、噬菌體、病毒DNA 克隆載體（克隆載體（cloning vector）：）：用于目的基因的克隆、用于目的基因的克隆、擴增、序列分析和體外定點突變等擴增、序列分析和體外定點突變等 表達載體表達載體(expression vector)：用于在宿主細胞中表達用于在宿主細胞中表達外源目的基因，獲得大量表達產物外源目的基因，獲得大量表達產物 二、二、“切切”：限制性內切酶切割目的基因和載體：限制性內切酶切割目的基因和載體DNA 三、三、“接接”：重組體的構建：重組體的構建 四、四、“轉轉”：

9、重組：重組DNA分子導入受體細胞分子導入受體細胞 1、轉化（、轉化（transformation）：）：將質?；蚱渌庠磳①|?；蚱渌庠碊NA導入宿主細胞導入宿主細胞(常用大腸桿菌常用大腸桿菌)，并使其獲得新的表型，并使其獲得新的表型的過程的過程 劉新文，重組DNA技術 2、轉染（、轉染（transfection）：）：將外源將外源DNA導入真核細胞導入真核細胞的過程的過程 3、感染（、感染（transfection）：以）：以l l噬菌體、柯斯質粒和噬菌體、柯斯質粒和病毒為載體的重組病毒為載體的重組DNA分子，在體外經過包裝成具分子，在體外經過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適

10、當?shù)募氂懈腥灸芰Φ牟《净蚴删w顆粒，才能感染適當?shù)募毎?，并在細胞內擴增。也稱為轉導（胞，并在細胞內擴增。也稱為轉導（transduction）五、五、“篩篩”：篩選出含重組：篩選出含重組DNA的受體細胞的受體細胞 1、直接選擇法：遺傳標記、直接選擇法：遺傳標記【抗藥性標志選擇、營養(yǎng)抗藥性標志選擇、營養(yǎng)缺陷型的互補篩選法及分子標記（缺陷型的互補篩選法及分子標記（PCR、分子雜交）分子雜交）】2、非直接選擇法：免疫化學法、酶聯(lián)免疫檢測法、非直接選擇法：免疫化學法、酶聯(lián)免疫檢測法 劉新文，重組DNA技術六、六、“表達表達”：使克隆基因在宿主細胞中復制、表：使克隆基因在宿主細胞中復制、表達達 1、外源

11、基因在原核細胞的表達、外源基因在原核細胞的表達 大腸桿菌是最常用的原核表達體系大腸桿菌是最常用的原核表達體系 真核基因在原核細胞中表達的蛋白質常常形成不溶真核基因在原核細胞中表達的蛋白質常常形成不溶性的包涵體性的包涵體 2、真核表達體系：酵母、昆蟲及哺乳動物細胞等、真核表達體系：酵母、昆蟲及哺乳動物細胞等 劉新文，重組DNA技術第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術與分子醫(yī)學的關系技術與分子醫(yī)學的關系 疾病基因的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展新藥物、疾病基因的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展新藥物、DNA診斷、基因診斷、基因治療及遺傳病的防治治療及遺傳病的防治 一、疾病相關基因分析一、疾病相關基因分析 1、功能克?。ā⒐δ芸寺。╢uncti

12、onal cloning）：）：根據(jù)基因的功能根據(jù)基因的功能（通常是根據(jù)其蛋白質）產物來尋找、克隆與疾病相（通常是根據(jù)其蛋白質）產物來尋找、克隆與疾病相關的基因關的基因 2、定位克?。?、定位克隆（positional cloning）：）：從一種致病基因從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因 二、制造生物活性蛋白二、制造生物活性蛋白 劉新文，重組DNA技術 三、基因診斷三、基因診斷基因診斷：利用分子生物學的基本原理和技術，在基因診斷：利用分子生物學的基本原理和技術，在DNA或或RNA水平上分析、鑒定與某些疾病有關基因水平上分析、鑒

13、定與某些疾病有關基因的改變（基因結構及其表達水平的異常）的改變（基因結構及其表達水平的異常）遺傳病的產前診斷、感染性疾病的快速診斷、某些遺傳病的產前診斷、感染性疾病的快速診斷、某些腫瘤的早期診斷以及器官移植供體的選擇和法醫(yī)學鑒腫瘤的早期診斷以及器官移植供體的選擇和法醫(yī)學鑒定等定等 四、四、基因治療基因治療 基因治療（基因治療（gene therapy）：）：將某種遺傳物質轉移到將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發(fā)揮作用，從而達到治療疾患者細胞內，使其在體內發(fā)揮作用，從而達到治療疾病目的的方法病目的的方法 劉新文，重組DNA技術 1、基因治療的方法、基因治療的方法（分類）（分類）（1）基

