兔急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病血清sod、mda及腦mrs研究

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1、`` 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 兔急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病 血清 SOD、MDA 及腦 MRS 研究 ``````` 碩士研究生 指導老師  管葉明 汪青松 （安徽醫(yī)科大學解放軍臨床學院神經(jīng)內(nèi)科  230031） 中文摘要 急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病（delayed neuropsychological sequelae after acute carbon monoxide poisoning, DNS）是患者在急性一氧化碳中毒后的一段 時間內(nèi)表現(xiàn)正?；蚪咏?/p>

2、常的假愈期后，出現(xiàn)以癡呆、精神和錐體外系癥狀為主 要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是急性一氧化碳中毒的嚴重并發(fā)癥之一。該病一旦發(fā)生， 尚無理想的臨床治療措施，關鍵是早期診斷，積極預防。其發(fā)病機制十分復雜，目前尚 未完全明了，可能與急性一氧化碳中毒后缺血缺氧、細胞毒性損傷、再灌注損傷和 自由基、興奮性氨基酸和細胞凋亡、免疫功能異常和神經(jīng)遞質(zhì)紊亂等有關。 核磁共振波譜學（magnetic resonance spectroscopy，MRS) 是目前唯一能 對人體的組織代謝、生化環(huán)境以及化合物進行定量分析的無創(chuàng)傷性方法。它是對 某一感興趣區(qū)所有化合物信號進行采集,通

3、過其信號強度與共振頻率間函數(shù)關系 曲線，達到對人體代謝物定量測量和分析的目的，可為研究DNS代謝物的變化提供 新的方法。依達拉奉作為新一代抗氧化劑，可清除自由基,抑制脂質(zhì)過氧化反應和 DNA氧化損傷,抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡,有關依達拉奉用于DNS的治療尚未見報道。 目的： 本研究通過觀察兔 DNS 模型血清 SOD、MDA、腦 MRS 和海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)細胞形 態(tài)及神經(jīng)元數(shù)量，以及自由基清除劑依達拉奉對上述指標的影響，探討自由基在 DNS 發(fā)病過程中的可能作用，為臨床防治 DNS 提供理論依據(jù)。 5

4、 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 方法： 將研究對象隨機分為正常組、DNS 組、生理鹽水組、依達拉奉組，每組 10 例， 除正常組外，其余各組通過腹腔注射 CO 制備急性 CO 中毒遲發(fā)性腦病動物模型， 生理鹽水組經(jīng)耳緣靜脈點滴生理鹽水（1mg/Kg，每日兩次，共一個療程 14 天）， 依達拉奉組經(jīng)耳緣靜脈點滴依達拉奉（1mg/Kg，每日兩次，共一個療程 14 天）， 對研究對象分別進行血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)測定及 MRS 檢 查，測量各感興趣區(qū)化合物的相對比值。應用光學顯微鏡觀察海馬 CA 區(qū)神經(jīng)細胞

5、 形態(tài)并計數(shù)神經(jīng)元數(shù)目。 結(jié)果： 和正常組相比，DNS組血清SOD活性明顯下降, MDA的含量顯著增加，顳葉海馬 區(qū)域NAA /Cr顯著下降，Cho/ Cr 及Lac/ Cr顯著升高，均有顯著差異（P < 0. 01）； 生理鹽水組與DNS組相比，血清SOD活性、MDA的含量、顳葉海馬區(qū)域NAA /Cr、Cho/ Cr 和Lac/ Cr，均無顯著差異（P＞0.05）。依達拉奉組與DNS組和生理鹽水組相 比，血清SOD活性明顯升高，MDA的含量顯著降低，顳葉海馬區(qū)域NAA /Cr顯著升高， Cho/ Cr 及Lac/ Cr顯著降低，均有

6、顯著差異（P < 0. 01）。DNS組海馬CA1區(qū)神 經(jīng)元數(shù)量顯著低于正常組，依達拉奉組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著高于生理鹽水 組。 結(jié)論： 研究表明：1）自由基參與了DNS的病理生理過程；2）腦MRS的變化可作為DNS早 期診斷及治療效果判斷的神經(jīng)影像學指標之一；3）自由基清除劑可用于臨床預防和 治療DNS。 6 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 【關鍵詞】一氧化碳中毒；遲發(fā)性腦病；磁共振波譜；超氧化物岐化酶；丙二 醛；依達拉奉 [基金項目]全軍十一五醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（

7、06H009）、南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金 （06MA51） 7 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 Research on the serum superoxide dismutase activity,serum concentration of malondialadeyde and brain mangetic reson- ance

8、 spectroscopy in rabbits with delayed neuropsychological sequelae after acute carbon monoxide poisoning M.D  candidate:  Yeming  Guan Mentor :  Qingsong  Wang (Department of Neurology, The 105th Hospital of PLA, Clinic College, Anhui Medical Universi

