生物技術(shù)制藥第版疫苗及其制備技術(shù)

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1、,*,,,,,,,,,,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級(jí),,第三級(jí),,第四級(jí),,第五級(jí),,,第五章 疫苗及其制備技術(shù),疫苗（,Vaccine,）,傳統(tǒng)概念：將,病原微生物（細(xì)菌、病毒、真菌等）及其代謝產(chǎn)物,，經(jīng)過(guò),人工減毒,、,滅活,或利用,基因工程,等方法制成的用于,預(yù)防傳染病,的免疫制劑。,,,世界衛(wèi)生組織的擴(kuò)大免疫措施（,EPI,）,——,兒童免疫程序表,,,、成人,現(xiàn)代疫苗：,治療性疫苗,、,非感染性疾病疫苗,,疫苗學(xué)（,Vaccinology,）,,本章學(xué)習(xí)要求,掌握,：疫苗、基因工程疫苗、聯(lián)合疫苗的概念及常見(jiàn)疫苗的制備技術(shù),,熟悉,：疫苗的原理、類型

2、、特點(diǎn)及主要用途,,了解,：疫苗發(fā)展的歷程與趨勢(shì)、疫苗產(chǎn)業(yè)的特點(diǎn)與應(yīng)用,本章內(nèi)容,概述,,疫苗的組成、作用原理、類型與特點(diǎn),,疫苗的制備方法,,疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制,,疫苗產(chǎn)業(yè)的特點(diǎn)及應(yīng)用概況,,,第一節(jié) 概述,一、疫苗的產(chǎn)生,,“,12,世紀(jì)，中國(guó)開(kāi)始用人痘接種預(yù)防天花”,,《,疫苗可預(yù)防疾病的流行病學(xué)與預(yù)防學(xué),》,第,6,版，美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（,CDC,）,2000,年出版,一、疫苗的產(chǎn)生,天花（,Smallpox,）,,由,天花病毒,引起的一種烈性傳染病,,天花病毒,：呈磚形，能對(duì)抗干燥和低溫，在痂皮、塵土和被服上可生存數(shù)月至一年半之久,,臨床表現(xiàn),：主要為嚴(yán)重毒血癥狀、皮膚成批依次

3、出現(xiàn)斑疹、丘疹、皰疹、膿皰，最后結(jié)痂、脫痂，遺留痘疤。,,傳播途徑,：飛沫吸入或直接接觸。,,特點(diǎn),：發(fā)展迅速，未免疫人群感染后,15-20,天內(nèi)致死率高達(dá),30,％。,一、疫苗的產(chǎn)生,天花的防治,——,中國(guó),,宋真宗時(shí)期（,998- 1023,年） ：人痘法，吸入天花病人痂粉預(yù)防天花。,,明朝隆慶年間（,1567-1572,年）：痘衣法、痘漿法、旱痘法和水苗法等多種接種方法出現(xiàn)。,,清朝順治死于天花，得過(guò)天花的康熙繼位,,人痘法的,缺點(diǎn),：有時(shí)也會(huì)引起嚴(yán)重的天花,一、疫苗的產(chǎn)生,天花的防治,——,歐洲,,1721,年，人痘接種法傳入英國(guó),,1796,年，英國(guó)醫(yī)生,E. Jenner,利用牛痘

4、防治天花,,1798,年，醫(yī)學(xué)界正式承認(rèn)“疫苗接種確實(shí)是一種行之有效的免疫方法”。,,細(xì)胞培養(yǎng)法獲得天花病毒,——,牛痘苗,,,一、疫苗的產(chǎn)生,疫苗之父,---,法國(guó)免疫學(xué)家,Louis Pasteur,,雞霍亂弧菌減毒株,（第一個(gè)細(xì)菌減毒活疫苗）,,一、疫苗的產(chǎn)生,巴斯德與狂犬病疫苗,,異體傳代法：將狂犬病毒在兔體內(nèi)經(jīng)連續(xù)傳代，獲得了,減毒株,一、疫苗的產(chǎn)生,巴斯德在疫苗領(lǐng)域的卓越貢獻(xiàn),,細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù),,減毒菌株的獲得,,連續(xù)傳代培養(yǎng)法,,高溫培養(yǎng)法,,異體傳代法,,巴氏減毒菌苗,的發(fā)明：為實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)建立了基礎(chǔ),,二、疫苗及其技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,（一）減毒活疫苗技術(shù),——,第一次疫苗革命,

5、,（二）基因重組疫苗技術(shù),——,第二次疫苗革命,,（三）反向疫苗學(xué)技術(shù),——,第三次疫苗革命,,二、疫苗及其技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,（一）減毒活疫苗技術(shù),——,細(xì)胞水平,,人為處理使病原微生物失去毒力或降低毒力,,例：卡介苗（,Bacillus Calmette-Guérin, BCG,，使用活的無(wú)毒牛型結(jié)核桿菌制成,）、,炭疽疫苗、狂犬疫苗,,二、疫苗及其技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,藥物毒理：,,結(jié)核菌是細(xì)胞內(nèi)寄生菌,——,細(xì)胞免疫,,用無(wú)毒卡介菌（結(jié)核菌）人工接種進(jìn)行初次感染，經(jīng)過(guò)巨噬細(xì)胞的加工處理，將其抗原信息傳遞給免疫活性細(xì)胞，使,T,細(xì)胞分化增殖，形成致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體再遇到結(jié)核菌感染時(shí)，巨噬細(xì)胞和致

