過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定

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1、實(shí)驗(yàn)29 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定（高錳酸鉀滴定法） 過(guò)氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系，故常加以測(cè)定。 一、原理 過(guò)氧化氫酶（catalase）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑?？筛鶕?jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的過(guò)氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過(guò)氧化氫。即可求出消耗的H2O2的量。 二、材料、儀器設(shè)備及試劑 （一）材料：小麥葉片 （二）儀器

2、設(shè)備：1. 研缽；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒溫水浴；5. 容量瓶。 （三）試劑：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液；3. 0.1mol/L 高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液稱：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液標(biāo)定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大約等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；5. 0.1mol/L 草酸：稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O4.2H2O 12.607g，

3、用蒸餾水溶解后，定容至1000ml。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）酶液提?。喝⌒←溔~片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)至容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶的粗提液。 （二）取50ml三角瓶4個(gè)（兩個(gè)測(cè)定，另兩個(gè)為對(duì)照），測(cè)定瓶加入酶液2.5ml，對(duì)照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時(shí)計(jì)時(shí)，于30℃恒溫水浴中保溫10min，立即加入10%H2SO42.5ml。 用0.1mol/L KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至出現(xiàn)粉紅色（在3

4、0min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。 四、結(jié)果計(jì)算 酶活性用每g鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的mg數(shù)表示： 過(guò)氧化氫酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）VT/(WVS1.7t) 式中：A對(duì)照KMnO4滴定ml數(shù)；B酶反應(yīng)后KMnO4滴定ml數(shù)；VT提取酶液總量（ml）； VS反應(yīng)時(shí)所用酶液量（ml）；W樣品鮮重（g）；t反應(yīng)時(shí)間（min）； 1.71ml0.1mol/L KMnO4相當(dāng)于1.7mgH2O2。 　過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定　 在植物體中， 黃素氧化酶類的代謝產(chǎn)物常包含H2O2，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸 作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸

5、氧化酶、醛氧化酶等。H2O2的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用， 而過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶則可以清除H2O2， 是植物體內(nèi)重要的活性氧清除系統(tǒng)之一。其活 性還與植物的抗逆性有密切關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)利用高錳酸鉀滴定法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性。 一、原理：過(guò)氧化氫酶屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧， 在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，H2O2則既是氧化劑，又是還原劑。 R(Fe+2)＋H2O2=====R(Fe+3OH-)2 R(Fe+3OH-)2＋H2O2===R(Fe+2)2＋2H2O＋O2 合并上式：2H2O2====2H2O＋O2 據(jù)

6、此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。 在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量） 的過(guò)氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸 鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過(guò)氧化氫。 5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4 即可求出消耗的H2O2量。 二、儀器和用具：研缽、三角瓶50cm34、鐵架、酸式滴定管、恒溫水浴、容量瓶 三、試劑： 10％H2SO4；0.2mol/l磷酸緩沖液pH7.8； 0.1mol/l高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液： 3.1605gKMnO4 (AR) 用新煮沸的

7、蒸餾水配制成1000ml， 用 0.1mol/l的草酸溶液標(biāo)定； 0.1mol/l H2O2： 市售30％H2O2大約等于17.6mol/l， 取30％H2O2溶液5.68ml稀釋至 1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/l KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定。 四、方法： 1. 酶液提?。?取小麥葉片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml 容量瓶中，將研缽沖洗干凈，沖洗液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，并用同一緩沖液定容，4000rpm離心， 上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。 2. 取50ml三角瓶4個(gè) （兩個(gè)測(cè)定兩個(gè)對(duì)照） ，

8、測(cè)定加入酶液2.5ml， 對(duì)照為煮死酶液 2.5ml； 再加入2.5ml 0.1mol/l H2O2，同時(shí)計(jì)時(shí)間，于30℃恒溫水浴中保溫10分鐘，立即加 入10％H2SO4 2.5ml。 3. 用0.1mol/l KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在30分鐘內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。 4. 結(jié)果計(jì)算： 酶活性用每克鮮重樣品在10分鐘內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示： (A-B)*Vt/V1*1.7 酶活（酶分解的H2O2 mg/g鮮重）＝----------------

9、--- W 式中： Ａ-----對(duì)照用KMnO4 ml數(shù) Ｂ-----酶反應(yīng)后KMnO4滴定ml數(shù) Ｖt----酶液總量ml Ｖ1----反應(yīng)所用酶液量ml Ｗ-----樣品鮮重(g) 1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4相當(dāng)于1.7mg H2O2 [注意]．所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要經(jīng)過(guò)標(biāo)定，0.1mol/l H2O2要新配制。 實(shí)驗(yàn) 48 過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定（

10、比色法） 過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有密切關(guān)系，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，它的活性不斷發(fā)生變化，因此測(cè)量這種酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。 一、原理 在有過(guò)氧化氫存在下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在 470 nm 處有最大吸收，可用分光光度計(jì)測(cè)量 470 nm 的吸光度變化測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。 二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）實(shí)驗(yàn)材料 馬鈴薯塊莖。 （二）試劑 1 ． 100 mmol ／ L 磷酸緩沖液 pH6.0 （見(jiàn)附錄）。 2 ．反應(yīng)混合液： 100 m