9、ty, Hefei 230031, China) Abstract Delayed neuropsychological sequelae after acute carbon monoxide poisoning ( DNS) is one of serious complications of acute carbon monoxide poisoning. DNS develops later following a symptom-free interval of a few weeks or longer. Once the diseas

10、e occurs, there is no ideal clinical treatment method. The key is early diagnosis, active prevention. So far, we do not make the complicated mechanism of DNS clear. Research primarily considered that acute ischemia and hypoxia, cytotoxic injury, reperfusion injury and free radicals, exci

11、tatory amino acids and cell apoptosis, immune dysfunction and other related disorders of neurotransmitters might be involved after carbon monoxide poisoning. Magnetic resonance spectroscopy (MRS) is only an invasive method that can detect tissue metablism, biochemical circomustance and m

12、ake quantitative analysis of compound in live body. It can collect the signal of compond in every interested area. It can reach the purpose for ration measure and analysis of metablism in human body by reflecting the function relation 8 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 curve between sign

13、al intensity and resonance frequency. So, it can provide a new approach to study the changes of metabolite during DNS process. As a new generation of anti-oxidants, Edaravone can remove free radicals, inhibit lipid peroxidation, DNA oxidative damage and delayed neuronal death. So far, li

14、ttle is reported about edaravone in DNS prevention and treatment. Objective: To elucidate role of free radicals in DNS, we observed effect of edaravone on DNS rabbit serum superoxide dismutase (SOD) activity, malondialdehyde (MDA) levels, the level of relative value of MRS par

15、ameters (NAA, Cho, Lac, Cr, etc.) and neron numbers of happocampal CA1 area. Methods: Rabbits were randomly divided into normal group, DNS group, saline group, edaravone group. Rabbit DNS model was made by intraperitoneal injection of CO. Normal saline (1mg/Kg, twice daily, a

16、total of one course of 14 days) was utilized through the ear vein in saline group, and edaravone was utilized through the ear vein (1mg/Kg, day 2 times, a total of one course of 14 days) in edaravone group. Serum superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) was measured

17、in each group. Measurement of various compounds the relative ratio of region of interest was applied in brain MRS examination. Neurons in hippocampal CA1 area was counted by microscopy. 9 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 Results: Compared with normal group, there is significantl

18、y decreased serum SOD activity and increased MDA content in DNS group. The ratio of NAA / Cr significantly decreased in DNS group, while the ratio of Cho / Cr and Lac / Cr significantly increased in hippocampus region of temporal lobe (P <0. 01); Compared with normal group, there is no s

19、ignificant difference in serum SOD activity, MDA content, the ratio NAA / Cr, Cho / Cr and Lac / in the hippocampus region of temporal lobe Cr (P> 0.05 ). Compared with DNS group or saline group, serum SOD activity significantly increased and significantly decreased in Edaravone group(

20、P <0. 01), while  MDA levels the ratio of NAA / Cr was significantly higher, ratio of Cho / Cr and Lac / Cr significantly reduced in hippocampal region of temporal lobe (P <0. 01). Compared with normal group, there is significantly decreased neuron number of hippocampal CA1 area

21、in DNS group (P <0. 01). Compared with saline group, neuron number of hippocampal CA1 area increase significantly in edaravone group (P <0. 01). Conclusion: Our results indicate that: 1) Free radicals are involved in the process of DNS；2) Brain MRS might be used for early diag

22、onos and beneficial to estimate therapeutic effect of DNS；3) Edaravone can be used for the prevention and treatment in DNS. [ Key words]  Carbon monoxide poisoning ； Delayed neuropsychological sequelae；Magnetic resonance spectroscopy； Superoxide dismutase； Malondialadey

23、de；Edaravone 10 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 英文縮略詞 英文縮寫 APO CO Cho Cr CSF DA DOPAC DNS DWI Edaravone FAA HB HBCO HBO HVA IFN IL Lac LDH Lip MB  英文全名 apoptosis carbon monoxide choline creatine

24、 cerebrospinal fluid dopamine 3 ,4–dihydroxyphenylacetic acid delayed neuropsychological sequelae after carbon monoxide poisoning diffusion weighted imaging edaravone free amino acid haemoglobin hemoglobin carbony hyperbaric oxygen homovanillic acid interf

25、eron Interleukin lactate lactate dehydrogenase lipid myoglobin  中文全名 細胞凋亡 一氧化碳 膽堿化合物 肌酸/磷酸肌酸 腦脊液 多巴胺 二羥苯乙酸 一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病 彌散加權成像 依達拉奉 游離氨基酸 血紅蛋白 碳氧血紅蛋白 高壓氧 高香草酸 干擾素 白細胞介素 乳酸 乳酸脫氫酶 脂質(zhì) 肌紅蛋白 

26、 3 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 英文縮寫 MBP MDA MRS NAA NO NOS nNOS NSE XO  英文全名 myelin Basic Protein malonialdehyde magnetic resonance spectr

