《發(fā)酵工程》第3章培養(yǎng)基的制備與滅菌

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1、 第三章培養(yǎng)基的制備 教學(xué)內(nèi)容（4學(xué)時）： ?了解培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，掌握培養(yǎng)基的類型和用途 ?了解發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇，了解原料轉(zhuǎn)換的意義 O了解淀粉水解糖的制備方法 O了解生物合成的前體物質(zhì)及促進(jìn)劑 第一節(jié)培養(yǎng)基的原材料 ? 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 ? 培養(yǎng)基的類型 ? 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇 ? 原料轉(zhuǎn)換及意義 一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及用途 碳酸氣 淀粉水解糖、糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等 石油、正構(gòu)石蠟、天然氣 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品 ?功能：提供能量、構(gòu)成菌體、代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ); '有機氮：黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、蛋白膿、酵母粉、魚粉、發(fā)酵菌絲體、酒糟水等

2、 無機氮：尿素、硫酸銹、氨水、硝酸鹽 功能：構(gòu)成菌體、含氮代謝物； 磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽等礦物鹽 3.無機鹽 鐵、猛、鉆等微量元素 功能：構(gòu)成菌體，參與酶的組成，維持酶活性,調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH值，維持氧化還原電位; 4.特殊生長因子：硫胺素、生物素、對氨基苯甲 功能：酶的輔助部分，維持生命活動; ?5.發(fā)酵的促進(jìn)劑與抑制劑 ?發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入有利于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長，這些物質(zhì)包括前體、促進(jìn)劑和抑制劑 ?1）、前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)沒有多大的變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量

3、卻因加入前體而有較大的提高。 如：在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素產(chǎn)量可從20u/mL增加到100u/mL,研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中的苯乙胺被有限結(jié)合到育霉素分子中，從而提高了青霉素G的產(chǎn)量。 半胱氨酸 側(cè)鏈 母核6APA ? 3）、抑制劑：在發(fā)酵過程中加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時會使另外一些代謝途徑活躍,從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來。 ? 例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如亞硫酸氫鈉，它與代謝過程中的乙醛生成加成物。 ? 6.水分 ?功能：生化反應(yīng)均在水溶液中進(jìn)行 二、培養(yǎng)基的類型 ? 1.依營養(yǎng)物質(zhì)的來源分類 ? 天

4、然培養(yǎng)基； ? 合成培養(yǎng)基，也稱組合培養(yǎng)基（多用于定量研究）： ? 半合成培養(yǎng)基，（用的最多，在部分天然有機碳源、氮源、生長因子的基礎(chǔ)上，適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品）； ? 2.依培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分： ? 1）固體培養(yǎng)基 ? A、凝固培養(yǎng)基：即遇熱可融化，冷卻后則凝固的固體培養(yǎng)基 ? B、非可逆性凝固培養(yǎng)基：指有血清凝固成的固體培養(yǎng)基或由無機硅膠配成的凝固后即不能再融化的固體培養(yǎng)基 ? C、天然固體培養(yǎng)基：由天然固體狀基質(zhì)直接制成的培養(yǎng)基，如數(shù)皮，米糠，木屑等 ? D、濾膜：是一一種堅韌且?guī)в袩o數(shù)微孔的醋酸纖維湖膜，把它制成圓片狀覆蓋在營養(yǎng)瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維襯墊上，形成了具有固

5、體培養(yǎng)基性質(zhì)的培養(yǎng)條件。 ?2）半固體培養(yǎng)基 ?再配置號的液體培養(yǎng)基中加入0.5%左右的瓊脂作為凝固劑，形成的培養(yǎng)基稱之微半固體培養(yǎng)基。 ?主要用于菌種鑒定，觀察細(xì)菌運動特征及噬菌體的效價測定等 ?3）液體培養(yǎng)基； ?培養(yǎng)基中80?90%是水。 ? 3.依培養(yǎng)基的用途來分 ? 1）、池子培養(yǎng)基 ? 2）、種子培養(yǎng)基 ? 3）、發(fā)醉培養(yǎng)基 ? 4）、補料培養(yǎng)基 ? 5）、加富培養(yǎng)基 ? 6）、選擇培養(yǎng)基 ? 7）、鑒別培養(yǎng)基 ? 8）、增殖和保存培養(yǎng)基 ? 9）、富集培養(yǎng)基 ? 10）、測定培養(yǎng)基 三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇 ? 一）、配置培養(yǎng)基的原則 ? 1、根