6、敏淋巴細(xì)胞迅速被激活，執(zhí)行免疫功能，引起,特異性免疫反應(yīng),。,二、疫苗及其技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,（二）基因重組疫苗技術(shù),——,分子水平,,基因重組技術(shù)研究相關(guān)基因和蛋白質(zhì)產(chǎn)物,,例：乙肝疫苗（乙型肝炎表面抗原）,二、疫苗及其技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,血源乙肝疫苗,：無(wú)癥狀,HBsAg,攜帶者血漿提取的,HBsAg,，經(jīng)純化，滅活及添加佐劑制成。,,基因重組（轉(zhuǎn)基因）乙肝疫苗,：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建含有乙肝病毒,HBsAg,基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入酵母（或重組,CHO,細(xì)胞）表達(dá)乙型肝炎表面抗原，在繁殖過(guò)程中產(chǎn)生未糖基化的,HBsAg,多肽，經(jīng)破碎酵母菌體，顆粒形未糖基化的,HBsAg,多肽釋放，經(jīng)純化，滅活，添加

7、佐劑制成。,,二、疫苗及其技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,基因工程技術(shù)在疫苗領(lǐng)域應(yīng)用,,構(gòu)建無(wú)毒或減毒疫苗：毒素基因突變,,構(gòu)建載體活疫苗：目的基因克隆至臨床常規(guī)使用的活疫苗中,二、疫苗及其技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,（三）反向疫苗學(xué)技術(shù),——,蛋白質(zhì)水平,,全基因水平篩選具有保護(hù)性免疫反應(yīng)的候選抗原,,具體步驟：,,1.,基因組信息分析結(jié)合基因芯片篩選候選疫苗成分,,2.,高通量基因重組表達(dá)候選疫苗蛋白成分,,3.,免疫保護(hù)性測(cè)試,二、疫苗及其技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,例：,B,型腦膜炎球菌（,meningococcus B,）,,,先用計(jì)算機(jī)分析,B,型腦膜炎球菌的基因組，找到,600,個(gè)潛在的疫苗候補(bǔ)，將其中,350,個(gè)在大

8、腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，然后將蛋白提純用于免疫小鼠，其中找到,29,個(gè)蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體，從而達(dá)到預(yù)防免疫的作用,。,,第二節(jié) 疫苗的組成、作用原理、類型與特點(diǎn),一、疫苗組成,,抗原,,佐劑,,防腐劑,,穩(wěn)定劑,,滅活劑,,緩沖液、鹽類等非活性成分,一、疫苗組成,1.,抗原（,antigen,，,Ag,）,,疫苗最主要的有效活性成分,,免疫原性（,immunogenicity,）,：刺激機(jī)體特異性免疫細(xì)胞活化、增殖、分化并產(chǎn)生免疫效應(yīng)物。,,免疫反應(yīng)性（,immunoreactivity,）,：與免疫效應(yīng)物發(fā)生特異性結(jié)合而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。,,一、疫苗組成,常用抗原包括：,,,滅活病毒或細(xì)菌,,活

9、病毒或細(xì)菌（減毒株）,,病毒或菌體提純物,,有效蛋白成分,,類毒素,,細(xì)菌多糖,,合成多肽,,,核酸,,2.,佐劑（,adjuvant,）,,非特異性增強(qiáng)抗原免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。,,要求：安全無(wú)毒、 在非冷藏條件下穩(wěn)定,,作用機(jī)制：改變抗原的物理形狀，延長(zhǎng)抗原在機(jī)體內(nèi)保留時(shí)間,,刺激單核巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的遞呈能力,,,刺激淋巴細(xì)胞分化，增加擴(kuò)大免疫應(yīng)答能力,一、疫苗組成,,一、疫苗組成,常用佐劑：,,用于人體：鋁佐劑,/ MF59,（水包油的乳劑）,,動(dòng)物試驗(yàn)：弗氏完全佐劑（,FCA,）,/,弗氏不完全佐劑（,FIA,）,,3.,防腐劑,,大多數(shù)的,滅活疫苗,都使用防腐劑,,目的

10、,：防止外來(lái)微生物的污染,,常用：,0.01,％～,0.02,％硫柳汞,,2-,苯氧乙醇,,氯仿,,副作用,： 接觸性皮炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、耳毒性,一、疫苗組成,4.,穩(wěn)定劑,,目的,：保證作為抗原的病毒或其他微生物存活，并保持免疫原性,,凍干疫苗,中常用：乳糖、明膠、山梨醇等。,一、疫苗組成,5.,滅活劑,,滅活病毒或細(xì)菌抗原的方法：,物理方法,（如加熱、紫外線照射等）,化學(xué)方法,（丙酮、酚、甲醛等）,,對(duì)人體有一定毒害作用，因此在滅活抗原后必須及時(shí)從疫苗中,除去,，并經(jīng)嚴(yán)格檢定以保證疫苗的安全性。,一、疫苗組成,6.,緩沖液、鹽類,,緩沖液的,種類,、鹽類的,含量,都可影響疫苗的效力、純度和