27、oscopy N-acetyl aspartate nitric oxide nitric oxide synthase Neuronal nitric oxide synthase heme oxygenase neuronal specific enolase xanthine oxidase  中文全名 髓鞘堿性蛋白 丙二醛 核磁共振波譜學 N-乙酰天門冬氨酸 一氧化氮 一氧化氮合成酶 神經(jīng)元型 NO 合酶 神經(jīng)元特異性烯醇化酶 黃嘌呤氧化酶 

28、 4 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 前言 急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦?。╠elayed neuropsychological sequelae after acute carbon monoxide poisoning, DNS）是患者在急性一氧化碳中毒后 的一段時間內(nèi)表現(xiàn)正?；蚪咏?/p>

29、常的假愈期后，出現(xiàn)以癡呆、精神和錐體外系癥 狀為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是急性一氧化碳中毒的嚴重并發(fā)癥之一。由于其 具有一段時間的假愈期，臨床上DNS常常容易被病人癥狀好轉(zhuǎn)而忽視堅持治療，以 致造成嚴重后果。其發(fā)病率國內(nèi)為10%～30%，國外為0.8%～43%  [1]  。DNS 的發(fā)病 機制目前仍不十分明了,尚無特效療法，急性一氧化碳中毒一旦發(fā)生遲發(fā)性腦病， 將對患者身心造成極大的影響，嚴重者可影響患者的生活和生存質(zhì)量，給患者的 家庭和社會造成負擔。 目前，有關DNS的發(fā)病機制尚不明了，主要與缺血缺氧、再灌注損傷、興奮 性

30、氨基酸毒性作用、CO 直接毒性作用、腦血管損害、腦水腫和高敏感性反應有關。 一氧化碳與血紅蛋白親和力是氧與血紅蛋白親和力的200～300倍,結(jié)合形成碳氧 血紅蛋白(HBCO) ,而后者的解離速度僅為氧和血紅蛋白的1/3600,又不能攜氧,使 組織缺氧,而中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺氧最為敏感,急性CO中毒可造成細胞性腦水腫,細 胞間隙水腫,腦內(nèi)微循環(huán)障礙,進一步加重組織缺氧。黃嘌呤氧化酶( xanthine oxidase ,XO)催化的生化過程是自由基的重要來源,缺氧可激活黃嘌呤氧化酶,生 成大量氧自由基及花生四稀酸產(chǎn)物(血栓素、白三稀、前列腺素等) ,神經(jīng)細胞富

31、 含多價不飽和脂肪酸,最易受氧自由基攻擊[2]，氧自由基使細胞膜磷脂中多聚不飽 和脂肪酸脂質(zhì)過氧化反應增強,導致腦細胞功能受損。有學者認為缺血缺氧時自由 基水平升高,重新供氧后,自由基的連鎖反應可達高峰,產(chǎn)生更多的自由基，致使腦 內(nèi)過氧化作用增強,破壞腦組織的脂質(zhì)成分而造成腦部病變，而反復使用高壓氧治 療極似缺血- 再灌注過程,可使體內(nèi)的氧自由基生成增加，加重腦損害[ 3-4 ]。 目前對急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病尚無明確的診斷標準，主要依靠臨床表 現(xiàn)和影像學診斷，在CT上表現(xiàn)主要有：1）以蒼白球為主的雙側(cè)低密度灶，邊界清 11

32、 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 晰；2）以側(cè)腦室前后腳周圍多見的腦白質(zhì)廣泛對稱性低密度，邊界不清，?？梢? 基底節(jié)合并腦白質(zhì)病變；3）遲發(fā)性腦病后期，表現(xiàn)為腦溝腦池增寬，腦室輕中度 擴大[5]。在MRI上的表現(xiàn)主要有:1)側(cè)腦室旁及半卵圓中心白質(zhì)脫髓鞘:為對稱分布 的大片狀病灶,呈稍長T1長T2 信號,病灶常波及胼胝體、皮質(zhì)下U形纖維、外囊、 內(nèi)囊；2)基底節(jié)區(qū)的缺血或壞死、軟化:主要分布于雙側(cè)豆狀核及蒼白球,?？衫? 及丘腦、內(nèi)外囊,表現(xiàn)為彌漫性低信號；3)側(cè)腦室旁及半卵圓中心腦白質(zhì)脫髓鞘, 合并基底節(jié)區(qū)的缺血壞死[6]；4)彌散加權成像( di