14、因矯正（）基因矯正（gene correction）：）：將致病基因的異將致病基因的異常堿基進行糾正，而保留正常部分常堿基進行糾正，而保留正常部分（2）基因置換（）基因置換（gene replacement）：）：正常基因通過同正?；蛲ㄟ^同源重組，原位置換疾病基因源重組，原位置換疾病基因（3）基因增補（）基因增補（gene augmentation）：）：正常基因非定正?；蚍嵌c整合，補償疾病基因的功能或使原有功能加強點整合，補償疾病基因的功能或使原有功能加強（4）基因失活（）基因失活（gene inactivation）：）：采用各種方式抑采用各種方式抑制或破壞某種基因的表達，如反義制或

15、破壞某種基因的表達，如反義RNA和和RNA干擾干擾(RNAi)技術、核酶與三鏈技術、核酶與三鏈DNA、基因敲除（基因敲除（gene knock-out）等等 劉新文，重組DNA技術概述概述1973，Cohen等人首次使用DNA克隆技術成功一、克隆與克隆化克隆即指同一副本或拷貝（copy）的集合；獲取同一拷貝的過程叫克隆化?！緦嵗扛谓M織分離肝實質細胞單一肝實質細胞繁殖-細胞克隆自眾多分子中分離獲得相同分子，即為分子可隆，在分子生物學和遺傳學領域所談的分子可隆專指DNA可隆.劉新文，重組DNA技術一、質粒的特點：1、環(huán)狀DNA，2kb數(shù)百kb。2、某些質?？梢灾亟M到染色體中復制，形成附加體。質粒

16、載體質粒載體 3、質粒的遺傳信息可以賦予細胞某些性狀（抗藥性等），這些形狀的有無常用于鑒定質粒是否存在于活細胞中。4、質粒復制分兩型嚴謹型、松弛型劉新文，重組DNA技術 松弛控制性質粒，拷貝數(shù)多，不受細胞內染色體控制。5、質粒含易位子和易位現(xiàn)象。易位子是質粒上的特定DNA序列，它可以從所在質粒易位于其它質粒或染色體中，它對細菌的進化有意義。質粒載體質粒載體 嚴謹控制型質粒，拷貝數(shù)少，復制受染色體控制。劉新文，重組DNA技術質粒載體質粒載體理想載體的條件：理想載體的條件：1、具有自主復制能力；、具有自主復制能力；2、具有較多的拷貝數(shù)，易與宿主細胞的染、具有較多的拷貝數(shù)，易與宿主細胞的染色體色體D

17、NA分開；分開；3、分子量相對較小，能夠容納目的基因；、分子量相對較小，能夠容納目的基因；4、具有較多單一限制性內切酶位點；、具有較多單一限制性內切酶位點；5、有一個或多個篩選標記；、有一個或多個篩選標記；6、具有較高的遺傳穩(wěn)定性。、具有較高的遺傳穩(wěn)定性。劉新文，重組DNA技術The constructed plasmid pBR322The constructed plasmid pBR322 質粒載體質粒載體外源基因插入位外源基因插入位點點EcoEcoR R含一個復制起始含一個復制起始點點（oriori）抗藥基因抗藥基因terterr r和和ampampr r1977年由Boliver等人

18、自E.coli的天然質粒建成。1、克隆載體、克隆載體劉新文，重組DNA技術An example of an E.coli expression vector.質粒載體質粒載體2、表達載體、表達載體外源基因插入位點外源基因插入位點復制起始點復制起始點（oriori）標記基因標記基因啟動子啟動子調控序列調控序列核蛋白體結合序列核蛋白體結合序列劉新文，重組DNA技術噬菌體載體噬菌體載體 常用噬菌體：噬菌體載體、M13噬菌體 1、噬菌體載體（1）結構：線性雙鏈DNA，由三個片段組成（左臂、中央、右臂）；感染細菌后，可以形成封閉環(huán)分子。（2）兩類載體置換型載體：適于基因組DNA克隆。插入型載體：適于cD