11、mol ／ L 磷酸緩沖液（ pH6.0 ） 50 mL 于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚 28 μl ，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入 30 % 過(guò)氧化氫 19 μl ，混合均勻，保存于冰箱中。 （三）儀器設(shè)備 分光光度計(jì)，研缽，恒溫水浴鍋， 100 mL 容量瓶，吸管， 離心機(jī)。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1 ．稱取植物材料 1 g ，剪碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿，以 4000 r ／ min 離心 15 min ，上清液轉(zhuǎn)入 100 mL 容量瓶中，殘?jiān)儆?5 mL 磷酸緩沖液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，貯于低溫下備用。 2

12、．取光徑 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反應(yīng)混合液 3 mL 和磷酸緩沖液 1mL ，作為對(duì)照，另 1 只中加入反應(yīng)混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性過(guò)高可稀釋之），立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間，于分光光度計(jì)上測(cè)量波長(zhǎng) 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 讀數(shù)一次。 四、結(jié)果計(jì)算 以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min g （鮮重） ] 表示之。也可以用每 min 內(nèi) A 470 變化 0.01 為 1 個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（ u ）表示。 過(guò)氧化物酶活性 [u/ （ g min ） ]= 式中： Δ A 470 ——反應(yīng)

13、時(shí)間內(nèi)吸光度的變化。 W ——植物鮮重， g 。 V T ——提取酶液總體積， mL 。 V s ——測(cè)定時(shí)取用酶液體積 , mL 。 t ——反應(yīng)時(shí)間， min 。 蒲圻貝母Fritillaria puqiensis G.D.Yu et G.Y.Chen是貝母屬中一新種，其有效成分生物堿含量較高，止咳效果顯著［1，2］。其中的蒲貝酮堿的效果與可待因相似，且無(wú)成癮性，已被國(guó)家新藥辦立項(xiàng)進(jìn)行一類新藥開(kāi)發(fā)。但由于蒲圻貝母以野生為主，連年的采挖已使其資源逐漸枯竭，難以為新藥開(kāi)發(fā)提供資源保證，為此我們對(duì)其進(jìn)行了組織培養(yǎng)。蒲圻貝母鱗莖切塊培養(yǎng)22d左右，可直接從切片邊緣長(zhǎng)出多個(gè)小鱗莖，以

14、后小鱗莖逐漸長(zhǎng)大。為了探討鱗莖發(fā)生的機(jī)理，并為研究提高組培貝母鱗莖的生長(zhǎng)率，誘發(fā)多鱗莖形成的方法，我們?cè)谂囵B(yǎng)的不同時(shí)期取材，對(duì)鱗莖形成過(guò)程中的可溶性蛋白，過(guò)氧化物酶及酯酶同工酶的酶譜變化進(jìn)行了分析。 1　材料和方法 1.1　材料 　　蒲圻貝母F.puqiensis取自湖北省蒲圻市，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)生藥教研室李萍博士鑒定。 　　新鮮的蒲圻貝母鱗莖在流水下沖洗3h，0.1%氯化汞表面消毒20min，無(wú)菌水沖洗5次，切成0.5cm0.5cm0.2cm的小塊接種于MS附加BA 2mg/L-1，IAA 1mg/L-1的培養(yǎng)基上，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)，獲得無(wú)菌材料。分別在培養(yǎng)的不同時(shí)間取材，并以未

15、進(jìn)行培養(yǎng)的新鮮貝母鱗莖為對(duì)照，進(jìn)行可溶性蛋白，過(guò)氧化物酶及酯酶同工酶酶譜分析。 1.2　方法 1.2.1　試劑的配制與凝膠的制備：參考文獻(xiàn)［3］的方法。分離膠濃度為7.5%，間隔膠濃度為2.5%。 1.2.2　樣品制備：稱取新鮮的貝母鱗莖1g，在低溫冰箱內(nèi)放置1h后，加少許石英砂，加3ml提取緩沖液(0.1mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，其中含0.5mol/L蔗糖，0.06mol/L抗壞血酸，0.006mol/L半胱氨酸)，在低溫下研磨后離心 20min，5000r/min，取上清液置-20℃下保存。 1.2.3　電泳：采用垂直板式聚丙烯酰胺凝膠電泳，加入溴酚藍(lán)作為指

16、示染料。穩(wěn)定電流強(qiáng)度為12～24mA?？扇苄缘鞍椎狞c(diǎn)樣量為50μl，用含0.05%考馬斯亮藍(lán)的12.5%三氯乙酸溶液染色4h。過(guò)氧化物同工酶的點(diǎn)樣量為30μl，用抗壞血酸-聯(lián)苯胺染液染色，其組成為抗壞血酸70.4mg，聯(lián)苯胺儲(chǔ)存液20ml(2g聯(lián)苯胺溶于18ml文火加熱的冰醋酸中，再加水72ml)，0.6%過(guò)氧化氫20ml，水60ml。酯酶同工酶的點(diǎn)樣量為50μl，按薛應(yīng)龍［4］方法，即凝膠在0.2mol/L，Tris-HCl緩沖液(pH 7.1)預(yù)浸10min，然后移入含有7%醋酸-α-萘酯的丙酮溶液0.5ml，堅(jiān)牢藍(lán)12.5mg，0.2mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.1)1ml，水23.4ml的染色液中染色10～30min，棕紅色的同工酶譜帶即呈現(xiàn)。 2　結(jié)果與分析 　　按譜帶顏色的深淺程度將其劃分為重帶、次重帶、輕帶，并按遷移率的大小劃分為3個(gè)區(qū)，Rf在0.1～0.3為慢速區(qū)(A)，在0.4～0.6為中速區(qū)(B)，在0.7～0.9為快速區(qū)(C)。