生物化學課件 第五章蛋白質的共價結構

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1、第五章蛋白質的共價結構 1952年丹麥人年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質最早提出蛋白質的結構可以分成四個層次的結構可以分成四個層次: 一級結構：一級結構： 二二級結構：級結構： 三三級結構：級結構： 四四級結構：級結構： 1969年正式將一級結構定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。年正式將一級結構定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。 介于二級結構和三級結構之間還存在超二級結構（二級結介于二級結構和三級結構之間還存在超二級結構（二級結構的組合）和結構域（在空間上相對獨立）這兩個層次。構的組合）和結構域（在空間上相對獨立）這兩個層次。蛋白質的結構層次蛋白質的結構層次蛋白質結構層次肽基

2、的肽基的C、O和和N原子間的共振相互作用原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結果：共振產(chǎn)生的重要結果： 限制繞肽鍵的自由旋轉限制繞肽鍵的自由旋轉 形成酰胺平面形成酰胺平面 產(chǎn)生鍵的平均化產(chǎn)生鍵的平均化 肽鍵呈反式構型肽鍵呈反式構型sp2sp2sp2sp3共振雜化體共振雜化體 最小的蛋白質，由最小的蛋白質，由A鏈鏈(21 AA)和和B (30 AA)組成；動物胰腺組成；動物胰腺細胞分泌的一種激細胞分泌的一種激素素,告訴細胞往里面運輸糖、氨基酸、告訴細胞往里面運輸糖、氨基酸、K+； 1921年年Banting & Best 從胰腺中抽提從胰腺中抽提出了有活性的胰島素，出了有活性的胰島素，1923年年

3、Banting & Macleod獲獲Nobel醫(yī)學獎；醫(yī)學獎； 194353年，年，Sanger確定了牛胰島素確定了牛胰島素的一級結構，的一級結構，1958年獲得年獲得Nobel化學獎；化學獎； 1981年，年，Berg（因因DNA重組技術得獎）重組技術得獎）在大腸桿菌中表達了人胰島素在大腸桿菌中表達了人胰島素.蛋白質一級結構測定的步驟蛋白質一級結構測定的步驟1、蛋白質的分離純化、蛋白質的分離純化、測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目3、亞基分離亞基分離4、二硫鍵的拆分與保護二硫鍵的拆分與保護5、分析每一多肽鏈的氨基酸組成分析每一多肽鏈的氨基酸組成6、鑒定鑒定多肽鏈的多肽

4、鏈的N-末端和末端和C-末端殘基末端殘基7 、多種方法的部分水解多種方法的部分水解8、測序測序 9、重疊重疊10 、二硫鍵位置的確定二硫鍵位置的確定一級結構測定策略蛋白質一級結構測定步驟氨基酸與氨基酸與2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯( (DNFB)DNFB)的反應的反應（sangersanger反應）反應）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色黃色)+ HF弱堿中弱堿中氨基酸氨基酸SangerSanger試劑試劑( (FDNB)FDNB)標記標記N N末端末端Sanger試劑標記反應ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A

5、,*A+B, *A+B+C+D+E*A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 結論結論：A B C D ESanger試劑標記測序H2NCHCOOH + RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.7 40NCH3CH3O=S=OHNCHCOOH RDNS-氨基酸取代DNFB測定蛋白質N端氨基酸，靈敏度高?；磻被崤c苯異硫氰酯（氨基酸與苯異硫氰酯（PITCPITC）的反應的反應（EdmanEdman反應）反應）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內酰硫脲衍生物苯乙內酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydan

6、tion-AA）弱鹼中弱鹼中(400 C)(硝基甲烷硝基甲烷 400 C)H+Edman 降解法降解法(I)DABITC DABITC ：有色有色EdmanEdman試劑試劑在在EdmanEdman試劑上加發(fā)色基團試劑上加發(fā)色基團Edman降解法1Edman 降解法降解法(II)Edman降解法2 瑞典人瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19 1946-47年在美國留學時想到改進年在美國留學時想到改進1930 年年Abderhalden & Brockmann發(fā)明的發(fā)明的 PITC試劑的反應試劑的反應, 50年發(fā)明年發(fā)明Edman degradation反應反應. 1957年移居墨爾

7、本年移居墨爾本, 遠離國際學術中心開始遠離國際學術中心開始 過隱居生活過隱居生活,1967年研制的自動化儀器可以達到每小時一個年研制的自動化儀器可以達到每小時一個氨基酸的速度氨基酸的速度; 他堅持不申請專利他堅持不申請專利, 給了美國公司得以隨便開給了美國公司得以隨便開發(fā)儀器的方便發(fā)儀器的方便. 1972年到德國年到德國,77年因腦瘤過世年因腦瘤過世. 由于由于Edman降解產(chǎn)物需要在紫外域進行檢測降解產(chǎn)物需要在紫外域進行檢測, 只有只有HPLC和和相應的紫外檢測手段進步后才得到普及相應的紫外檢測手段進步后才得到普及;60年代后期年代后期Moore & Stein利用該反應測定了利用該反應測定