19、NA克隆。劉新文，重組DNA技術其它類型載體其它類型載體 一、一、柯斯柯斯質粒（質粒（cosmid）二、逆轉錄病毒載體二、逆轉錄病毒載體三、三、Ti質粒質粒 可重組可重組可重組可重組45kb45kb的大片段的大片段的大片段的大片段 適用于動物細胞的基因工程適用于動物細胞的基因工程適用于動物細胞的基因工程適用于動物細胞的基因工程 用于植物細胞基因工程用于植物細胞基因工程用于植物細胞基因工程用于植物細胞基因工程劉新文，重組DNA技術其它類型載體其它類型載體 四四、酵酵母母人人工工染染色色體體（YAC）劉新文，重組DNA技術一、限制一、限制-修復體系修復體系（restriction-modifica

20、tion systemrestriction-modification system）在細菌中與限制性內切酶同時共存有一種甲基化酶，兩種酶共同構成細菌的限制-修飾體系 內切酶：切除限制外源DNA甲基化酶：保護自身DNA限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶劉新文，重組DNA技術二、限制性內切酶分類：二、限制性內切酶分類：依據(jù)酶的組成、所需輔助因子及裂介方式分為三類1、三個亞基組成的限制酶即有內切酶又有甲基化酶活性需ATP供能輔助因子：Mg2+,S腺苷甲硫氨酸切割：特異性差，切割識別位點約400-700bp或更遠的DNA。限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶劉新文，重組DNA技術限制性核酸內切酶限制性核酸

21、內切酶即有內切酶又有甲基化酶活性需ATP供能輔助因子：Mg2+切割：識別位點周圍25-27 bp內2、兩個亞基組成的限制酶 3、一個亞基的限制酶：常稱作限制性內切酶只有內切酶活性，無甲基化酶活性不需ATP供能輔助因子：Mg2+切割：特異位點內劉新文，重組DNA技術酶識別序列結構呈二元旋轉對稱又叫作回文結構(palindrome)限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶【經典舉例經典舉例】Eco RI5端-GAATTC-3端3端-CTTAAG-5端劉新文，重組DNA技術The interaction of EcoRI endo-nuclease with its target sequence.The

22、dimeric enzyme(with its two subunits in gray and light blue)is shown bound to DNA.In the top view the DNA binding site is facing the viewer.In the bottom view the bound DNA is facing away from the viewer and is not visible.限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶劉新文，重組DNA技術限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶 限制性內切酶切割產物：具有5磷酸基和3羥基基團由于酶的作用不同可以

23、產生三種切割末端。（1）5突出末端：如Eco RI 55端端-GAATTC-GAATTC-33端端33端端-CTTAAG-5-CTTAAG-5端端 5 AATTC-35 AATTC-33 G-53 G-5 5-5-G G 333-CTTAA 53-CTTAA 5 酶識別DNA序列的長短不同，一般為4-18bp劉新文，重組DNA技術（3）平頭鈍性末端：如Hpa I限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶55端端-GTTAAC-3-GTTAAC-3端端33端端-CAATTG-5-CAATTG-5端端5-GTT 35-GTT 33-CAA 53-CAA 55 AAC-35 AAC-33 TTG-53 TTG

24、-5（2）3突出末端：如Pst I 55端端-CTGCAG-CTGCAG-33端端33端端-GACGTC-5-GACGTC-5端端 5-CTGCA 35-CTGCA 33-G 53-G 5 5G5G-333 ACGTC-53 ACGTC-5劉新文，重組DNA技術工具酶工具酶 功功 能能 限制性內切酶限制性內切酶 識別特異序列、切割識別特異序列、切割DNADNA DNADNA連接酶連接酶 連接連接DNADNA片段片段 DNADNA聚合酶聚合酶I I 合成合成DNADNA 反轉錄酶反轉錄酶 合成合成cDNAcDNA 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 末端磷酸化末端磷

25、酸化 末端轉移酶末端轉移酶 在在3 3 羥基末端進行多聚物加尾羥基末端進行多聚物加尾 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 劉新文，重組DNA技術基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟1、分、分2、切、切3、接、接5、篩、篩4、轉、轉6、表達、表達劉新文，重組DNA技術基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技術基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技術基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技術一、化學合成法目的基因的獲得目的基因的獲得對已知基因的核苷酸序列，或蛋白質的氨基酸序列，推導對已知基因的核苷酸序列，或蛋白質的氨基酸序列，推導出

