《高效液相色譜法》PPT課件.ppt
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1、高效液相色譜法,High Performance Liquid Chromatography (HPLC),前言:,HPLC是70年代以后發(fā)展最快的一個分析化學(xué)分支,現(xiàn)已成為生化、醫(yī)學(xué)、藥物、化學(xué)化工、食品衛(wèi)生、環(huán)保檢測等領(lǐng)域最常用的分離分析手段。,我國:,開始僅為少數(shù)研究實驗室擁有, 現(xiàn)很多的生產(chǎn)、研究、質(zhì)檢部門。 廣泛應(yīng)用于質(zhì)量控制、分析化驗、制備分離。例: 講課目的:入門 教材問題: 學(xué)習(xí)要求:,課時安排: 第一章:高效液相色譜的基本原理 6學(xué)時 第二章:高效液相色譜的儀器裝置 2學(xué)時 第三章:液固、液液、鍵合相色譜 4學(xué)時 第四章:離子交換色譜和離子對色譜 3學(xué)時 第
2、五章:凝膠滲透色譜 1學(xué)時 第六章:實驗技術(shù)和輔助實驗技術(shù) 2學(xué)時 機動 2學(xué)時 第3、5、7周實驗,參考書籍:,1.色譜理論基礎(chǔ)(盧佩章、戴朝政編) 2.高效液相色譜法(鄒漢法、張玉奎、盧佩章編著) 3.高效液相色譜方法及應(yīng)用 (色譜技術(shù)叢書、化學(xué)工業(yè)出版社、 于世林編著),本課程基本要求:,1. 掌握色譜法的分類及有關(guān)術(shù)語; 2. 了解柱效的影響因素; 3. 掌握分離度的影響因素; 4. 了解定性、定量分析方法; 5. 掌握液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及功能; 6. 掌握常用的液相色譜法基本概念及分離 對象 7. 掌握液相色譜的基本操作技能;,第一章 高
3、效液相色譜法基本原理,1-1 概述 一.發(fā)展歷史: 100多年前俄國植物學(xué)家Tswett分離 植物色素時采用的實驗方法: Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜) 描述他的實驗方法 即:Chromatography(色譜法),色譜法的發(fā)展,1906年正式命名 20世紀30年代開始廣泛研究和應(yīng)用 (柱色譜,薄層色譜氣相色譜) 高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于20世紀70年代,,現(xiàn)代液相色譜分析方法。 經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ), 引入氣相色譜法的理論和實驗技術(shù), 高壓輸送流動相, 高效固定相及高靈敏度檢測器.,二、色譜法概述,混合物最有效的分離、分析方法。 色譜法是一種分離
4、技術(shù)。 混合物分離過程:試樣中各組分在 色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的 分配。 一相固定不動,稱為固定相。 另一相是攜帶試樣混合物流過固定 相的液體,稱為流動相。,高效液相色譜法的特性:,高壓、高效、高速、高靈敏。 適用:高沸點、熱不穩(wěn)定樣品,液相色譜儀,,,高效液相色譜儀流程圖,三、色譜法原理,,混合物中各組份在不同的兩相中溶解,吸附等化學(xué)作用性能的差異,當兩相相對運動時,使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達到相互分離 兩相中一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase), 一相是流動的,稱為流動相(Mobile Phase), (洗脫劑,溶劑
5、),分離原理:,分離是一個 物理過程。,,固定相(Stationary Phase) 流動相(Mobile Phase) 進樣 (Injection) 洗脫 (Elution) 相互作用(Interaction),當混合物進入色譜柱后,就在固定相、流動相之間不斷地進行分配平衡。不同的化合物,分子結(jié)構(gòu)不同,理化性質(zhì)不同,所以在兩相中存在的濃度也各不相同。固定相中存在量多的化合物,沖洗出柱子的時間就長,反之則短。這與分配系數(shù)K有關(guān): K值小,先流出柱子,K值大的,保留作用強,后流出柱子。,四、高效液相色譜法的特點,高壓 以液體作為流動相,液體流經(jīng)色譜柱時,受到阻力較大 必須對流動相施加高壓。
6、 一般可達到150300kgcm2, 甚至可達700kgcm2以上。,高速 所需的分析時間較經(jīng)典液體色譜少得多(交換速度快),流量可達l10mLmin,高效 氣相色譜的分離效能很高,高效液相色譜的柱效則更高(化學(xué)鍵合相),一般約可達 6000理論塔板米,高靈敏度 紫外檢測器的最小檢測量可達(10-9 g); 熒光檢測器的靈敏度可達10-11g。 所需試樣很少;微升數(shù)量級 高選擇性 可分離不同類型化合物和異構(gòu)體,也可分析在性質(zhì)上極為相似的化合物 (同位素、同分異構(gòu)體、空間異構(gòu)體、手性化合物),,五、HPLC與GC區(qū)別,1分析對象的區(qū)別 GC:適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點低的樣
