2018屆高考生物一輪復(fù)習(xí) 考點加強課6 限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定學(xué)案

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1、 考點加強課6 限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定 縱觀近年高考，選修3基因工程幾乎是必考內(nèi)容，是高頻考點，考查內(nèi)容包括基因工程的原理、基因工程的工具、基因工程的基本步驟及基因工程的應(yīng)用等，然而，相關(guān)內(nèi)容考查時常常涉及限制酶的選擇及目的基因的檢測與鑒定等，針對選擇何種限制酶的問題，應(yīng)為難點，區(qū)分度高，失分嚴重，為此，為總結(jié)規(guī)律，歸納方法，特設(shè)置本課。 【例證】 （2016·全國卷Ⅲ，40）圖（a）中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖（b）為某種表達載體的示意圖（載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的）

2、。 根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題： （1）經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被　　　　酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_______________________________________________。 （2）若某人利用圖（b）所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組DNA分子，如圖（c）所示，這三種重組DNA分子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產(chǎn)物的有　　　　，不能表達的原因是_______________________________。 圖（c） （3）DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有

3、 　　　　和　　　　，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是__________________________。 [慧眼識圖　獲取信息] （1）三種限制酶切割結(jié)果分析 （2）表達載體與重組DNA分子分析 答案?。?）Sau3AⅠ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端?。?）甲、丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄?。?）E·coliDNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶 1．限制酶的選擇原則 （1）根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類 ①應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，以便將

4、目的基因“切出”，如圖甲可選擇PstⅠ。 ②不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，以防破壞目的基因，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 ③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點），而且這種切點不致于完全破壞“標(biāo)記基因”。 （2）根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類 ①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。 ②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，應(yīng)至少含有一個完好的標(biāo)記基因，如圖乙中限制酶pst Ⅰ因其會破

5、壞標(biāo)記基因而不宜選擇。 ③所選限制酶切點不應(yīng)位于復(fù)制原點處以防破壞復(fù)制原點，如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細胞后不能自主復(fù)制。 ④所選限制酶，其切點應(yīng)位于啟動子與終止子之間，如圖乙中HindⅢ會破壞啟動子，EcoRⅠ會破壞終止子，而NdeⅠ、XbaⅠ及BamHⅠ切出的切口可讓目的基因嵌入啟動子與終止子之間。 （3）參加Ti質(zhì)粒的T－DNA片段選擇限制酶 若質(zhì)粒上標(biāo)出T－DNA片段，則所選限制酶切點應(yīng)位于T－DNA片段中，從而有利于將目的基因嵌入到T－DNA片段上——因為Ti質(zhì)粒的T－DNA片段最易轉(zhuǎn)移至受體

6、細胞并且整合到受體細胞染色體DNA上，如用兩種限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ（兩種酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，獲得含目的基因的片段。若利用該片段構(gòu)建基因表達載體，則下圖中甲、乙、丁，Ti質(zhì)粒均不宜選擇，而丙Ti質(zhì)粒宜選取。（分析如下） 2.目的基因的檢測與鑒定 （1）界定“標(biāo)記基因”與“DNA分子雜交技術(shù)”在目的基因檢測中的作用： ①載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理 載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，使受體細胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加

7、入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細胞，倘若在選擇培養(yǎng)基中不能存活，則表明無質(zhì)粒轉(zhuǎn)入，當(dāng)然不會有“目的基因”轉(zhuǎn)入，能存活時必含該載體，原理如下圖所示： ②“標(biāo)記基因”篩選后為何還需應(yīng)用“DNA分子雜交技術(shù)”確認目的基因是否轉(zhuǎn)入？ 經(jīng)上述步驟篩選得到的受體細胞，只是含特定的標(biāo)記基因的質(zhì)粒，然而，該質(zhì)粒上是否成功嵌入了目的基因，還不能確定，故仍需使用“目的基因”作探針，利用DNA分子雜交技術(shù)，檢測受體細胞的質(zhì)粒上是否含目的基因。 （2）使用“目的基因”作探針，運用“分子雜交技術(shù)”檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出特定mRNA。 （3）采用“抗原—抗體雜交技術(shù)”，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)（作抗原