11、安全性，因此都有嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),一、疫苗組成,二、疫苗作用原理,當(dāng)機(jī)體經(jīng)過(guò)口服或注射等途徑接種疫苗后，其中的抗原分子刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高效價(jià)特異性的免疫保護(hù)物質(zhì),,當(dāng)機(jī)體再次接觸到相同病原菌抗原時(shí)，免疫系統(tǒng)依循免疫記憶，迅速制造出保護(hù)物質(zhì)來(lái)阻斷病原菌的入侵，從而使機(jī)體獲得針對(duì)病原體特異性的免疫力，使其免受侵害而獲得保護(hù)。,三、疫苗的類型與特點(diǎn),（一）減毒活疫苗,,（二）滅活疫苗,,（三）亞單位疫苗,,（四）聯(lián)合疫苗,,（五）核酸疫苗,,（六）治療性疫苗,三、疫苗的類型與特點(diǎn),（一）減毒活疫苗,（,live attenuated vaccine,）,,通過(guò)一定方法使病原體的,致病性減弱或喪失,

12、后獲得的由,完整微生物,組成的疫苗制品,,特點(diǎn)：能引發(fā)機(jī)體感染但不發(fā)生臨床癥狀，但其免疫原性可引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的記憶,B,細(xì)胞和記憶,T,細(xì)胞，起到獲得長(zhǎng)期或終生保護(hù)的作用。,,三、疫苗的類型與特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：,,接種次數(shù)少，反應(yīng)小，免疫效果好（體液免疫、細(xì)胞免疫、黏膜免疫），成本低,,缺點(diǎn)：,,穩(wěn)定性差，有毒力返祖現(xiàn)象，污染環(huán)境，免疫缺陷者不能接種,三、疫苗的類型與特點(diǎn),,,三、疫苗的類型與特點(diǎn),（二）滅活疫苗,（,inactivated vaccine,）,,將病原體經(jīng)培養(yǎng)增殖、,滅活,、純化處理后獲得的保留,病原體幾乎全部組分,的疫苗制品。,,特點(diǎn)：失去了病原體的感染性，

13、但保留了較強(qiáng)的免疫原性和較好的安全性,,三、疫苗的類型與特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：,,穩(wěn)定性好，反應(yīng)小，免疫缺陷者也可接種,,缺點(diǎn)：,,需多次接種，免疫效果較差（體液免疫），需要量大,三、疫苗的類型與特點(diǎn),三、疫苗的類型與特點(diǎn),（三）亞單位疫苗,（,subunit vaccine,）,,,利用微生物的,某種表面結(jié)構(gòu)成分,制成的能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗制品。,,分類：,,純化亞單位疫苗：?jiǎn)蝹€(gè)蛋白或寡糖組成、佐劑,,合成肽亞單位疫苗：抗病毒,/,腫瘤,/,細(xì)菌、寄生蟲(chóng)感染,,基因工程亞單位疫苗,,三、疫苗的類型與特點(diǎn),基因工程亞單位疫苗（,genetic engineering subunit vaccine,

14、）,,在分離出病原體特異抗原編碼基因的基礎(chǔ)上，將外源基因轉(zhuǎn)入非致病性微生物內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物，然后通過(guò)分離純化獲得的特異蛋白質(zhì)。,,原核細(xì)胞（大腸桿菌）、真核細(xì)胞（酵母）,,活載體疫苗（細(xì)菌、病毒）、轉(zhuǎn)基因植物疫苗,三、疫苗的類型與特點(diǎn),三、疫苗的類型與特點(diǎn),（四）聯(lián)合疫苗,（,combined vaccine,）,,兩種或兩種以上抗原物理混合后制成的疫苗制劑。,,多聯(lián)疫苗（,multi-combined vaccine,）,：預(yù)防不同病原微生物引起的傳染?。ɡ喊侔灼疲?,多價(jià)疫苗（,multivalent vaccine,）,：預(yù)防由同一病原微生物不同亞型引起的傳染?。ɡ?23,價(jià)肺炎多糖疫苗）

15、,三、疫苗的類型與特點(diǎn),三、疫苗的類型與特點(diǎn),（五）核酸疫苗,（,nucleic acid vaccine,）,,也稱基因疫苗（,genetic vaccine,），包括,DNA,疫苗和,RNA,疫苗。,,由,抗原的編碼基因,和,載體,組成，,,導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞后可通過(guò)宿主細(xì),,胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達(dá)蛋白抗原，,,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的疫苗制劑。,三、疫苗的類型與特點(diǎn),DNA,疫苗（,DNA vaccine,）,,將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。,,特點(diǎn)：免疫效果好，制備方便，可重復(fù)使用，可用于免疫治療和聯(lián)合免疫,,三、疫苗