33、ffusion weighted imaging,DWI) 是在活體上進行水分子擴散測量與成像的一種新技術,可突出表現(xiàn)細胞內(nèi)水分子 布朗運動所致的微觀相位彌散效應,對由缺血、缺氧所致的細胞毒性水腫尤為敏感, 在細胞毒性水腫早期即出現(xiàn)細胞內(nèi)水分子運動受限,其彌散效應顯著下降,在常規(guī) T1WI、T2WI無異常發(fā)現(xiàn)時,DWI即能準確顯示病變部位并判斷損傷程度,提示可能與 急性CO 中毒所致細胞毒性水腫有關[7]。 磁共振波譜（magnetic resonance spectroscopy，MRS）是一種新的醫(yī)學影 像技術，利用磁共振現(xiàn)象和化學位移作用，進行一

34、系列特定原子核及其化合物含 量多少的分析，是目前唯一無創(chuàng)探測活體組織化合物特性的方法[8]。通過對某一感 興趣區(qū)所有化合物性號進行采集，反映其信號強度與共振頻率間函數(shù)關系曲線， 達到對人體代謝物定量測量和分析的目的。臨床實踐中常常選擇Cho 、Cr 、NAA 和 Lac 峰進行測定。NAA在成熟腦組織僅存在于神經(jīng)元和軸索中,由線粒體合成, 主 要位于2.02ppm，正常濃度為7.8mmol/l，被認為是神經(jīng)元活力的特異性標志物,NAA 的下降意味著神經(jīng)元的損傷和功能受損  [9-10]  。Cho 位于3.20 ppm，正常濃度為

35、1.3mmol/l，主要是自由膽堿,是細胞膜反轉(zhuǎn)的標志物,反映細胞膜的穩(wěn)定性,其峰 值的高低是由膜磷脂中的膽堿濃度決定的,通常和細胞膜的合成和分解代謝有關； Cho升高是神經(jīng)細胞膜損傷、脫髓鞘的標記[11-12]； Lac是一個重要的腦代謝指標, 在正常腦組織中,細胞能量代謝以有氧氧化為主,腦內(nèi)Lac水平很低,位于1.34ppm 附近的Lac波一般是不能測得的,如果出現(xiàn)則呈低平的波形。Lac水平的增加已被證 實為腦缺氧缺血的標志,而腦內(nèi)Lac 水平持續(xù)不降可能提示預后不佳[13]；Cr主要位 于3.05ppm，正常濃度為4.5mmol/l，是能量利用，儲存的

36、重要化合物，標志著細 12 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 胞的能量狀態(tài)，由于其濃度在各種狀態(tài)包括病理狀態(tài)下量化相對恒定, 常被作為 參照物[14-15]，因此，利用MRS研究急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病腦內(nèi)NAA、 Cho 、 Cr、Lac的含量及其比值，不僅對DNS發(fā)病機制提供有益的線索，為今后臨床診斷 及防治DNS提供新的理論依據(jù)，同時也為DNS的治療效果判斷提供新的影像學指標。 關于DNS的治療目前仍處于臨床探索階段,治療原則主要是依據(jù)上述可能的發(fā) 病機制,采取綜合措施,阻斷缺氧引起的病理基礎,促進受損腦組織結(jié)構與功能

37、的 恢復。目前主要的治療方法有高壓氧( Hyperbaric oxygen ,HBO)、改善腦循環(huán)、 營養(yǎng)神經(jīng)細胞、皮質(zhì)類固醇激素、解除腦水腫和降低顱內(nèi)壓及對癥支持治療。其 中HBO是臨床主要治療方法,用作急性CO 中毒的早期治療,尤其是重度CO 中毒的 搶救,有較明確的理論基礎。研究表明，HBO 配合藥物治療對DNS有較好的治療效 果[16-17]。HBO 治療DNS的機制目前并不清楚,可能相關的機制包括:增高腦組織局部 氧濃度、阻止腦組織局部脂質(zhì)過氧化和白細胞向腦微血管內(nèi)皮細胞的黏附、加速 失活的細胞色素氧化酶再生等；還可以通過增加血氧含量,改善供

38、氧,使血管通透 性易于恢復正常,減少滲出和腦水腫,降低顱內(nèi)壓,改善微循環(huán),阻斷腦缺氧和腦水 腫的惡性循環(huán)；促進血管成纖維細胞的分裂、增生,膠原纖維的形成,促進側(cè)支循 環(huán)的建立；降低血液黏度,減少無氧酵解,減少血小板聚集等[18]。目前對于HBO 能 否治療遲發(fā)性腦病仍存在以下爭論:自由基所引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用參與了遲發(fā) 腦病的腦組織損傷,而反復使用HBO極似缺血- 再灌注過程,極可能使體內(nèi)的氧自 由基生成增加。有研究表明,CO中毒后期持續(xù)使用HBO治療CO中毒,以及使用HBO治 療遲發(fā)性腦病,理論依據(jù)均不足  [19]  。