8、）與相應(yīng)抗體雜交，依據(jù)是否出現(xiàn)雜交帶確認目的基因是否“指導(dǎo)”特定蛋白質(zhì)的合成。 （4）采用抗蟲、抗病毒等“接種實驗”進行目的基因成功表達的“個體生物學(xué)”水平的檢測。 1.（2017·北京卷，5）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。 下列操作與實驗?zāi)康牟环氖牵ā　。? A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰毎? C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞 D.用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上 解析　圖2中

9、質(zhì)粒中的抗性基因為潮霉素抗性基因，應(yīng)該在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞，C錯誤。 答案　C 2.（2017·廣東省惠州市模擬）長期以來香蕉生產(chǎn)遭受病害的嚴重威脅，制約了其發(fā)展。目前，隨著轉(zhuǎn)基因抗病香蕉基因工程技術(shù)的日趨成熟，為培育抗病香蕉品種開辟了新途徑。轉(zhuǎn)基因抗病香蕉的培育過程如圖所示，質(zhì)粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四種限制酶切割位點。請回答： （1）構(gòu)建含抗病基因的表達載體A時，應(yīng)選用限制酶　　　　，對　　　　進行切割。 （2）培養(yǎng)基中的卡那霉素會抑制香蕉愈傷組織細胞的生長，欲利用該培養(yǎng)基篩選已導(dǎo)入抗病基因的香蕉細胞，應(yīng)使基因表達載體A中含有　

10、　　　，作為標(biāo)記基因。 （3）能使抗病基因在香蕉細胞中特異性表達的調(diào)控序列是　　　?。ㄌ钭帜感蛱枺?。 A.啟動子 B.終止子 C.復(fù)制原點 D.標(biāo)記基因 （4）將目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ梅椒ㄓ卸喾N，圖中所示方法為　　　　。 （5）欲檢測目的基因是否表達成功，可采用的技術(shù)是　　　　。 （6）利用組織培養(yǎng)技術(shù)將導(dǎo)入抗病基因的香蕉組織細胞培育成轉(zhuǎn)基因植株，香蕉組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中除了含有一定的營養(yǎng)物質(zhì)外還必須含有　　　　等植物激素，它們會在　　　?。ㄌ顖D中標(biāo)號）階段發(fā)揮作用，同時　　　?。ㄌ顖D中標(biāo)號）階段還需要給予一定光照。 解析?。?）從圖中可看出，只有PstⅠ、EcoRⅠ

11、兩種酶能保持抗病基因結(jié)構(gòu)的完整性，所以構(gòu)建含抗病基因的表達載體A時，應(yīng)選用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ兩種酶，對含抗病基因的DNA和質(zhì)粒進行切割。（2）卡那霉素能抑制香蕉愈傷組織細胞的生長，欲利用該培養(yǎng)基篩選已導(dǎo)入抗病基因的香蕉細胞，應(yīng)使基因表達載體A中含有卡那霉素抗性基因，以此作為標(biāo)記基因。（3）啟動子和終止子能啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄與終止，是使抗病基因在香蕉細胞中特異性表達的調(diào)控序列。（4）將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ校恨r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。圖中采用的是最常用的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。（5）檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因，采用DNA分子雜交技術(shù)；檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRN

12、A，采用分子雜交技術(shù)；檢測目的基因是否表達成功產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，采用抗原－抗體雜交技術(shù)。（6）植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中需要的植物激素是：生長素和細胞分裂素，在①脫分化和②再分化中發(fā)揮重要作用，在②再分化過程中需要給予一定的光照，利于芽的分化。 答案?。?）PstⅠ、EcoRⅠ　含抗病基因的DNA和質(zhì)?！。?）卡那霉素抗性基因?。?）AB?。?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法?。?）抗原－抗體雜交?。?）生長素和 細胞分裂素?、俸廷凇、? 隨堂·真題&預(yù)測 1.（2016·全國卷Ⅰ，40）某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表