16、的類型與特點(diǎn),三、疫苗的類型與特點(diǎn),（六）治療性疫苗,（,therapeutic vaccine,）,,在已感染病原微生物或已患有某些疾病的機(jī)體中，通過(guò)誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答，達(dá)到治療或防止疾病惡化的疫苗制品。,,最早的治療性疫苗：狂犬病疫苗,,三、疫苗的類型與特點(diǎn),1.,基于組成成分及性質(zhì)的分類,,（,1,）蛋白質(zhì)復(fù)合重構(gòu)的治療性疫苗,,改造,靶抗原的結(jié)構(gòu)或組合,，使其相似而又有異于傳統(tǒng)疫苗的靶抗原，重新喚起患者的,功能性免疫應(yīng)答,，進(jìn)而打破和逆轉(zhuǎn)患者的免疫耐受狀態(tài)。,,改造方法：蛋白修飾，結(jié)構(gòu),/,構(gòu)型改造，蛋白復(fù)合,/,多肽偶聯(lián),三、疫苗的類型與特點(diǎn),（,2,）基因疫苗,,DNA,疫苗：埃

17、博拉（,Ebola,）疫苗、乙型肝炎（,HBV,）疫苗、丙型肝炎（,HCV,）疫苗、人免疫缺陷病毒（,HIV,）疫苗等,,RNA,疫苗：,RNA,修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞（,DC,）疫苗等,,三、疫苗的類型與特點(diǎn),（,3,）多水平基因修飾細(xì)胞疫苗,,腫瘤治療性疫苗：腫瘤細(xì)胞,/DC,細(xì)胞疫苗,,制備過(guò)程：,,三、疫苗的類型與特點(diǎn),2.,基于治療疾病種類的分類,,（,1,）感染性疾病的治療性疫苗,,（,2,）腫瘤治療性疫苗,,（,3,）自身免疫性疾病的治療性疫苗,,（,4,）移植用治療性疫苗,三、疫苗的類型與特點(diǎn),三、疫苗的類型與特點(diǎn),,,預(yù)防性疫苗,治療,性疫苗,病原體蛋白,不需改造,需經(jīng)分子設(shè)計(jì)和重

18、新構(gòu)建,受用者,健康人體,患者,監(jiān)測(cè)手段,保護(hù)性抗體產(chǎn)生情況,疾病改善情況,激發(fā)免疫應(yīng)答類型,體液免疫為主,細(xì)胞免疫為主,第三節(jié) 疫苗的制備方法,滅活全毒疫苗,——,流感全病毒滅活疫苗,,減毒活疫苗,——,皮內(nèi)注射用卡介苗,,基因工程重組亞單位疫苗,——,重組乙型肝炎疫苗,,生化提取亞單位組分疫苗,——,吸附破傷風(fēng)疫苗,,治療性疫苗,——,前列腺癌疫苗,Sipuleucel-T,,疫苗生產(chǎn)的一般流程,一、,滅活全毒疫苗,——,流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,本品系用世界衛(wèi)生組織（,WHO,）推薦的并經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督

19、管理局批準(zhǔn)的,流感病毒株,，分別接種,雞胚,，經(jīng),培養(yǎng)、收獲病毒液，病毒滅活、濃縮和純化,后制成。,,用于預(yù)防,本株病毒,引起的流行性感冒,一、,流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,The?influenza vaccine is an,annual vaccination,using a vaccine that is specific for a given year to protect against the highly variable,influenza virus,.,,,,Each seasonal i

20、nfluenza vaccine contains antigens representing three (,trivalent vaccine,) or four (,quadrivalent vaccine,) influenza?virus strains: two influenza type A virus strains, and either one or two influenza type B virus strains.,,,流感病毒,甲型流感病毒,（Influenza A virus）,,最,容易,發(fā)生變異（抗原轉(zhuǎn)變、抗原漂移）,,世界性流感大流行：甲型流感病毒出現(xiàn),

21、新亞型,或,舊亞型重現(xiàn),引起,,甲型流感病毒根據(jù),H,(hemagglutinin,，血凝素,),和,N,(neuraminidase,，神經(jīng)氨酸酶,),抗原不同分為許多亞型，,H,有,17,個(gè)亞型（,H1,～,H17,），,N,有,10,個(gè)亞型（,N1,～,N10,）。,,H1,、,H5,、,H7,亞型為高致病性,流感病毒,乙型流感病毒,（Influenza B virus）,,抗原變異,很慢,,局限性流行,，對(duì)人類致病性較低,,丙型流感病毒,（Influenza C virus）,,抗原,穩(wěn)定,,致病力較弱，主要侵犯,幼兒和免疫力低下的人群,，只引起人類不明顯的或輕微的上呼吸道感染,一、,

22、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,Influenza vaccines may be?administered?as an,injection,or as a,nasal spray,.,,The U.S.?Centers for Disease Control and Prevention recommend that everyone,over the ages of 6 months,should receive the seasonal influenza vaccine.,,Vaccination campa