39、依達拉奉作為一種新型自由基清除劑,可清除自由基,抑制脂質(zhì)過氧化,從而 抑制神經(jīng)細胞和血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷,抑制腦細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞 的過氧化作用,減輕組織損傷和腦積水, 抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶的 活性,刺激前列腺素的生成,減少炎癥介質(zhì)白細胞三烯的生成,抑制神經(jīng)元的死亡。 從而減輕神經(jīng)功能障礙,已廣泛應用于急性腦梗死及腦出血的治療[20] 。經(jīng)文獻檢索 未見有關依達拉奉用于DNS動物實驗的報道。 本研究通過觀察兔 DNS 模型血清 SOD、MDA 及腦 MRS 的改變，以及自由基清 13 安徽醫(yī)科大學碩

40、士學位論文 除劑依達拉奉對上述指標的影響，觀察依達拉奉治療對 DNS 兔海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)細 胞形態(tài)及神經(jīng)元數(shù)目的影響。探討自由基在 DNS 發(fā)病過程中的可能作用，為臨床 防治 DNS 提供理論依據(jù)。 14 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 1 材料 1.1 實驗試劑及儀器 純

41、品CO氣體（體積分數(shù)為99.9%）南京特種氣體有限公司 依達拉奉 江蘇先聲藥業(yè)有限公司 連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）、EDTA-K2真空抗凝管 合肥市創(chuàng)新實驗試劑有限公司 丙二醛(Malonialdehyde ,MDA) 試劑盒  南京建成生物工程研究 究  超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)試劑盒 721型紫外線分光光度計 上海分析儀器總廠  南京建成生物工程研 西門子1.5 T Novus MR 掃描儀  西門子公司 Spectroscopy 波譜處理軟件 西門

42、子公司 1.2 動物分組 40 只普通級健康雄性新西蘭大白兔，體重為 1.5~2.0kg，商品化干塊狀飼料 飼養(yǎng)，均由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，自由飲水。隨機分成四組，每組 10 只：1）正常組，不染毒也不接受治療；2）DNS 組，染毒制備 DNS 動物模型，但不 接受治療；3）生理鹽水組，染毒制備 DNS 動物模型，接受生理鹽水治療；4）依 達拉奉組，染毒制備 DNS 動物模型，接受依達拉奉治療。 1.3 DNS動物模型的制備 染毒前一天禁食。動物檢查無異常后，經(jīng)腹腔注射純品 CO 氣體首次注射劑量 為 200ml/kg，后每 6 小

43、時間隔追加注射三次，劑量為 100ml/kg，動態(tài)監(jiān)測染毒兔 24 小時內(nèi)血 HbCO 水平，以染毒兔血 HbCO 水平維持在 45%以上為中毒指標，并觀 察其癥狀及體征，如經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn) HbCO 低于 45%即剔出實驗[21-22]。 血 HbCO 水平的測定: 采用改良的雙波長 HbCO 定量法測定，第一次測定在染 毒后半小時進行，以后每 2 小時測定一次，連續(xù)監(jiān)測 24 小時內(nèi)染毒動物靜脈血 HbCO 濃度變化。 15 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 HbCO 飽和度分別為 0%和 100%樣品稀釋液的制備與檢測 以 E

44、DTA-K2真空抗凝 管采集正常健康兔耳緣靜脈血 3.0ml，通入空氣 10min，使 HbCO 充分轉(zhuǎn)化為氧合 血紅蛋白，得到 HbCO 飽和度近似 0%的血樣，取 0%HbCO 血液 1.0ml 用蒸餾水稀釋 5 倍，從中取 0.3ml 加 0.02mol/l Tris 稀釋液 90ml，即為 HbCO 飽和度為 0%樣品 稀釋液（Ⅰ液），?、褚?15ml 注入另一試管中，加入 60mg Na2S2O4，混合加塞室溫 放置 10min 后用 721 型紫外線分光光度計光譜掃描。另?、褚?50ml 通入純 CO 氣 體 10min,即得到 HbCO 飽和度

45、為 100%樣品稀釋液（Ⅱ液），?、蛞?15ml 注入一試 管中，加入 60mg Na2S2O4，混合加塞室溫放置 10min 后用 721 型紫外線分光光度計 光譜掃描。 待測樣品的處理和檢測 以 EDTA-K2真空抗凝管采集染毒兔耳緣靜脈血 1.0ml， 立即送檢。取抗凝血 10μl，加入內(nèi)盛 15ml0.02mol/l Tris 稀釋液的具塞試管中， 加入 60mg Na2S2O4，混合加塞室溫放置 10min 后用 721 型紫外線分光光度計光譜掃 描，觀察吸收光譜形狀及吸收峰位置，并記錄 420nm 和 430nm 處的吸光度值。 計算 在相

46、同檢測條件下，分別得到 0%HbCO、100%HbCO 和待測樣品在 420nm 和 430nm 波長處的吸光度值，并計算出兩波長的吸光度比值，然后代入下列公式 計算待測樣品中 HbCO 飽和度，公式為： （A420/A430）x-（A420/A430）0 HbCO%=  ×100% （A420/A430）100-（A420/A430）0 式中（A420/A430）0 為 HbCO 飽和度為 0%樣品在 420nm 和 430nm 處的吸光度比值， （A420/A430）100 為 HbCO 飽和度為 100%樣品在 420nm 和 43