6、據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基 ? 2、注意各營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配匕 ? 3、調(diào)節(jié)適宜的物理化學(xué)條件 ? 4、根據(jù)培養(yǎng)微生物的FI的配置 ? 5、盡量使用廉價易得的原料 二）、配置培養(yǎng)基的方法 ? 1、生態(tài)模擬 ? 2、查閱文獻(xiàn) ? 3、借助優(yōu)選法或正交試驗法精心設(shè)計培養(yǎng)基配方 ? 4、實驗比較 ?實驗的規(guī)模-?般由定性到定量，由小到大。 ?發(fā)酵培養(yǎng)基的用途與要求、成分、配比經(jīng)實驗確定，配制時兼顧原料來源、成本及工藝管理； 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇程序 門要了解生產(chǎn)菌種的來源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營養(yǎng)要求； ?對生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)

7、物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等要有所了解 3應(yīng)先以合成培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，先進(jìn)行推瓶試驗，再進(jìn)行小型發(fā)醉罐培養(yǎng)，探索此生產(chǎn)菌種對各種主要有機碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力 要注意培養(yǎng)過程中的pH值變化，比較適于菌體生長繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的pH值差異，不斷調(diào)整在初步研究的基礎(chǔ)之上，先確立一個培養(yǎng)基配比；再進(jìn)行各種重要的金屬和非金屬離子的影響試驗，試驗各種無機鹽的最高、最低和最合的用量 在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)基試驗，探討各種發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的關(guān)系。 如培養(yǎng)過程中的pH值變化與培養(yǎng)法各種組成的關(guān)系。 I、原料轉(zhuǎn)換及意義 1、節(jié)約原料，減低單耗，

8、提高發(fā)酵單位和總收率； 2、開拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、植物纖維、木屑水解物、石蠟、醋酸、乙醇 日本1959年開始研究由醋酸發(fā)酵生成谷氨酸的工藝，并于1968年由味之索公司設(shè)廠制造，為發(fā)酵法制造谷氨酸由“糧食發(fā)酵”轉(zhuǎn)入“無糧發(fā)酵”奠定了基礎(chǔ)。 谷氨酸發(fā)酵原料：最初用葡萄糖，以后改用淀粉水解糖液或普粉水解糖液，產(chǎn)糖地區(qū)則采用價格低廉的糖蜜為原料 ?隨著石油化工的發(fā)展，合成醋酸和乙醇的產(chǎn)量逐年增加，醋酸和乙醇作為一種新型發(fā)酵原料,越來越受到重視。近年來，國外乙醛代糧發(fā)酵的研究取得了重大進(jìn)展，除抗生素外，幾乎所有用糧食發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品，如氨基酸、有機酸、酶制劑、單細(xì)胞蛋白、糖類

9、、脂肪、維生素、核酸類物質(zhì)等，都可以用乙醇為碳源發(fā)酵生產(chǎn)。 第二節(jié)淀粉水解糖的制備 ? 一、淀粉水解糖的制備方法 ? 1、酸解法： ? 定義：以酸（無機酸或有機酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法. ? 優(yōu)點：設(shè)備要求簡單，水解時間短（20min）,設(shè)備生產(chǎn)能力大 ? 缺點：高溫高壓下進(jìn)行，設(shè)備要求耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，副反應(yīng)多，對原料要求嚴(yán)格，淀粉顆粒不宜過大，淀粉乳濃度不能過高。 ? 2、酶解法：（雙酶水解法） ? 定義：用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過程。一般分為兩步：第一步是利用a—淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個過程稱為液化。第