23、igns?usually focus on people who are at,high risk of?serious complications?if they catch the flu,, such as the elderly and people living with chronic illness?or those with?weakened immune systems, as well as health care workers.,一、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,（一）制備方法,,1.,生產(chǎn)

24、用原材料,,雞胚是,分離各類病毒,的較為理想的材料,尿囊腔,,一、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,（,1,）雞胚,,毒種傳代和制備：來(lái)源于,SPF,（,Specific pathogen Free,）雞群,,疫苗生產(chǎn)：來(lái)源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的健康雞群、,9-11,日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng),,（,2,）毒種,,WHO,推薦并提供的甲型和乙型流感病毒株,一、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,2.,毒種種子批的建立及檢定,,符合“生物制品生產(chǎn)檢定

25、用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定,一、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,2.,毒種種子批的建立及檢定,,建立,：以毒種為基礎(chǔ)傳代（,5,代以內(nèi),得成品疫苗）,,血凝素型別鑒定試驗(yàn),血凝抑制試驗(yàn),,,單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn),,病毒滴度：雞胚半數(shù)感染劑量法,,血凝滴度：血凝法,,無(wú)菌檢查、支原體檢查,,外源性禽白血病病毒、禽腺病毒檢測(cè)：,ELISA,,保存,：凍干毒種,-20℃,以下，液體毒種,-60 ℃,以下,,,檢定,一、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,3.

26、,單價(jià)原液的制備,,各流感病毒工作種子批,分別,接種,,（,尿囊腔,），,33-35,℃,培養(yǎng),48-72h,,病毒收獲（,尿囊液,）,,收獲液檢定,,,微生物限度：菌數(shù),<10,5,CFU/ml,，沙門氏菌為陰性,,血凝滴度,,收獲液合并,,一、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,3.,單價(jià)原液的制備,,病毒滅活（,甲醛,≤,200,μ,g/ml,）、驗(yàn)證及內(nèi)毒素含量測(cè)定,,濃縮（,超濾,）、純化（,柱色譜法、蔗糖密度區(qū)帶離心,）及過(guò)濾除菌（,硫柳汞,）,,單價(jià)原液保存（,2-8,℃,）,一、流感全病毒滅活疫苗（,in

27、actiated influenza whole virion vaccine,）,4.,半成品的制備,,對(duì)單價(jià)原液根據(jù),相同血凝素含量,進(jìn)行配制：,15-18,μ,g/,劑,,補(bǔ)加硫柳汞,,5.,成品的制備,,半成品,分批、分裝及凍干后包裝,：,0.5-1.0ml/,劑，含各型流感病毒株血凝素為,15,μ,g/,劑,,一、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,（二）檢定要求,,1.,單價(jià)原液的檢定,,鑒別試驗(yàn)：血凝抑制試驗(yàn)、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn),,病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)：雞胚存活率、血凝試驗(yàn),,血凝素含量檢測(cè)：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散試驗(yàn),一

28、、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,2.,半成品的檢定,,游離甲醛含量,≤,50,μ,g/,劑,,硫柳汞含量,≤,50,μ,g/,劑,,血凝素含量：配制量的,80%-120%,,無(wú)菌檢查,一、流感全病毒滅活疫苗（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,3.,成品的檢定,,鑒別：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散試驗(yàn),,外觀：乳白色液體，無(wú)異物,,pH,值：,6.8-8.0,,硫柳汞含量,≤,50,μ,g/,劑,,蛋白質(zhì)含量,≤,200,μ,g/,劑,,血凝素含量：配制量的,80%-120%,

29、,卵清蛋白含量,≤,250 ng/,劑,,抗生素殘留量,≤,50 ng/,劑,一、流感全病毒滅活疫苗,（,inactiated influenza whole virion vaccine,）,二、減毒活疫苗,——,皮內(nèi)注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,本品系用,卡介菌,經(jīng)培養(yǎng)后，,收集菌體，加入穩(wěn)定劑凍干,制成,,二、皮內(nèi)注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,（一）基本要求,,生產(chǎn)車間、設(shè)備及器具專用,,制造、包裝過(guò)程避光,,工作人員：身體健康、無(wú)結(jié)核病,二、皮內(nèi)注射用卡介

30、苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,（二）制備方法,,1.,生產(chǎn)用菌種：,,符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定,,卡介菌,D,2,PB 302,菌株,,二、皮內(nèi)注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,2.,種子批的建立及檢定,(<12,代,),,培養(yǎng)特性：菌落特征（多皺、微黃菌膜）,,毒力試驗(yàn)（豚鼠腹腔注射）：體重不減輕，解剖觀察,,無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn)（豚鼠皮下注射）：體重不減輕，解剖觀察,,免疫力試驗(yàn)（豚鼠皮下注射）：解剖分析,,保存：凍干，,8 ℃,以下,二、皮內(nèi)注射用卡介苗