13、示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}： （1）質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有_____________________ （答出兩點即可），而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 （2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基

14、因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是________________________；并且　　　　和　　　　的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是____________________________。 在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有　　　　的固體培養(yǎng)基。 （3）基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來自于____________________________________。 解析　（1）作為運載體必須具備如下特點：①能自主復(fù)制，從而在受體細胞中穩(wěn)定保存；②含標(biāo)記基因，以供重組DNA的鑒定和篩選；③具一個至多個

15、限制酶切割位點以便外源DNA插入。（2）在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，只有具有Ampr的大腸桿菌才能夠生長。而Ampr位于質(zhì)粒上，故未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌細胞中無Ampr，不能在培養(yǎng)基中生長，而僅含有質(zhì)粒載體的和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌均具有Ampr因而能在培養(yǎng)基中生長。目的基因的插入破壞了質(zhì)粒載體的Tetr，故含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能在含有四環(huán)素的平板上生長，從而與僅含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌得以區(qū)分。（3）噬菌體是病毒，無細胞結(jié)構(gòu)，無法自主合成DNA，需借助宿主細胞完成DNA復(fù)制。 答案?。?）能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因 （2）二者均不含有氨芐青

16、霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒（或答含有重組質(zhì)粒）　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素 （3）受體細胞 2.（2019·高考預(yù)測）胰島素A、B鏈分別表達法是生產(chǎn)胰島素的方法之一。圖1是該方法所用的基因表達載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工程菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程（融合蛋白A、B分別表示β－半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白）。請回答下列問題： （1）圖1基因表達載體中沒有標(biāo)注出來的基本結(jié)構(gòu)是　　　　。 （2）圖1中啟動子是　　　　酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達；氨芐青霉素抗性基因的作用是__

17、_____________________________。 （3）構(gòu)建基因表達載體時必需的工具酶有　　　　　　　　　　。 （4）β－半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點隱藏在內(nèi)部，其意義在于　　　　　　　　　　　　。 （5）溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應(yīng)的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β－半乳糖苷酶被切成多個肽段，這是因為_________________________。 （6）根據(jù)圖2中胰島素的結(jié)構(gòu)，請推測每個胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量。你的推測結(jié)果是　　　　，理由是______________________。

18、 解析　基因表達載體包含啟動子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因等。啟動子是RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點。氨芐青霉素抗性基因可作為標(biāo)記基因。基因工程使用的工具酶包括限制酶和DNA 連接酶。胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點隱藏起來，將無法被蛋白酶所識別，防止被水解。溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，若經(jīng)溴化氰處理相應(yīng)融合蛋白能獲得完整的A鏈和B鏈，表明胰島素A鏈、B鏈上并無溴化氰作用位點，不能將其切斷；同理，β－半乳糖苷酶能被切成“多個肽段”，表明其具有多個切點（即“甲硫氨酸”）。胰島素分子含有兩條鏈，至少有2個游離氨基分別位于2條肽鏈的一端，并且R 基團中可能也含有游離的氨基。 答案　（1）終

19、止子 （2）RNA聚合　作為標(biāo)記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來 （3）限制酶和DNA連接酶 （4）防止胰島素的A、B 鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解 （5）β－半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸，而胰島素A、B 鏈中不含甲硫氨酸 （6）至少2個　兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基，氨基酸R 基團中可能還含有游離的氨基 教師獨具 1.（2017·云南名校適應(yīng)性考試，40）多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果膠使細胞壁破損，成熟的番茄果實中，PG合成顯著增加，能使果實變紅變軟，但不利于保鮮。利用基因工程減少PG基因的表達，可延長果實保質(zhì)期?？茖W(xué)家將PG基因反向接到Ti質(zhì)粒上，導(dǎo)入番茄細胞中，