10、二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，稱為糖化。也稱雙酶法 a?淀粉隨（液化） 葡萄糖淀粉酶（糖化） 優(yōu)點：1、反應(yīng)條件溫和。 2、酶的專一性強，副反應(yīng)少 3、可在較高的淀粉乳濃度下水解 4、糖液的營養(yǎng)物質(zhì)豐富 5、糖液色澤淺，無苦味，有利于糖液的精制缺點：時間長（2-3）天，要求的設(shè)備多，糖液過濾困難。 酶結(jié)合法 ?酸醯法 ?酣酸法 1）酸酶法 ? 事先將淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酣將其水解為葡萄糖 ? 玉米、小麥等谷類淀粉，淀粉顆粒堅實，如用。一淀粉酶在短時間內(nèi)液化往往不徹底。 ? 酸液化速度快，且糖化是由酶來進(jìn)行的，對液化液

11、要求不高，可采用較高的淀粉乳濃度，提高生產(chǎn)效率。用酸量較少，產(chǎn)品顏色淺，糖液質(zhì)量高。 2）酶酸法 ? 先用Q—淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖 ? 有些原料（如碎米淀粉），顆粒大小不一，酸法水解不均勻，出糖率低，故采用先經(jīng)淀粉酶液化，過濾除雜質(zhì)后再酸水解 ? 能采用粗原料淀粉，淀粉濃度較酸法高，生產(chǎn)較易控制，時間短。而且酸水解pH稍高，可減少副產(chǎn)物的形成，糖液色澤較淺。 表2-2不同糖化工藝糖化質(zhì)量比較 二、淀粉酸水解理論基礎(chǔ) ? 淀粉水解成葡萄糖的反應(yīng)過程中同時發(fā)生著：水解反應(yīng)、復(fù)合反應(yīng)、分解反應(yīng)；其中水解反應(yīng)是主要的。 ? 復(fù)合反應(yīng)：葡萄糖分子問經(jīng)1?6糖苜鍵結(jié)合

12、成龍膽二糖（有苦味）、異麥芽糖和其他低聚糖（合稱復(fù)合低聚糖）。 ? 分解反應(yīng)：葡萄糖O羥甲基糠醛—＞仃機酸、色素等 ㈠淀粉的水解反應(yīng) ?2、淀粉酸水解反應(yīng)動力學(xué) 屬于單分子一級反應(yīng)de1 類型：=K9C K：反應(yīng)速度常數(shù)，出 由反應(yīng)條件（如溫度、 酸度等）而定 C:淀粉濃度 de 一了濃度對時間求導(dǎo)，濃度的降低 ? 3、影響酸水解的因素 ? ［酸的種類 ? 主要因素濃度（酸的濃度、淀粉的濃度）水解溫度 ? （二）、葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)及其影響因素 ? 復(fù)合反應(yīng)：在淀粉的酸糖化過程中，水解生成的葡萄糖受酸和熱的影響，葡萄糖分子之間通過糖昔鍵相聚合，生成二糖、

13、三糖及其他低聚糖。 ?2.、酸的影響: （三）葡萄糖的分解反應(yīng)及其影響因素 ? 葡萄糖—■羥甲基糠醛二＞乙酰丙酸、蟻酸、有色素物質(zhì)； ? 影響因素：濃度、溫度、pH值; 第三節(jié)糖蜜前處理 一、糖蜜的來源與特點 ?糖蜜的干物質(zhì)濃度很高，約80~90Bx,含糖量在50%以上，另含5%~12%的膠體物質(zhì)和10%?12%灰分，此外產(chǎn)酸細(xì)菌多，某些糖蜜還含有較多的生物素。如不進(jìn)行預(yù)處理，則微生物難于生長和發(fā)酵。近年來，由于制糖技術(shù)提高，糖蜜中糖的含量大大降低，可發(fā)酯性糖減少，非發(fā)醉性糖增加，膠體物質(zhì)和灰分也顯著增加，因此，糖蜜發(fā)醉前必須進(jìn)行預(yù)處理。 ?一、糖蜜的來源與特點