26、該多肽編碼的核苷酸序列，用出該多肽編碼的核苷酸序列，用DNADNA合成儀經化學方法合成合成儀經化學方法合成此基因。此基因?！九e例舉例】胰島素原胰島素原、心鈉素等心鈉素等二、基因組DNA文庫（鳥槍無性繁殖法）劉新文，重組DNA技術目的基因的獲得目的基因的獲得OH 3 OH 3 OH 3 Oligo dT primerDouble-strand cDNAOH 3 TTTnT 5 TTTnT 5 3 OHAAAnA5 Poly A tailmRNAReverse transcriptase dNTPsTTTnT 5 AAAnA5 OH 3 cDNAAlkali digestion of mRNA t

27、emplatecDNADNA polymerase IdNTPsAAAnATTTnT 5 OH 3 AAAnATTTnT 5 5 3 S1 nucleaseSingle-stranded hairpin susceptible to S1 nucleasemRNA三三、cDNA文文庫庫的的建建立立劉新文，重組DNA技術目的基因的獲得目的基因的獲得四、DNA聚合酶鏈反應（PCR）劉新文，重組DNA技術重組體構建重組體構建一、一、粘性末端連接粘性末端連接 1 1、同一限制酶切割位點連接，堿基配對結合成重、同一限制酶切割位點連接，堿基配對結合成重組分子。組分子。2 2、不同限制酶切割位點連接，因有相

28、同末端，經、不同限制酶切割位點連接，因有相同末端，經配伍后連接配伍后連接劉新文，重組DNA技術DNA片段片段A DNA片段片段B 5G G A T C CG G A T C C35A G A T C T33C C T A G GC C T A G G53T C T A G A5 不同的限制性內切酶水解不同的限制性內切酶水解混合后經混合后經DNA連接酶連接連接酶連接BamHI BglIIGG G A T C TC C T A G C C T A G A G G G A T C TC C T A G C C T A G A 粘端粘端重組體構建重組體構建配伍末端連接配伍末端連接劉新文，重組DNA技術

29、Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined.重組體構建重組體構建 The optimal substrate for terminal transferase is the 3 OH at the end of a single strand of DNA at least three nucleotides long.粘端的生成粘端的生成劉新文，重組DNA技術二、平端連接二、平端連接 平端在平端在T T4 4連接酶作用下可以連接。連接酶作用下可以連接。三、同

30、聚物加尾連接三、同聚物加尾連接 利用同聚物序列，如聚利用同聚物序列，如聚A A與聚與聚T T之間經退火作用完之間經退火作用完成連接，需末端轉移酶。成連接，需末端轉移酶。四、人工接頭連接四、人工接頭連接 用人工和成某酶切割序列的接頭，與用人工和成某酶切割序列的接頭，與DNADNA平端相連平端相連后形成粘性末端再連接。后形成粘性末端再連接。重組體構建重組體構建劉新文，重組DNA技術重組體構建重組體構建劉新文，重組DNA技術兩個技術：制備感受態(tài)細胞和導入方法。兩個技術：制備感受態(tài)細胞和導入方法。一、感受態(tài)細胞制備一、感受態(tài)細胞制備 經某些方法處理后，具備接受外界經某些方法處理后，具備接受外界DNAD

31、NA 能力的細能力的細胞，稱為感受態(tài)細胞。胞，稱為感受態(tài)細胞。目前常用的多為目前常用的多為E.E.Coli Coli k-12 k-12株的衍生物。株的衍生物。限制酶缺陷型使導入限制酶缺陷型使導入DNADNA免遭降解免遭降解 。重組缺陷型，以保證導入重組缺陷型，以保證導入DNADNA完成獨立存在完成獨立存在 ，不與，不與細菌中基因組細菌中基因組DNADNA重組。重組。重組體導入細胞重組體導入細胞劉新文，重組DNA技術 針對載體攜有某些標志基因或目的基因的篩選方針對載體攜有某些標志基因或目的基因的篩選方法，直接測定基因及表型。法，直接測定基因及表型。1 1、抗藥性標志選擇、抗藥性標志選擇含抗藥性

32、基因的載體（含抗藥性基因的載體（ampampTetTetKamKam）轉入的細轉入的細菌，可在含該藥物的培養(yǎng)板上形成菌斑，進行初步篩菌，可在含該藥物的培養(yǎng)板上形成菌斑，進行初步篩選。選。2 2、標志補救、標志補救導入基因的表達產物與受體菌的營養(yǎng)缺陷互補，利導入基因的表達產物與受體菌的營養(yǎng)缺陷互補，利用營養(yǎng)突變株篩選叫標志補救。用營養(yǎng)突變株篩選叫標志補救。重組子的篩選重組子的篩選一、直接篩選法一、直接篩選法劉新文，重組DNA技術【實例實例】M13M13載體含載體含-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端序列，而突端序列，而突變株細菌中可表達變株細菌中可表達-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端序列，只有在端序列，