20、得到轉(zhuǎn)基因番茄，具體操作流程如圖。據(jù)圖回答下列問題： （1）提取目的基因 ①若已獲取PG的mRNA，可通過　　　　獲取PG基因。 ②在該基因上游加結(jié)構(gòu)A可確?；虻姆聪蜣D(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)A上應(yīng)具有　　　　結(jié)合位點。 ③重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中的目的是____________________________。 （2）用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有　　　　的培養(yǎng)基進行篩選。培養(yǎng)24～48 h后取樣，在質(zhì)量分數(shù)為25%的蔗糖溶液中，觀察細胞 　　　　現(xiàn)象來鑒別細胞壁是否再生。 （3）由于導(dǎo)入的目的基因能轉(zhuǎn)錄出反義RNA，且能與　　　　互補結(jié)合，因此可抑制PG基因的正常表達

21、。若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄　　　　，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄培育成功。 （4）獲得的轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)生的種子不一定保留目的基因，科研人員常采用 　　　　方法使子代保持轉(zhuǎn)基因番茄的優(yōu)良性狀。 解析　（1）已獲取PG的mRNA，可通過逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）的方法獲得目的基因。因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是mRNA，在轉(zhuǎn)錄時需要RNA聚合酶。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中的目的是大量復(fù)制目的基因。（2）由圖可知，重組質(zhì)粒中含卡那霉素抗性基因而四環(huán)素抗性基因被破壞，故可用含卡那霉素的培養(yǎng)基進行篩選。植物細胞在質(zhì)量分數(shù)為25%的蔗糖溶液中會發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，所以可以用來鑒別細胞壁是否再生。（3）由以上分析可知，反義RNA與

22、天然PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補結(jié)合，從而抑制翻譯過程。若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄長，則可肯定轉(zhuǎn)基因番茄培育成功。（4）獲得的轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)生的種子不一定保留目的基因，植物組織培養(yǎng)屬于無性繁殖，能保持母本的優(yōu)良性狀，故科研人員常采用植物組織培養(yǎng)方法使子代保持轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)良性狀。 答案?。?）①反轉(zhuǎn)錄　②RNA聚合酶?、凼鼓康幕螂S質(zhì)粒的復(fù)制而復(fù)制 （2）卡那霉素　是否發(fā)生質(zhì)壁分離 （3）天然PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA　長 （4）無性繁殖（或植物組織培養(yǎng)） 2.根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題： （1）cDNA文庫屬于　　　　基因文庫，其構(gòu)建方法是：用某種生物發(fā)育的某個時期的　

23、　　　反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段，與　　　　連接后儲存在一個受體菌群中。 （2）切割DNA分子的工具是　　　　，它能使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的　　　　斷開，形成黏性末端或平末端。 （3）基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類。既可以“縫合”黏性末端，又可以“縫合”平末端的是　　　　DNA連接酶。 （4）將目的基因?qū)胫参锛毎捎米疃嗟姆椒ㄊ恰　　　?；如果受體細胞是大腸桿菌，需要用　　　　處理細胞，使之成為感受態(tài)細胞，才能吸收DNA分子。 解析?。?）基因文庫包括基因組文庫和部分基因文庫如cDNA文庫。cDNA文庫構(gòu)建的方法是：用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDN

24、A片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中。（2）切割DNA分子的工具是限制酶，它作用的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。限制酶切割DNA后形成黏性末端或平末端。 （3）基因工程中所使用的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶兩類，前者只可“縫合”黏性末端，后者既可以“縫合”黏性末端，又可以“縫合”平末端。（4）將目的基因?qū)胫参锛毎捎米疃嗟姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；如果受體細胞是大腸桿菌，需要用Ca2＋處理細胞，使之成為感受態(tài)細胞，才能吸收DNA分子。 答案　（1）部分　mRNA　載體　（2）限制性核酸內(nèi)切酶　磷酸二酯鍵　 （3）T4?。?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　Ca2＋ （時間：30分鐘