31、（,BCG vaccine for intradermal injection,）,3.,原液的制備,,生產(chǎn)用種子：工作種子批,,生產(chǎn)用培養(yǎng)基：液體蘇通培養(yǎng)基等,,接種與培養(yǎng)：,37-39℃,靜止培養(yǎng),,收獲和合并：收集,菌膜,，壓干，研磨，加入,穩(wěn)定劑,稀釋,二、皮內(nèi)注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,4.,半成品的制備,,穩(wěn)定劑稀釋：,0.5-1.0mg/ml,,5.,成品的制備,,分裝、凍干、封口保存,二、皮內(nèi)注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,（三）檢定要求,,1.,

32、原液檢定,,純菌檢查：涂片鏡檢,,濃度測(cè)定：參照標(biāo)準(zhǔn)品，分光光度法檢測(cè),,2.,半成品的檢定,,沉降率測(cè)定：靜置，分光光度法檢測(cè),,活菌數(shù)測(cè)定≥,1.0×10,7,CFU/mg,,活力測(cè)定：,XTT,法,二、皮內(nèi)注射用卡介苗（,BCG vaccine for intradermal injection,）,3.,成品的檢定,,鑒別試驗(yàn)：,抗酸染色涂片,,外觀：白色疏松體或粉末狀，加水成均勻懸液,,水分,≤,3.0%,,效力測(cè)定（豚鼠皮下注射）：局部硬結(jié)反應(yīng),,活菌數(shù)測(cè)定≥,1.0×10,6,CFU/mg,,無(wú)有毒分支桿菌試驗(yàn)（豚鼠皮下注射）：體重不減輕，解剖觀察,,熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：,37 ℃,放

33、置,28,天，計(jì)算活菌率,三、基因工程亞單位疫苗,——,重組乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,由,重組酵母細(xì)胞,表達(dá)的,乙型肝炎表面抗原,，經(jīng),純化、滅活及加入佐劑吸附,制成。,三、重組乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,（一）制備方法,,1.,生產(chǎn)用菌種：,,基因重組構(gòu)建的表達(dá),HBsAg,的重組釀酒酵母原始菌種,三、重組乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,2.,種子批的建立及檢定,,符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定,,建立：原始菌種傳

34、代,,培養(yǎng)物純度：無(wú),細(xì)菌,和,其他真菌,檢出,,HBsAg,基因序列測(cè)定,,檢定 質(zhì)粒保有率：平板復(fù)制法,,活菌率：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,,抗原表達(dá)率：蛋白質(zhì)含量、,HBsAg,含量,,保存：工作種子批,-70,℃保存，其余液氮保存,,三、重組乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,3,.,原液的制備,,發(fā)酵：錐形瓶、種子罐、生產(chǎn)罐三級(jí)發(fā)酵,,純化：細(xì)胞破碎（,Triton X-100,） 、硅膠吸附、疏水色譜純化、硫氰酸鹽處理、稀釋、過(guò)濾除菌,,保存：,2-8 ℃,，不超過(guò),3,個(gè)月,三、重組乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis

35、 B vaccine,）,4.,半成品的制備,,甲醛處理：,100,μ,g/ml,,鋁吸附,,配制：與鋁佐劑等量混合,,5.,成品的制備,,分批、分裝及凍干后包裝,三、重組乙型肝炎疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,（二）檢定要求,,1.,原液檢定,,特異蛋白帶：,SDS-PAGE,，,20-25kD,蛋白帶,,N-,端氨基酸序列測(cè)定：氨基酸序列分析儀,,純度：,免疫印跡法,、,高效液相色譜法,,2.,半成品的檢定,,吸附完全性≥,95%,,硫氰酸鹽含量＜,1.0,μ,g/ml,,Triton X-100,含量＜,15.0,μ,g/ml,三、重組乙型肝炎

36、疫苗（,recombinant Hepatitis B vaccine,）,3.,成品的檢定,,鑒別試驗(yàn)：,ELISA,,外觀：乳白色混懸液,,pH,值：,5.5-7.2,,鋁含量,:0.35-0.62 mg/ml,四、生化提取亞單位組分疫苗,——,吸附破傷風(fēng)疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,本品系采用,破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌,，在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,提取破傷風(fēng)毒素蛋白,經(jīng),甲醛脫毒、精制，加入氫氧化鋁佐劑,制成。,四、吸附破傷風(fēng)疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,（一）制備方法,,1.,生產(chǎn)用菌種：產(chǎn)毒效價(jià)高、免疫力強(qiáng)的破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌,

37、四、吸附破傷風(fēng)疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,2.,種子批的建立及檢定,,符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定,,建立：原始菌種傳代,,培養(yǎng)特性：,專性厭氧菌,、培養(yǎng)觀察,,染色鏡檢：,革蘭氏染色,,檢定 生化反應(yīng)：不發(fā)酵糖類、不還原硝酸鹽等,,產(chǎn)毒試驗(yàn),(,小鼠皮下注射,),：觀察癥狀,,特異性中和試驗(yàn),(,小鼠皮下注射,),：觀察癥狀,,保存：,2-8,℃,,四、吸附破傷風(fēng)疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,3.,類毒素原液的制備,,毒素的獲得：微生物培養(yǎng)，離心上清，除菌過(guò)濾,,脫毒（甲醛）及檢定（豚鼠皮下注射）：體重、癥狀