8、了RNase的一級結構的一級結構, 遺憾的是遺憾的是Edman沒有和他們分享沒有和他們分享Nobel化學獎化學獎. + + + 肼肼法測定法測定肼法C端測定 利用外切蛋白水解酶利用外切蛋白水解酶 () 將肽鏈的氨基酸從將肽鏈的氨基酸從N端端 ()或或C端端 () 一個接一個游一個接一個游離出來，離出來， 在不同時間取樣進行分析，根在不同時間取樣進行分析，根據(jù)所游離的氨基酸的摩爾數(shù)的多少來判據(jù)所游離的氨基酸的摩爾數(shù)的多少來判斷氨基酸的排列順序斷氨基酸的排列順序。酶解法末端測序酶解法末端測序酶解法末端測序肽鍵的專一性水解肽鍵的專一性水解( (化學法化學法) )化學法化學法: BrCN, H+, N

9、H2OH, etc化學法專一性水解消化道內幾種蛋白酶的專一性消化道內幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）（脂肪族）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶（Phe. Trp）胰蛋白酶（胰蛋白酶（trypsin）；）；胰糜乳蛋白酶（胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；）；嗜熱菌蛋白酶（嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）；）；木瓜蛋白酶（木瓜蛋白酶（papain）；）；胃蛋白酶（胃蛋白酶（pepsin）；）；枯草桿菌堿性蛋白酶（枯草桿菌堿性蛋白酶（subtilisin）肽鍵的專一性

10、水解肽鍵的專一性水解( (酶法酶法) )酶法專一性水解氨基酸的鑒定、分離純化氨基酸的鑒定、分離純化PTH-AA氨基酸的確定太短在多肽鏈中次序的決定 資料：N-末端殘基H,C-末端殘基S; 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO 借助重疊肽確定肽段次序： 末端殘基 H S 末端肽段HOWT APS 或 OUS 第一套肽段：HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段：HO WTOU SEO VERL APS 推斷全序列: HOWTOUSEOVERLAPS二硫鍵的斷裂：二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?/p>

11、8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。胰島素胰島素 -巰基乙醇巰基乙醇碘乙酸碘乙酸二二硫硫鍵鍵的的斷斷裂裂確定原多肽鏈重二硫鍵的位置：確定原多肽鏈重二硫鍵的位置： 一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。二硫鍵的切割與保護二硫鍵的切割與保護二硫鍵的保護1、為防止、

12、為防止跟跟發(fā)生交換反發(fā)生交換反應，先將自由應，先將自由SH基封閉基封閉;2、進行專一性部分水解、進行專一性部分水解;3、紙層析分離水解產(chǎn)物、紙層析分離水解產(chǎn)物;4、氣相過甲酸法切斷、氣相過甲酸法切斷鍵，作第二鍵，作第二相紙層析相紙層析;5、將遷移率發(fā)生變化的多肽進行測序、將遷移率發(fā)生變化的多肽進行測序經(jīng)典的二硫鍵位置的確定法經(jīng)典的二硫鍵位置的確定法二硫鍵位置確定對角線電泳示意圖對角線電泳示意圖末端測序的用途常利用蛋白質數(shù)據(jù)庫常利用蛋白質數(shù)據(jù)庫蛋白質氨基酸順序與生物功能蛋白質氨基酸順序與生物功能研究蛋白質一級結構與功能的關系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關系。 進行這方面的研究常

13、用的方法有：同源蛋白質氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學修飾及切割實驗等。 例例1 鐮刀形貧血病鐮刀形貧血病l患者血紅細胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S）l它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化l（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基l使血紅蛋白細胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血l這說明了蛋白質分子結構與功能關系的高度統(tǒng)一性蛋白質一級結構的個體差異蛋白質一級結構的個體差異例例2 一級結構的局部斷裂與蛋白質的一級結構的局部斷裂與蛋白質的激活激活 體內的某些蛋白質分子初合成時，常帶有抑制肽，呈無活性狀

14、態(tài)，稱為蛋白質原.蛋白質原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時，是一個比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號肽.信號肽被切去，剩下的是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當C肽被切除后才成為有51個殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.例例3 同源蛋白同源蛋白 同源蛋白：是指在不同有機體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質.同源蛋白中的一級結構中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關系的遠近.例：細胞色素Cl60

15、 個物種中，有 27 個位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.l可變殘基可能隨著進化而變異，而且不同種屬的細胞色素 C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關系相關。親緣關系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進化樹）.黃色： 不變殘基（invariable residues）藍色 ： 保守氨基酸（conservative residues）未標記：可變殘基（variable residues）不不同同生生物物來來源源的的細細胞胞色色素素c c中中不不變變的的AAAA殘殘基基141061001343230292718176759525148454138878482

16、80706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素血紅素細胞色素細胞色素c c分子的空間結構分子的空間結構不變不變的的AAAA殘基殘基 38個不變的個不變的AA殘基，是殘基，是Cyt C 的生物功能所不的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構象；有的可缺少的。其中有的可能參加維持分子構象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與可能參與電子傳遞；有的可能參與“識別識別”并結合并結合細胞色素還原酶和氧化酶。細胞色素還原酶和氧化酶。不同生物與人的不同生物與人的CytcCytc的的AAAA差異數(shù)目差異數(shù)目生物生物 與人不同的與人不同的AAAA數(shù)目數(shù)目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、豬、羊、狗牛、豬、羊、狗 11馬馬 12雞、火雞雞、火雞 13響尾蛇響尾蛇 14海龜海龜 15金槍魚金槍魚 21角餃角餃 23小蠅小蠅 25蛾蛾 31小麥小麥 35粗早鏈孢霉粗早鏈孢霉 43酵母酵母 44