25、　滿分：100分） 1.（2018·河南省八市測評，31）科技人員通過基因工程、細胞融合等技術(shù)制作工程細胞，并利用工程細胞生產(chǎn)人們所需要的醫(yī)用蛋白，如用于治療糖尿病的胰島素。下面是利用大腸桿菌培育工程菌時用到的質(zhì)粒、胰島素基因及相關(guān)的限制酶。請回答： 表　幾種限制酶識別序列及其切割位點 （1）能識別人胰島素的mRNA并催化合成cDNA的酶是　　　??；利用PCR技術(shù)對cDNA進行擴增所需要的酶是　　　　。在基因工程中，限制酶不能識別并切割單鏈核酸，其具體功能是_________________________________。 （2）上表中可切割形成圖2胰島素基因末端的限

26、制酶為　　　??；不宜選用Sau3A Ⅰ限制酶切割質(zhì)粒的原因是_____________________________________。 酶切后的質(zhì)粒與胰島素基因通過　　　?。ㄌ蠲福┳饔煤螳@得基因表達載體。 （3）基因表達載體導(dǎo)入大腸桿菌前，常用Ca2＋處理菌體，其目的是________________________________________。 （4）從大腸桿菌細胞內(nèi)獲得了胰島素，但其沒有降血糖的功能，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是_________________________________________。 解析　（2）根據(jù)胰島素基因末端序列可知，切割胰島素基因的限制酶識別和切

27、割的序列為—GGATCC—，表中的Sau3AⅠ可識別切割。分析表格信息可知，Sau3AⅠ限制酶可識別并切割BglⅡ或BclⅠ限制酶的識別序列，導(dǎo)致質(zhì)粒中的標(biāo)記基因均被破壞。 答案?。?）逆轉(zhuǎn)錄酶　熱穩(wěn)定DNA聚合酶或Taq酶　識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列并斷裂特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵 （2）Sau3AⅠ　Sau3AⅠ限制酶能識別并切割BglⅡ和BclⅠ限制酶的識別序列，導(dǎo)致質(zhì)粒中的標(biāo)記基因均被破壞（其他合理答案也可）　DNA連接酶 （3）提高受體細胞的轉(zhuǎn)化率（其他合理答案也可） （4）大腸桿菌為原核生物，細胞中只有核糖體，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，不能對肽鏈進行加工，形成

28、有活性的胰島素 2.（2018·中原名校第一次質(zhì)量考評，30）下面是通過基因工程獲得內(nèi)皮素的主要受體ETA的過程，圖中SNAP基因是一種熒光蛋白基因，限制酶APaⅠ的識別序列為CCC↓GGG，限制酶XhoⅠ的識別序列為C↓TCGAG。請分析回答下列問題： （1）圖中cDNA文庫　　　?。ㄌ睢按笥凇薄暗扔凇被颉靶∮凇保┗蚪M文庫，若要在短時間內(nèi)獲得大量的目的基因片段，可采用PCR技術(shù)進行擴增。利用PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是__________________________________。 （2）過程③中，限制酶XhoⅠ切割DNA，形成的目的基因的黏性末端是　　　　。用兩種限制酶

29、切割，獲得不同的黏性末端，其主要目的是_________________________。 （3）過程④中需要用　　　　酶，過程⑥中，要用　　　　預(yù)先處理大腸桿菌，使其處于容易吸收外界DNA的感受態(tài)。利用SNAP基因與ETA基因結(jié)合構(gòu)成融合基因，目的是______________________________________________。 解析?。?）基因組文庫包括了該種生物所有的基因，而部分基因文庫只包含一種生物的部分基因，因此cDNA文庫小于基因組文庫。若要在短時間內(nèi)獲得大量的目的基因片段，可采用PCR技術(shù)進行擴增。利用PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序

