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1、 重組重組DNADNA技術技術Recombinant DNA technologyRecombinant DNA technology( (基因工程基因工程Genetic Engineering)Genetic Engineering)第二十一章第二十一章1. 化學合成法化學合成法要求：已知核苷酸序列或氨基酸序列要求：已知核苷酸序列或氨基酸序列 。2. 基因組基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)（一）化學合成法獲取目的基因（一
2、）化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。序列。 基因組基因組DNA (genomic DNA，gDNA) 指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體染色體及線粒體)的所有的所有DNA序列。序列。 （二）從基因組（二）從基因組DNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應
3、 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫用隨機切割的真核用隨機切割的真核生物染色體生物染色體DNA片段構建基因文庫片段構建基因文庫 gDNA文庫構建文庫構建AAAAAAAAAATTTTTTTTTTT逆轉錄酶逆轉錄酶Klenow片段片段cDNA (complementary DNA)（三）從（三）從cDNAcDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉錄酶反轉錄酶 載體載體 受體菌受
4、體菌 復制復制逆轉錄酶逆轉錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T 人工突變?nèi)斯ね蛔?（四）通過（四）通過PCRPCR獲取目的基因獲取目的基因 Agarose Gel ElectrophoresisGel Extraction and DNA Recovery攜帶目的基因，實現(xiàn)其攜帶目的基因，實現(xiàn)其繁殖繁殖或或表達表達所用的所用的DNA。克隆載體克隆載體(cloning vector)使外源使外源DNA被被擴增擴增表達載體表達載體(expression vector)使外源使外源DNA可可轉錄翻譯轉錄翻譯成成 多肽鏈多肽鏈
5、載體的選擇標準：載體的選擇標準：能自主復制；能自主復制；具有遺傳標記，便于篩選和鑒定；具有遺傳標記，便于篩選和鑒定；有多克隆位點（外源有多克隆位點（外源DNA插入點；插入點；容納較大外源容納較大外源DNA。（一）質粒（一）質粒 (plasmid)(plasmid)特點特點: : 能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克?。┛寺。ǘǘ?噬菌體噬菌體(phage) (phage) M13噬菌體
6、噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因） 酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細菌人工染色體細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒動物病毒DNA改造的載體改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）（三）其他載體（三）其他載體常用工具酶常用工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉錄酶逆轉錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉移酶末端轉移酶 Taq DNA聚合酶
7、聚合酶重組重組DNA技術中常用的工具酶技術中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DN
8、A聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，第二鏈合成，雙鏈雙鏈DNA 3 末端標記等末端標記等反轉錄酶反轉錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標記或進行填補，標記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶末端轉移酶在在3 羥基末端進行同質多聚物加尾羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCC
9、TAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease)識別識別DNA特異序列特異序列, 并在識別位點或周圍切割雙鏈并在識別位點或周圍切割雙鏈DNA的內(nèi)切酶。的內(nèi)切酶。酶酶 切切 反反 應應 的的 基基 本本 步步 驟驟電泳紫外分析37 1h加反應液CKMBuffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT方式：方式：(1)同一限制酶切位點連接同
10、一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接1. 粘性末端連接粘性末端連接Bam H切割反應切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGG
11、CCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點Bg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情
12、況和同一限制酶切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連2. 平端連接平端連接 5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉移酶末端轉移酶+ dATP末端轉移酶末端轉移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA
13、 T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體5 3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco R4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接連接反應的條件連接反應的條件 酶最適溫度為酶最適溫度為3737，但此時氫鍵不夠穩(wěn)定，且酶活會迅速降，但此時氫鍵不夠穩(wěn)定，且酶活會迅速降低。通常在低。通常在4-154-15連接。連接。影響因素：影響因素：A. A. 溫度（最主要的因素）溫度（最主要的因素）B. ATPB. ATP的濃度的濃度C. C. 連接酶濃度連接酶濃度D. D. 反應時間反應時間E. E. 插入片段和載體片段插入
14、片段和載體片段 的摩爾比的摩爾比轉化4 過夜加反應液CK-CK-重組菌落重組菌落CK+CK+轉化轉化 (transformation，DNA導入大腸桿菌導入大腸桿菌)轉染轉染 (transfection，DNA導入真核細胞，酵母除導入真核細胞，酵母除外外)感染感染 (infection，噬菌體、病毒感染細胞，噬菌體、病毒感染細胞)1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇ampr、tetr 、Kanr(2) 標志補救標志補救(marker rescue)， 如如互補互補(3) 分子雜交法分子雜交法2. 免疫學方法（非直接選擇法）免疫學方法（非直接選擇法）如免疫化學方法及酶免
15、檢測分析等如免疫化學方法及酶免檢測分析等( (插入失活法插入失活法) ) 抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇 互補互補 原位雜交原位雜交雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法免疫學方法 小結小結分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉轉轉入受體細胞轉入受體細胞篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術操作的技術操作的主要步驟主要步驟載體載體質粒質粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基
16、因目的基因連接酶連接酶重組體重組體轉化轉化體外包裝，轉染體外包裝，轉染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交構建構建表達表達載體載體受體細胞受體細胞產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)物的分離純化 選擇標志選擇標志 強啟動子強啟動子 翻譯調控序列翻譯調控序列 多接頭克隆位點多接頭克隆位點1. 原核表達體系原核表達體系 (E.coli最常用最常用)缺乏翻譯后加工機制，不宜表達缺乏翻譯后加工機制，不宜表達gDNA；缺乏翻譯后加工機制，不能加工真核蛋白；缺乏翻譯后加工機制，不能加工真核蛋白；蛋白常形成包涵體蛋白常形成包涵體(inclusion body) ；
17、需要復雜處；需要復雜處理方能具有活性。理方能具有活性。很難表達大量可溶性蛋白。很難表達大量可溶性蛋白。不足不足大鼠胰島素原大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌的表達和分泌 優(yōu)點：優(yōu)點：可表達克隆的可表達克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA 可適當修飾表達的蛋白質可適當修飾表達的蛋白質 表達產(chǎn)物分區(qū)域積累表達產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點：缺點：操作技術難、費時、不經(jīng)濟操作技術難、費時、不經(jīng)濟2.2.真核表達體系（酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞）真核表達體系（酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞）重組人胰島素重組人胰島素生物制藥生物制藥 重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素
18、原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促進凝血促進凝血顆粒細胞顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成剌激白細胞生成促紅細胞生成素促紅細胞生成素剌激白細胞生成剌激白細胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細胞生長與分化刺激細胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素白細胞介素激活、剌激各類白細胞激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療瘤導向治療乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)預防乙肝預防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂預防霍亂
生物化學與分子生物學：第21章 重組DNA技術