38、,,精制：等電點(diǎn)沉淀、鹽析、超濾等，加,硫柳汞,,保存：,2-8 ℃,四、吸附破傷風(fēng)疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,4.,半成品的制備,,佐劑配制：氫氧化鋁,,吸附類毒素的配制：,7-10 Lf/ml,,5.,成品的制備,,分批、分裝、凍干后包裝,四、吸附破傷風(fēng)疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,（二）檢定要求,,1.,類毒素原液檢定,,pH,值：,6.6-7.4,,純度：,1500Lf/mg,蛋白氮,,特異性毒性檢查（豚鼠皮下注射）：體重、癥狀,,毒性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)（豚鼠皮下注射）：體重、癥狀,,2.,半成品的檢定,,無(wú)菌檢查,四、吸附破傷風(fēng)

39、疫苗（,adsorbed tetanus vaccine,）,3.,成品的檢定,,鑒別試驗(yàn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、絮狀試驗(yàn)、凝膠免疫沉淀,,外觀：乳白色懸液,,化學(xué)檢定：,pH,、氫氧化鋁、硫柳汞、甲醛等含量,,效價(jià)測(cè)定≥,40IU/,劑,,特異性毒性檢查（豚鼠皮下注射）：體重、癥狀,五、治療性疫苗,——,前列腺癌疫苗,Sipuleucel-T,DENDREON,公司的自體細(xì)胞免疫療法,,2010,年批準(zhǔn)上市，首個(gè)被,FDA,批準(zhǔn)的治療性癌癥疫苗,五、治療性疫苗,——,前列腺癌疫苗,Sipuleucel-T,基本步驟,:,,采集患者的,外周血單個(gè)核細(xì)胞,，培養(yǎng)生成,抗原提呈細(xì)胞,（樹(shù)枝狀細(xì)胞,),,樹(shù)枝狀

40、細(xì)胞在培養(yǎng)條件下用基因工程制備的,融合蛋白,（,PA2024,）孵育,,,這種融合蛋白由兩部分組成,:,抗原,-,前列腺酸性磷酸酶,（,PAP,），,PAP,能在,95%,的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá),;,粒細(xì)胞,-,巨噬細(xì)胞集落刺激因子,（,GM-CSF),,一種能幫助樹(shù)枝狀細(xì)胞成熟和激活的免疫信號(hào)因子,,收集經(jīng)融合蛋白孵育刺激的樹(shù)枝狀細(xì)胞等,免疫活性細(xì)胞重新注入患者體內(nèi),,,激發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)攜帶,PAP,抗原的前列腺癌細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng),,第四節(jié) 疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制,,,,,,,,,,,,,,一、原材料的質(zhì)量控制,（一）生產(chǎn)用水,,（二）器材、溶液等原材料,,（三）動(dòng)物源的原材料：,SPF,級(jí),

41、,（四）菌種和毒種,,（五）細(xì)胞,（四）菌種和毒種,,,,,二、生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制,《中國(guó)生物制品規(guī)程,》,,G,MP,,人員素質(zhì)、衛(wèi)生及無(wú)菌的要求,,,,,,,,三、疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量控制,（一）理化檢定,,檢測(cè)疫苗中的有效成分和無(wú)效有害成分,,物理性狀檢查,,蛋白質(zhì)含量測(cè)定：基因工程疫苗,,防腐劑含量測(cè)定,,純度檢查,,其他：水分、佐劑等,三、疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量控制,（二）安全性檢定,,菌、毒種和主要原材料的檢查,,半成品檢查,,成品檢查,三、疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量控制,（三）效力檢定,,免疫力試驗(yàn),,活疫苗的效力測(cè)定,,血清學(xué)試驗(yàn),,,,,,,,第五節(jié) 疫苗產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)及應(yīng)用概況,疫苗行業(yè)是生物醫(yī)藥領(lǐng)域中比較

42、高端的細(xì)分領(lǐng)域，具有較高的,技術(shù)壁壘,、,資金壁壘,和,政策壁壘,。,,,全球疫苗,85%,的疫苗市場(chǎng)被,葛蘭素史克,、,賽諾菲安萬(wàn)特,、,默克,、,惠氏,和,諾華,這五家跨國(guó)制藥企業(yè)所壟斷。,,我國(guó)疫苗市場(chǎng)規(guī)模已接近,100,億元,，全世界排名前,10,位的制藥公司已全部進(jìn)軍中國(guó)市場(chǎng)。,,一、疫苗研發(fā)生產(chǎn)特點(diǎn),需全程監(jiān)管,,研發(fā)是疫苗供應(yīng)體系的核心,,周期長(zhǎng)、投入高、風(fēng)險(xiǎn)大：,10,年以上,,一條生產(chǎn)線只生產(chǎn)一種產(chǎn)品,,對(duì)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)的需求高,,投入產(chǎn)出比高,二、我國(guó)疫苗分類及需求,政府免費(fèi)向公民提供、公民依照政府規(guī)定接種,,公民自愿接種、自費(fèi)負(fù)擔(dān),三、我國(guó)疫苗行業(yè)現(xiàn)狀,流通領(lǐng)域的開(kāi)