47、0nm 處的吸光度比值， （A420/A430）x為待測樣品在 420nm 和 430nm 處的吸光度比值，將 HbCO 飽和度為 0%、 100%的樣品分別測定后，把吸光度比值代人上式，簡化即可得到： HbCO%=〔0.94（A420/A430）x -0.69〕×100%[23-24]。 16 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 2 方法 2.1 分組及治療 隨機分正常組、DNS 組、生理鹽水組和依達拉奉組，每組 10 只。生理鹽水組 和依達拉奉組于染毒后第 15 天開始治療，依達

48、拉奉組兔經(jīng)耳緣靜脈點滴依達拉奉 （1mg/Kg，每日兩次，共一個療程 14 天），生理鹽水組兔經(jīng)耳緣靜脈點滴生理鹽 水（1mg/Kg，每日兩次，共一個療程 14 天）。 2.2 SOD、MDA 測定 待治療結(jié)束后，所有兔均取耳緣靜脈血 4 ml, 靜置 30 min 后, 以 3 000 r/min 速度離心 15min,分離出血清，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存,待測。SOD、MDA 采用化學 比色法測定,嚴格按說明書操作。 2.2.1 SOD 測定方法 100 管試劑盒的組成與配制： 試劑一：儲備液：10ml*1 瓶，加蒸餾水稀釋至 100m

49、l，4℃保存。 試劑二：液體 10ml*1 瓶， 4℃-10℃保存。 試劑三：液體 10ml*1 瓶， 4℃-10℃保存。 試劑四：液體 350μl*2 支，4℃保存；4 號稀釋液 10ml*1 瓶，4℃保存，兩者 按 1：14 稀釋后，4℃保存。 試劑五：粉劑*1 支，加 70℃-80℃雙蒸水 75ml 溶解，如溶解冷涼后不足 75ml 必須補充至 75ml, 4℃避光保存。 試劑六：粉劑*1 支，加蒸餾水 75ml 溶解, 4℃避光保存。 顯色劑的配制：試劑五：試劑六：冰乙酸=3：3：2 配制，4℃避光保存。

50、 17 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 所有試劑配制完成后按下表操作： 用漩渦混勻器充分混勻，置 37℃恒溫水浴 40 分鐘 混勻，室溫放置 10 分鐘，于波長 550nm 處，1cm 光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零， 比色后，按公式計算： 對照管吸光度-測定管吸光度 反應體系 SOD 活力（U/ml）=  對照管吸光度 ÷50%×的稀釋倍數(shù) 反應體系 的稀釋倍數(shù)  =  反應液總量 取樣

51、量  =  試劑量 3.3ml+反應體系中的取樣量 反應體系中的取樣量 2.2.2 MDA 測定方法 100 管試劑盒的組成與配制： 試劑一：液體 20ml*1 瓶，4℃保存。 試劑二：液體 12ml*1 瓶， 加 340ml 雙蒸水混勻，4℃保存。 試劑三：粉劑*1 支，加 90℃-100℃雙蒸水 60ml 溶解，如溶解冷涼后不足 60ml 必須補充至 60ml,再加冰醋酸 60ml，充分混勻后 4℃避光保存。 標準品：10nmol/ml 四乙氧基丙烷 5ml*1 瓶，4℃保存。 1

52、8試劑 測定管 對照管 試劑一（ml） 1.0 1.0 樣本（ml） 0.03 試劑一（ml） 0.1 0.1 試劑一（ml） 0.1 0.1 試劑一（ml） 0.1 0.1 顯色劑（ml） 2.0 2.0 樣本（ml） 0.03 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 所有試劑配制完成后按下表操作： 用漩渦混勻器充分混勻，置 37℃恒溫水浴 40 分鐘 漩渦器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴

53、或用鍋開蓋 煮沸 40 分鐘，取出后流水冷卻，532nm 處，1cm 光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測定 各管吸光度值，按公式計算： 測定管吸光度-測定空白管吸光度 MDA 含量（nmol/ml）= ×標準品濃度 標準管吸光度-標準空白管吸光度 2.3 MRS 檢測 待治療結(jié)束后，所有兔均利用 MRS 檢測進行顳葉海馬區(qū) NAA /Cr、 Cho/ Cr 及 Lac/ Cr 比值。使用西門子 1.5 T Novus MR 掃描儀,小柔體正交線圈,以視交叉為 中心進行冠狀位掃描，獲取橫斷面 T1WI 為 TR = 400ms ,TE=18ms,T2