7、 品, 占有機物的20% HPLC:適于溶解后能制成溶液的樣品. 對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差 樣品均可檢測 。 占有機物的80%,2流動相的區(qū)別 GC:流動相為惰性,組分與流動相無親合作用 力,只與固定相有相互作用。 HPLC:流動相為液體,流動相與組分間有親合作用 力,能提高柱的選擇性、改善分離度. 對分離起主要作用。 3操作條件差別 4.分析樣品區(qū)別 GC:加溫操作 GC:破壞樣品,不能回收 HPLC:室溫;高壓 HPLC:不破壞樣品,能回收 說明:氣相、液相地位同樣重要 兩種互補不足的色譜方法 靈敏度:氣相液相 應(yīng)用范圍:液相氣相,六、色譜法的分類,
8、吸附色譜(Absorption Chromatography) 組分對固定相表面吸附力的不同而分離 分配色譜(Partition Chromatography) 組分在固定相和流動相中的溶解度不同而分離 離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography) 組份離子交換親和力的差異而分離 體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography) 組分分子量大小不同,對固定相的滲透力不同而分離,基本概念 一、色譜圖(chromatogram),檢測器將流動相中各組分濃度變化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號。 記錄儀所記錄下的濃度對分離時間的函數(shù),稱為色譜圖。,色譜過程特點
9、:,濃度對分離時間呈高斯曲線型 色譜條件一定時,各組分都有一特定時間在圖譜中出現(xiàn),稱為組分的保留時間。 柱效一定時,組分保留值越小,峰越 窄;保留值越大,峰越寬。 相鄰峰的保留時間相差越大,越易分離。,常用術(shù)語: 1. 基線 : 僅有純流動相進入檢測器時的流 出曲 線。 2.色譜峰: 響應(yīng)信號大小隨時間變化所形成的峰 形曲線。(正態(tài)分布),3.峰高與峰面積: 峰高:色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離 用h表示。,峰面積: 峰與峰底之間的面積 ,用A表示。 二、色譜保留,,1. 保留時間(tR) 從進樣開始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時間,用tR表示。,2.分配系數(shù)
10、K,組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附,或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下,組分在兩相間分配達到平衡時的濃度比(單位:g/mL),稱為分配系數(shù),用K 表示:,分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。,分配系數(shù)K 的討論,一定溫度下,組分分配系數(shù)K越大,出峰越慢; 每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同; 選擇適宜的固定相可改善分離效果; 各組分有不同K 值是分離的基礎(chǔ)(差移速度) 某組分的K = 0時,即不被固定相保留,最先流 出。,3.容量因子k (capacity factor),一定溫度下,組分在兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量比。,1.與k都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān) 的常數(shù), 隨分
11、離柱溫度、柱壓的改變而變化 2.與k都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù) ,數(shù)值越大,該組分的保留時間越長。 3. 容量因子可以由實驗測得。,4. 容量因子與保留時間的關(guān)系,推導(dǎo): ux:組分在分離柱內(nèi)的遷移速度; u:流動相在分離柱內(nèi)的遷移速度;,,組分和流動相通過長度L的分離柱,需要時間分別為tR和t0,則 tR = to(1+k),k太小---沒有充分利用填料的分離能力 k太大---分析時間太長 k范圍: k 1/0(0溶劑強度---使組分遷移快慢的能力) P310 表3-10,作業(yè):,思考題: 1、2、3、4、5、6、8、9,5. 選擇性系數(shù),可用來衡量兩物質(zhì)的分離程度,
12、用表示。,色譜理論需要解決的問題?,色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。,組分保留時間為何不同?色譜峰為何變寬? 組分保留時間:色譜過程的熱力學(xué)因素控制; (組分和固定相的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)) 色譜峰變寬:色譜過程的動力學(xué)因素控制; (兩相中的運動阻力,擴散) 兩種色譜理論:塔板理論和速率理論。,1-3 色譜柱的分離效率,一、塔板理論,塔板理論認為: 一根柱子可以分為n段,每段內(nèi)組分在兩相間迅速達到平衡,把每一段稱為一塊理論塔板。 設(shè)柱長為L,理論塔板高度為H,則 H=L/ 為理論塔板數(shù)。,,,理論塔板數(shù)一N 色譜峰對稱 : 說明: a. 在給定的操作條件下,N幾乎相同 b. N為常