30、列。以便根據(jù)這一序列合成引物。 （2）過程③中利用限制酶XhoⅠ切割DNA獲得目的基因的過程，限制酶使得DNA的磷酸二酯鍵斷開，形成的黏性末端是。用兩種限制酶切割，獲得不同的黏性末端，其主要目的是使目的基因定向連接到載體上（或防止自身環(huán)化）。（3）過程④中需要用DNA連接酶將目的基因與載體組合到一起；過程⑥中，要用Ca2＋預(yù)先處理大腸桿菌，使其處于容易吸收外界DNA的感受態(tài)。利用SNAP基因與ETA基因結(jié)合構(gòu)成融合基因，目的是有利于檢測內(nèi)皮素受體ETA基因能否表達及表達量。 答案　（1）小于　要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物 （2）—AGCT（或）　使目的基因定

31、向連接到載體上（或防止自身環(huán)化） （3）DNA連接　Ca2＋（或氯化鈣溶液）　有利于檢測內(nèi)皮素受體ETA基因能否表達及表達量 3.（2017·鄭州二測，38）Bt基因即是蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）基因，因其表達產(chǎn)物Bt毒蛋白殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點而成為應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)殺蟲基因。下圖為培育轉(zhuǎn)Bt基因苗的基本操作過程。 （1）Bt基因可從構(gòu)建的Bt基因組文庫中獲取，也可以從其cDNA文庫中獲取，從前者獲取的基因　　　?。ㄌ睢昂小被颉安缓小保﹩幼?。若利用PCR技術(shù)從cDNA文庫中獲取Bt基因（基因序列未知），需根據(jù)Bt蛋白氨基酸序列

32、設(shè)計引物，引物的序列可以有多種，原因是_____________________________。 在PCR體系中需加入其中的　　　　（填“全部”或“任意1種”或“其中2種”）引物。若Bt基因序列已知，則引物的序列通常為　　　　種。 （2）在構(gòu)建基因表達載體的過程中，為了方便篩選含有目的基因的細胞，作為運載體的Ti質(zhì)粒應(yīng)含有　　　　基因，其中　　　　是驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的酶識別和結(jié)合的位點，而能幫助目的基因整合到宿主細胞染色體上的序列稱為　　　　。圖示將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法是_______________________________________　　　　。 （3）步驟Ⅳ中產(chǎn)生的

33、細胞團稱為　　　　，步驟Ⅳ和V過程要注意控制培養(yǎng)基中　　　　的濃度比例，以便獲得幼苗。 答案　（1）含有　一種氨基酸可能有多種密碼子，對應(yīng)引物DNA堿基序列就會有多種　全部 　2?。?）標(biāo)記（抗性）　啟動子　T－DNA（可轉(zhuǎn)移DNA）　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 （3）愈傷組織　生長素與細胞分裂素 4.（2018·河南名校一聯(lián)，38）胰島素是治療糖尿病的重要藥物?，F(xiàn)利用基因工程技術(shù)讓大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，下圖為大腸桿菌質(zhì)粒，請據(jù)圖作答。 補充說明：HindⅢ、BamHⅠ、EcoR Ⅰ是限制酶切位點　tetR、ampR是抗生素抗性基因 （1）獲取目的基因時，應(yīng)從人的　　　　　　　　　　文庫（基因組/cDNA）中獲取，這樣做的原因為　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。獲取后不能直接對目的基因酶切，因為　　　　　　　　 ，因此需要在目的基因兩端添加　　　　　　　　　　。 （2）天然人胰島素不耐儲存，可使用蛋白質(zhì)工程對蛋白質(zhì)進行改造。蛋白質(zhì)工程的基本途徑為　　　　　　　　→設(shè)計預(yù)期蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→　　　　　　→找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列。 答案?。?）cDNA　cDNA中無內(nèi)含子序列，能夠在大腸桿菌中表達正確蛋白質(zhì)　cDNA中只有編碼氨基酸的序列，直接酶切會導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)改變　BamH Ⅰ和EcoR I的識別位點 （2）預(yù)期蛋白質(zhì)功能　推測應(yīng)有的氨基酸序列 14