54、WI 為 TR = 4000ms ,TE=114ms,層厚為 3mm，層間距為 0.5mmI。MRS 檢測技術:多體素定點分辨 波譜序列進行數(shù)據(jù)采集, 感興趣區(qū)（volume of interest，VOI）選擇位于顳葉海馬, 體積為 5 mm ×5 mm ×5mm , 分別檢測顳葉海馬代謝產(chǎn)物,包括 N-乙酰天門冬氨 酸(N-acetyl aspartate,NAA) 、膽堿復合物(choline,Cho) 、乳酸(lactate,Lac) 和肌酸 (creatine,Cr)各代謝產(chǎn)物波峰的峰高,并以 Cr 峰高作為標準,計算各代些產(chǎn)物與其 比值。檢測過程

55、中避免鄰近組織、腦脊液、頭皮脂肪、顱骨等容積效應的干擾。 TR/TE/NEX=1340ms/42ms/200,勻場、水抑制和信號采集均為自動完成；用 Spectroscopy 軟件對所得譜線進行相同的基線校正、相位調(diào)整及化學位移確定, 19 標準管 標準空白管 測定管 測定空白管 10nmol/ml 標準品（ml） 0.1 無水乙醇（ml） 0.1 測試樣品（ml） 0.1 0.1 試劑一（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 試劑二（ml） 3 3 3 3 試劑三（ml） 3 3 3

56、 50%冰醋酸（ml） 3 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 自動獲取譜線各代謝產(chǎn)物以 Cr 為參照的代謝產(chǎn)物比值而進行比較[25-26]。 獲取原始波譜圖后，運行 Auto 處理程序，點擊運行 Raw 去除原始譜線，隨后進行基 線調(diào)整，波峰上下限修改和 smooth 處理。選擇 Select peak 加工譜線，去除無關的標 記波峰。然后進行波譜圖和原始數(shù)據(jù)的輸出和保存。 2.4 病理學檢查 待所有檢查結(jié)束后，所有兔以 20%烏拉坦麻醉，用冰生理鹽水（4℃）1000ml 快速 灌注左心室，以驅(qū)

57、除腦血管內(nèi)血液，隨后再灌注冰 4%多聚甲醛直至兔完全僵硬，取出腦 組織分離海馬，常規(guī)制備石蠟切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色,光鏡下觀察海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)，以視網(wǎng)格每毫米長度計數(shù)顆粒細胞層神經(jīng)元數(shù)目。 2.5 統(tǒng)計學處理 全部數(shù)據(jù)輸入計算機，使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對各組兔腦內(nèi)化合物含量以 及SOD、MDA的結(jié)果進行平均數(shù)、標準差( x ±s) 計算,并進行單因素方差分析。 3 結(jié)果 3.1 血清 SOD 活性、MDA 水平變化 兔經(jīng)染毒后血清 SOD 活性明顯下降, MDA 的含量顯著增加，給予生理鹽水治療 后，上述指

58、標無明顯變化，而經(jīng)依達拉奉治療后，血清 SOD 活性明顯升高，MDA 的 含量顯著降低（見表 1）。 表1  血清SOD活性、MDA含量比較( x ±s，n=10) Tab 1 The serum superoxide dismutase activity,serum concentration of malondialadeyde in rabbits( x ±s，n=10) 組別 正常組 DNS組 生理鹽水組 依達拉奉組  SOD（U/ml） 104.55±7.20 68.94±10.33◆ 7

59、4.71±11.70○ 93.92±10.28●◇  MDA（nmol/ml） 2.05±0.19 4.13±0.85◆ 3.78±0.66○ 2.08±0.30●◇ 注：◆與正常組相比，P < 0.01；○與DNS組相比，P ＞0.05； ●  與DNS組相比，P < 0.01；◇與生理鹽水組相比，P < 0.01 - 20 - 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 3.2 MRS 檢測結(jié)果 兔經(jīng)染毒后顳葉海馬區(qū)域 NAA /Cr 顯著下降，Cho/ Cr 及 Lac/ Cr 顯著升高，

60、 給予生理鹽水治療后，上述指標無明顯變化，而經(jīng)依達拉奉治療后，顳葉海馬區(qū) 域 NAA /Cr 顯著升高，Cho/ Cr 及 Lac/ Cr 顯著降低（見表 2、附圖 1.2.3.4）。 表2  海馬CA1區(qū)各代謝產(chǎn)物峰高與Cr峰高比值( x ±s，n=10) Tab 2 The ratiao of metabolized substance in hippocampal CA1 area in rabbits( x ±s，n=10) 組別 正常組 DNS組 生理鹽水組  NAA /Cr 1.69

61、 ±0.19 0.66 ±0.07◆ 3.78 ±0.66○  Cho /Cr 0.17 ±0.04 0.78 ±0.09◆ 0.63 ±0.05○  Lac /Cr 0.03 ±0.02 0.13 ±0.03◆ 0.76 ±0.08○ 依達拉奉組  1.58 ±0.36●◇  0.26 ±0.19●◇ 0.03 ±0.03●◇ 注：◆與正常組相比，P < 0.01；○與DNS組相比，P ＞0.05； ●  與DNS組相比，P < 0.01；◇與生理鹽水組相比，P < 0.01