14、 ?二、糖蜜前處理的方法 ?1、加酸通風(fēng)沉淀法（冷酸通風(fēng)處理法）：糖蜜加水稀釋到500Bx=＞加入0.2?0.3%濃硫酸，通入壓縮空氣1h^^＞靜置澄清8h,取上清液。 2、加熱加酸沉淀法（熱酸通風(fēng)沉淀法）： 糖蜜加水稀釋到40%=＞加適量硫酸調(diào)節(jié)pH值到4?4.5=＞放入澄清槽加熱至80?90℃,通風(fēng)30min保，0?80℃8?紿心 時，取上清液。 ?糖蜜稀釋至30?40Bx-＞加硫酸調(diào)pH3~ 3.8==加熱至90℃添加8Ppm聚丙烯 酰胺（PAM）,攪拌均勻一＞靜置1小時，取上清液。 三、谷氨酸發(fā)酵糖蜜預(yù)處理 ? 樹脂處理法 ? 亞硝酸處理法 ?

15、2.添加化學(xué)藥劑處理法 ? 添加青霉素法 ? 添加表面活性劑 ? 添加抗氧劑法 ? 3,追加糖蜜法 ? 4.營養(yǎng)缺陷型變異株法 心磷脂一 磷膈跳甘油 磷脂酰肌葬 磷脂質(zhì) n ?石蠟 璘脂皖肌醉二甘II糖昔 量氣乙二靜 十七酸鹽 細(xì)胞膜細(xì)胞壁 小磷酸甘油 N酸二峻丙酮 石蠟為碳源的磷脂合成途徑 乙酰CoA （拮抗）-- 檸椽戰(zhàn) 3 ?瞬酸甘油聯(lián) 乙限 \\ \\ \\ II H // // ci*KG A L-GA -—糖質(zhì)或18酸為碳源的磷腳合成途徑 —表面活性劑拮抗作用部位 皿＞ 油酸缺陷型遺傳阻礙部位 =＞甘油缺陷我的遺傳阻礙部位

16、 細(xì)前細(xì)胞谷氨酸排出控制機制 ?一、纖維素及發(fā)酵廢液的處理 ? （一）、利用纖維素廢料生產(chǎn)SCP ? 稻草、麥稈、玉米的莖和葉、甘蔗渣、廢 紙等 ? 流程如下： I濃縮I干燥|磨碎）|＞［成品） 酸中和濾液生產(chǎn) 慟:用茵利a［:面］卜級種司［ JL［ ［一級種A?■ 中和廢液 II k「鹽酸調(diào)PH3.5 P［發(fā)酵］ 1離心分離）—1^3—膂鶻. 輸J—粉碎J—［包裝） 二、亞硫酸鹽廢液的處理 （一）亞硫酸鹽制漿廢液生產(chǎn)酒精和蛋臼質(zhì) 1、亞硫酸鹽造紙制漿廢液生產(chǎn)酒精 2、亞硫酸鹽紙漿廢液發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì) 3、亞硫酸鐵法非木材制

17、漿廢液培養(yǎng)SCP （-）亞硫酸鹽廢液發(fā)醉生產(chǎn)乳酸三、木屑水解液發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸 第五節(jié)培養(yǎng)基滅菌 ? —W消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的. ? 消戲：指用物理和化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽抱。 ? 火苗：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽泡和泡子。 ? 消滅雜菌和防止雜菌污染 ? 二、滅菌方法：干熱滅菌、濕熱

18、滅菌、物理滅菌（射線、微波等）、化學(xué)滅菌（各種化學(xué)藥品）； ? 1、干熱滅菌法 ? 灼燒滅菌、在電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱主要用于保持干燥的物料、器具等 紫外線、高速電子流的陰極射線、X射線和Y射線 ?化學(xué)藥品滅菌法 （1）第一大類：表面消毒劑 優(yōu)點：1）蒸汽來源容易，操作費用低廉，本身無毒 2）蒸汽具有很強的穿透力，滅菌易于徹底 3）蒸汽均有很大的潛熱，冷凝后的水分有利于濕熱滅菌 4）蒸汽輸送可.借助本身的壓強，調(diào)直方便，技術(shù)管理容易 缺點：1）設(shè)備費用高 2）不能用于怕受潮的物料滅菌 ? 3、射線滅菌 2、濕熱滅菌法 借助蒸汽釋放的熱使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。 ?高鎰酸鉀溶液：0.1?0.25%、漂白粉、75%的酒精、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛37%、戊二醛、過氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類