43、放和計(jì)劃免疫范圍的擴(kuò)大，加強(qiáng)計(jì)劃疫苗需求，激活有價(jià)疫苗市場(chǎng),,加大傳統(tǒng)疫苗的技術(shù)改良與新型疫苗品種的開(kāi)發(fā)力度,,展開(kāi)從產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)到企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)的雙重競(jìng)爭(zhēng),,四、接種疫苗的效果,1.,人用疫苗,,徹底消滅天花,,基本消滅脊髓灰質(zhì)炎,,麻疹、百日咳、白喉、流行性乙腦炎、流行性腦脊髓膜炎等發(fā)病率大幅下降,,2.,獸用疫苗,五、面臨的形勢(shì)和挑戰(zhàn),全球性需求和發(fā)展加快,,關(guān)鍵技術(shù)、裝備研發(fā)、大規(guī)模生產(chǎn)措施及人獸共患病方面較薄弱,,管理分散、整體保障水平與實(shí)際需求有差距,,供應(yīng)能力大而不強(qiáng),,TED,（,technology, entertainment, design,）,美國(guó)的一家私有非營(yíng)利機(jī)構(gòu),,以每年,

44、3,月的,TED,大會(huì)著稱，會(huì)議宗旨是“用思想的力量來(lái)改變世界”。,,在美國(guó)召集科學(xué)、設(shè)計(jì)、文學(xué)、音樂(lè)等領(lǐng)域的杰出人物，分享關(guān)於技術(shù)、社會(huì)、人的思考和探索。,,TED,演講的特點(diǎn)是毫無(wú)繁雜冗長(zhǎng)的專業(yè)講座，觀點(diǎn)響亮，開(kāi)門見(jiàn)山，種類繁多，看法新穎。,,血凝抑制實(shí)驗(yàn),一種測(cè)定抗原或抗體的技術(shù),,血凝現(xiàn)象,：有血凝素的病毒能凝集人或動(dòng)物紅細(xì)胞,,血凝抑制試驗(yàn),：血凝現(xiàn)象被相應(yīng)抗體抑制,,單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn),將一定量,抗體,混于瓊脂凝膠中制成,瓊脂板,，在適當(dāng)位置,打孔,后將,抗原,加入孔中，抗原擴(kuò)散過(guò)程中與板中抗體相遇，形成以抗原孔為中心的,沉淀環(huán),,沉淀環(huán)直徑或面積與抗原濃度呈正相關(guān),,用標(biāo)準(zhǔn)抗原或國(guó)

45、際參考蛋白制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，即,定量檢測(cè)未知標(biāo)本的抗原濃度,,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA,）,將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的反應(yīng),,用于檢測(cè),特異性抗原和抗體,,特點(diǎn)：快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等,,分類：,間接法、夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法,間接法,ELISA,檢測(cè),——,檢測(cè)抗體,,用特異性抗原包被固相載體，加入待測(cè)的抗體樣品反應(yīng)后，再加入酶標(biāo)二抗，經(jīng)底物顯色后測(cè)定。,夾心法,ELISA,檢測(cè),——,檢測(cè)大分子抗原,,用抗體包被固相載體，加入待測(cè)的抗原反應(yīng)后，再加入酶標(biāo)的第二抗原

46、或抗體，經(jīng)底物顯色后測(cè)定，即可計(jì)算出待測(cè)抗原的量。,競(jìng)爭(zhēng)法,ELISA,檢測(cè),——,檢測(cè)小分子抗原,用特異性抗體包被固相載體，同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原的混合物樣本，待測(cè)抗原將與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相上抗體結(jié)合。經(jīng)底物顯色后測(cè)定，計(jì)算兩組數(shù)值之差即可推出待測(cè)抗原的量。,,抗酸染色涂片,分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般,不易著色,，要經(jīng)過(guò)加熱和延長(zhǎng)染色時(shí)間來(lái)促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就,很難被酸性脫色劑脫色,,,在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及

47、背景中的物質(zhì)為藍(lán)色。,,免疫印跡法（,Western blotting,）,根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種,蛋白,的方法,,具有,SDS-PAGE,的高分辨力,和,固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性,，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù),,常用于,鑒定,某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行,定性,和,半定量分析,。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可以同時(shí)比較多個(gè)樣品同種蛋白的,表達(dá)量,差異。,,高效液相色譜法（,High Performance Liquid Chromatography,，,HPLC,）,以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。,,思考題,1.,簡(jiǎn)述疫苗的概念、組成及作用原理。,,2.,簡(jiǎn)述各類疫苗的主要特點(diǎn)及制備方法。,,3.,何為治療性疫苗？與預(yù)防性疫苗的區(qū)別？,,4.,設(shè)計(jì)并簡(jiǎn)述禽流感,H5N1,疫苗的主要制備流程。,