過(guò)氧化氫酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目二、過(guò)氧化氫酶的活力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 姓 名： 趙家熙 指導(dǎo)教師: 譚志文 實(shí)驗(yàn)室: 6503 組員：①章恒炯 ② ③成績(jī)： 第三部分：實(shí)驗(yàn)記錄與分析 一、酶活力測(cè)定 （一）原始數(shù)據(jù) 1 .樣品原始質(zhì)量：5.032g 2 .標(biāo)定數(shù)據(jù)： （1） KMnO 4質(zhì)量數(shù)及配制：158 （2） Na 2c2O4 質(zhì)量數(shù)：134 （3）標(biāo)定數(shù)據(jù)：0.02mol/L （4） KMnO 4 實(shí)際濃度:0.019mol/L 3 .樣品滴定數(shù)據(jù) 消耗高鎰酸鉀溶液（ml ）:實(shí)驗(yàn)（1） 0.65 實(shí)驗(yàn)（2） 0.50 對(duì)照（1） 1.45 對(duì)口咐（2） 1.30 （二）結(jié)果計(jì)算 1 .換算系數(shù)（1mL KMnO 4溶液相當(dāng)于多少 mg H 2O2） 1.7 2 .樣品酶活計(jì)算（每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示: mg H 202/g ?min ） 酶活(mgH2O2/g min)= (A B) Vt 1.7 FW V 1 t (A-B) =0.8 Vt=20.25 FW=5.032 Vi=2.5ml t=10min 酶活(mgH2O2/g min)=0.218 二、動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定 （一）原始數(shù)據(jù) 編號(hào) 1 2 3 4 5 消耗的 KMnO 4 (mL ) 0.10 0.10 0.40 0.30 0.30  （二）求出各管反應(yīng)前的底物濃度[S]0和反應(yīng)速度V0 編號(hào) 1 2 3 4 5 [S]o (mol/L ) 0.005 0.0067 0.0082 0.0125 0.0250 Vo (mmol/min ) 0.0099 0.0124 0.0126 0.0221 0.0471 (三)以1/V 0對(duì)1/[S] 0作圖(用excel作圖) 1/s 200 149.2 121.9 80 40 1/v 111.1 80.6 79.3 45.1 21.2 (四)求出 Km (mol/L )和 Vmax (mmol/min ) 1 Km 1 —— -r v Vmax[S] Vmax 如(三)中圖 y=0.5572x+1.5829 x=0 時(shí) y=1/Vmax y=0 時(shí) x=-1/Km Km=0.35 Vmax=0.63 第四部分：課后研討題 1 .總結(jié)本實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程的注意事項(xiàng)。 1酶的提取和存放一般在0-4 C下進(jìn)行。 2每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的酶促反應(yīng)時(shí)間要精確控制在 5min。 3各反應(yīng)瓶的滴定終點(diǎn)微紅色為同一標(biāo)準(zhǔn)。 4使用前應(yīng)檢查滴定管是否滲漏，滴定過(guò)程中應(yīng)該保證逐滴加入。 2 .影響過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定的因素有哪些 ？ 1、溫度，溫度過(guò)高或者過(guò)低會(huì)降低過(guò)氧化氫酶的活性。 2、酸堿度，酸或堿濃度太高會(huì)使過(guò)氧化氫酶失活。 3 .過(guò)氧化氫酶與哪些生化過(guò)程有關(guān)？ R(Fe2+)+H 2O2 = R(Fe3++OH -) R(Fe3+ OH -)2+H 2O2 = R(Fe2+)2+2H 2O+O 2 過(guò)氧化氫酶 t 2 H.O2 2H2O+O2 4. 在反應(yīng)速度的測(cè)定中，加入硫酸有哪些作用？ 終止反應(yīng)，為下一步的滴定提供酸的環(huán)境。 5. 米氏方程中的Km有何實(shí)際應(yīng)用？ 米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)速度n為最大酶促反應(yīng)速度值一半時(shí)的底物濃度?？捎糜谂? 斷反應(yīng)級(jí)數(shù)；判斷是否為不同種酶； 判斷酶的最適底物； 確定酶活性測(cè)試時(shí)所需 底物的濃度。 6. 在什么條件下，酶的 Km 可以作為鑒定酶的一種手段，為什么？ 當(dāng)hVmax/2時(shí)，Km=[S]。Km值是酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃 度。 Km 值對(duì)某一特定酶來(lái)說(shuō)是個(gè)常數(shù)。一半根據(jù)酶的 Km 值來(lái)判斷這些酶是 否是完全相同的酶，或是催化同一反應(yīng)的一類酶。 Km 值越大，酶與底物親和 力越?。?Km 值越小，酶與底物親和力越大。 7. 測(cè)定酶活力為什么要在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行？ 進(jìn)程曲線是在酶反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時(shí)間測(cè)產(chǎn)物生成量的方法， 以酶 反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成。從進(jìn)程曲線可知， 在曲線起 始一段時(shí)間內(nèi)為直線，其斜率代表初速度。隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，曲線趨于平坦，斜 率變小， 說(shuō)明酶的反應(yīng)速度下降。 反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低這一現(xiàn)象可 能是由于底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應(yīng)加強(qiáng)等原因所致。 8. 過(guò)氧化氫酶的活力測(cè)定還有另外一種方法，即紫外吸收法，原理是 H2O2 在 240nm 波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫， 使反應(yīng)溶液吸光度 (A240) 隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變 化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活力。 請(qǐng)你查閱資料設(shè)計(jì)一個(gè)應(yīng)用該方 法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活力的實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)概要 本實(shí)驗(yàn)用紫外吸收法測(cè)定了過(guò)氧化氫酶的活性。 主要試劑 0.2mol/L pH7.8 磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯叱咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2 （用 0.1mol/L 高鈕酸鉀標(biāo)定）。 主要設(shè)備 紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；250ml容量瓶1個(gè)；0.5ml刻度吸管2支， 2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水浴。 實(shí)驗(yàn)步驟 1.酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織 0.5g置研缽中，加入2?3ml 4 c下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后， 轉(zhuǎn)入25ml容量瓶 中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐? 5 c冰箱中靜置10min ,取上部澄清液在4000rpm 下離心15min ,上清液即為 過(guò)氧化氫酶粗提液。5C下保存?zhèn)溆谩? 2 .測(cè)定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表順 序加入試劑。 表紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表 管號(hào) S1 S2 S3 粗酶液（ml） 0.2 0.2 0.2 pH7.8 磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 蒸儲(chǔ)水（ml） 1.0 1.0 1.0 25 C預(yù)熱后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L 的H2O2 ,每加完一管立即記時(shí)，并迅速 倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min , 待3支管全部測(cè)定完后，按下式計(jì)算酶活性。 3 .結(jié)果計(jì)算： 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。 44犯 x Vt 過(guò)氧化氫酶活性（u/gFW/min尸 一！.?二? （Ast 4- Rsz） 式中 A240 = AS0 — 2 AS0 一加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值； AS1, AS2 一樣品管吸光值； Vt 一粗酶提取液總體積（ml）; V1 —測(cè)定用粗酶液體積（ml）; FW一樣品鮮重（g）; 0.1 — A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位（u）; t—加過(guò)氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間（min）。 注意事項(xiàng) 凡在 240nm 下有強(qiáng)吸收的物質(zhì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)有干擾。 教師評(píng)閱 簽名 8