62、 3.3 腦組織病理學變化 正常組兔腦組織切片 HE 染色，海馬 CA1 區(qū)細胞及結(jié)構未見異常（附圖 5）； DNS 組及生理鹽水組可見神經(jīng)細胞出現(xiàn)異常改變，主要表現(xiàn)為細胞變性、壞死，細 胞間隙增大，顆粒細胞層神經(jīng)元數(shù)目明顯減少（附圖 6.7）；依達拉奉組神經(jīng)細胞也 出現(xiàn)輕度改變，主要為細胞水腫，局部壞死，顆粒細胞層神經(jīng)元數(shù)目明顯多于 DNS 組和生理鹽水組（附圖 8）（見表 3）。 - 21 - 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 表3  海馬CA1區(qū)顆

63、粒細胞層神經(jīng)元數(shù)目( x ±s，n=10) Tab 3 the amount of neurogenesis of stratum pyramida in hippocampal CA1 area( x ±s，n=10) 組別 正常組 DNS組 生理鹽水組 依達拉奉組  神經(jīng)元數(shù)目 204±19 114 ±6◆ 106 ± 7 193 ± ●10 注：◆與正常組相比，P < 0.01 ；與 DNS 組相比，P ＞0.05； ●  與DNS組相比，P < 0.01 ；與生理鹽水組相比，P <

64、 0.01 4 結(jié)論 根據(jù)以上研究結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：1）自由基參與了DNS的病理生理過程； 2）腦MRS的變化可作為DNS早期診斷及治療效果判斷的神經(jīng)影像學指標之一；3）自由 基清除劑可用于臨床預防和治療DNS。 5 討論 5.1 一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的發(fā)病機制 DNS 的發(fā)病機制十分復雜，國內(nèi)外也對 DNS 的發(fā)病機制作了很多研究，目前， 還沒有哪一種機制能完全闡明 DNS 的發(fā)病機制，通常認為與以下幾種原因有關： 5.1.1 缺血缺氧損傷 缺氧及其導致的自由基過度形成和脂質(zhì)過氧化是眾多學

65、者普遍認可的原因。 一氧化碳與血紅蛋白的親和力比氧與血紅蛋白的親和力大 200~300 倍，而碳氧血 紅蛋白又比氧合血紅蛋白的解離慢約 3600 倍，而且碳氧血紅蛋白的存在還抑制氧 合血紅蛋白的解離，阻抑氧的釋放和傳遞，造成機體急性缺氧血癥。高濃度的一 22 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 氧化碳還能與細胞色素氧化酶中的二價鐵相結(jié)合，直接抑制細胞內(nèi)呼吸[27-28]。Raub JA 等認為，CO 除能與血紅蛋白( hemoglobin , HB) 結(jié)合以外,還能與肌紅蛋白 (myoglobin ,MB) ,細胞色素 C 氧化

66、酶等血紅素蛋白結(jié)合,直接對細胞產(chǎn)生毒性作 用。MB 是與 CO 結(jié)合率最高的血紅素蛋白,CO 與心肌的 MB 結(jié)合,使得心肌功能受 損后,血壓降低,組織灌注減少,組織缺氧進一步加重；細胞色素 C 氧化酶是呼吸鏈 中的重要酶類之一,COHB 濃度高達約 50 %時,CO 競爭性地與此酶牢固結(jié)合,電子不 能經(jīng) CytoC 傳遞給 O2 ,導致線粒體呼吸功能和代謝過程持續(xù)受阻,細胞內(nèi)呼吸持續(xù) 受到抑制，蒼白球和黑質(zhì)區(qū)域富含細胞色素 C 氧化酶,是 CO 易結(jié)合的部位,從而 成為 DNS 易累及部位[29-31]。 5.1.2 血液異常 急性中毒后全血粘度持續(xù)異常升高，對微循環(huán)產(chǎn)生不利影響，進而導致腦循 環(huán)發(fā)生障礙，影響腦灌注。缺氧環(huán)境造成血管內(nèi)皮細胞損傷，內(nèi)膜粗糙，血管內(nèi) 皮細胞脫落，內(nèi)皮下裸露的彈力纖維激活血小板，促使血小板聚集并發(fā)生粘附， 形成微栓子，使腦內(nèi)白質(zhì)彌散性缺血缺氧形成脫髓鞘改變。大腦白質(zhì)毛細血管的 數(shù)量僅為灰質(zhì)的 1/ 3 ,以蒼白球為中心的基底節(jié)區(qū),是大腦中動脈供血的邊緣地帶, 側(cè)支循環(huán)較少[36