33、只有在兩者共同表達時，才有酶的活性。兩者共同表達時，才有酶的活性。x-galx-gal-半乳糖苷酶半乳糖苷酶蘭色蘭色x-galx-gal缺少缺少-半乳糖苷酶半乳糖苷酶白色白色重組子的篩選重組子的篩選劉新文，重組DNA技術 3 3、分子雜交法、分子雜交法：用：用3232p p標記的探針與轉移至硝酸標記的探針與轉移至硝酸纖維素膜上的重組纖維素膜上的重組DNADNA片段進行雜交，直接鑒定目的片段進行雜交，直接鑒定目的基因?；?。用特異的抗體與目的基因的表達產物相互作用進行用特異的抗體與目的基因的表達產物相互作用進行篩選。篩選。二、免疫學方法二、免疫學方法重組子的篩選重組子的篩選劉新文，重組DNA技術

34、重組子的篩選重組子的篩選藍藍藍藍白白白白斑斑斑斑篩篩篩篩選選選選劉新文，重組DNA技術重組子的篩選重組子的篩選Identifying a clone with the desired DNA segment 氨基酸序列氨基酸序列預預測測核核苷苷酸酸序序列列分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交劉新文，重組DNA技術【實例實例實例實例】脆性脆性x x綜合征（綜合征（fragile x syndromefragile x syndrome）：）：一種一種精神癡呆，研究發(fā)現(xiàn)細胞內有些精神癡呆，研究發(fā)現(xiàn)細胞內有些DNADNA含脆性位點，含脆性位點，并鑒定出含脆性位點并鑒定出含脆性位點DNADNA序列的特殊標

35、志，但致病序列的特殊標志，但致病的分子機制不清楚，的分子機制不清楚，19911991年用年用YACYAC克隆及分子雜交克隆及分子雜交技術證明脆性位點是一個（技術證明脆性位點是一個（CGGCGG）n n重復序列。正重復序列。正常人含常人含6-546-54，病人高達數(shù)百個（，病人高達數(shù)百個（200200）。重復序列）。重復序列的增多使所在基因的增多使所在基因FMR-1FMR-1不能轉錄出正確的不能轉錄出正確的mRNAmRNA，受累者出現(xiàn)綜合征。受累者出現(xiàn)綜合征?；蚬こ痰膽没蚬こ痰膽靡?、疾病基因的發(fā)現(xiàn)一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)劉新文，重組DNA技術基因工程的應用基因工程的應用定點突變定點突變劉新文，

36、重組DNA技術基基因因工工程程產產品品劉新文，重組DNA技術A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase is expressed.Light was produced after the plant was watered with a solution containing luciferin,the substrate for this lightproducing enzyme(see Box 13-3,Fig.2).Dont expect glow-in-the-dark ornamental plants at y

37、our local nursery anytime soon;the light is actually quite weak and this photograph represents a 24 hour exposure.The real point-that this technology allows the introduction of new traits into plants-is nevertheless elegantly made.轉轉基基因因植植物物劉新文，重組DNA技術基因工程的應用基因工程的應用轉轉基基因因動動物物劉新文，重組DNA技術 2、基本程序、基本程序（

38、1）治療性基因的選擇）治療性基因的選擇（2）載體的選擇）載體的選擇（3）靶細胞的選擇）靶細胞的選擇（4）基因轉移）基因轉移 直接體內療法：將外源基因轉移到體內特定細胞內，直接體內療法：將外源基因轉移到體內特定細胞內，使外源基因得到表達，從而達到治療的目使外源基因得到表達，從而達到治療的目 間接體內療法（細胞介導）：將外源基因導入合適間接體內療法（細胞介導）：將外源基因導入合適的靶細胞內并使其表達，體外進行細胞增殖后再輸?shù)陌屑毎麅炔⑹蛊浔磉_，體外進行細胞增殖后再輸回病人體內，使基因在體內表達以達到治療的目的回病人體內，使基因在體內表達以達到治療的目的（5）外源基因表達的篩檢）外源基因表達的篩檢（6）回輸體內）回輸體內