13、量時,tw 隨 tR 成正比例變化 c. 與柱長有關(guān): 比較不同長度色譜柱的柱效時, 應(yīng)當比較它們在相同柱長下的N值。例 d. 是一種理想狀態(tài),,, 有拖尾峰時: 可用半峰寬來表示N: N554 ( tR / W1/2 ) 2 W1/2 -----半峰寬,例:測得tR=105mm、 W1/2 =4mm,求得N=3789,若此柱長為250mm,折成每米的理論塔板數(shù)約為15200.,,理論塔板高度H,物理意義:組分在兩相間達到一次平衡對應(yīng) 的柱長 H愈小組分在兩相間平衡分配次數(shù)越多 柱效(不能說明分離一定實現(xiàn)),說明:,大,固定相分離潛能大。 (分離與否,還取決于其
14、他色譜條件) 一定色譜條件下,對k有差異的組分,則柱效愈高,分離效果愈好。,塔板理論的特點和不足:,(1)當L一定時,N 越大(H 越小),被測組 分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多,柱效越 高,所得色譜峰越窄。 (2)柱效不能表示被分離組分的實際分離 效果:如兩組分的分配系數(shù)K 相同, 無論該色譜柱的柱效多大,都無法 分離。,(3)塔板理論無法解釋同一色譜柱在 不同的流動相流速下柱效不同的 實驗結(jié)果,也無法指出影響柱效 的因素及提高柱效的途徑。,二.峰擴展和速率方程式,1.峰擴展--由于柱內(nèi)柱外各種因素引起的色譜峰變寬或變形,從而造成色譜柱效的降低 峰擴展程度:取決于組分在柱內(nèi)平衡分 配次
15、數(shù) 例: 引起峰擴展因素:柱內(nèi)、柱外,柱外因素,檢測器流動池體積(盡量小) 柱出口到檢測器的連接管(盡量短) 進樣器死體積,2. 速率方程式(范弟姆特方程式),H = A + B/u + Cu H:理論塔板高度, u:流動相流速(cm/s)。 減小A、B、C 三項可提高柱效。 A,B,C 三項各與哪些因素有關(guān)?,A 渦流擴散項,A = 2dp dp:固定相的平均顆粒直徑 :固定相的填充不均勻因子,固定相顆粒越小dp,填充得越均勻,A,H,柱效。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕,色譜峰較窄。,B/u 分子擴散項,B = 2 D D:試樣組分分子的擴散系數(shù)(cm2
16、s-1) (1) 存在著濃度差,產(chǎn)生縱向擴散; (2) 擴散導(dǎo)致色譜峰變寬,H(),分離變差; (3) B/u與流速有關(guān):流速 滯留時間 擴散 (0.5ml/min) (4) 擴散系數(shù)D,B 值。 液相中,分子擴散可忽略,C u 傳質(zhì)項,傳質(zhì)溶質(zhì)分子在兩相間濃度不同,由濃度高的相不斷遷 移至濃度低的相,直到濃度達到平衡。 根據(jù)傳質(zhì)形式分:固定相傳質(zhì)和移動相傳質(zhì) C =(Cs + Cm) 固定相傳質(zhì)原因:進出固定相速度不同(固相,液相) 減小措施:使用薄的固定相層,小顆粒填料 移動相傳質(zhì):遷移滯留 減小措施 填裝均勻緊密 使用小顆粒填料和表面多孔性填料,3. 速率理論的要點
17、:,(1)柱內(nèi)的峰擴展與渦流擴散、分子擴散、傳質(zhì)阻力有關(guān)。固液兩相間的分配平衡不能瞬間達到是造成色譜峰擴展、柱效下降的主要原因。,(2) 通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔6?、液膜厚度及流動相流速可提高柱效?(3) 為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和填料對柱效及分離的影響。 (4) 各種因素相互制約:流速增大,分子擴散項的影響減小,使柱效提高,但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大,又使柱效下降; 選擇最佳條件,才能使柱效達到最高。,4.獲得高柱效的幾種方法:,選用細的顆粒填料 流動相流速低 流動相粘度小 升高溫度 溶質(zhì)擴散系數(shù)與其結(jié)構(gòu)有關(guān) 大分子,擴散系數(shù)小 小分子,擴散系數(shù)大,5. 影響分離的
18、因素與提高柱效的途徑 液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一,在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴散項B/u較小,可忽略不計,即 H = A + C u,降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 氣相和液相區(qū)別,分離度,色譜分離目的:合理的時間內(nèi)將樣品中組分成功 分離 分離度:表示分離狀況的一種度量 分離度影響因素: 保留值之差色譜過程的熱力學(xué)因素; 峰的寬度色譜過程的動力學(xué)因素。,討論:,色譜分離中的四種情況:, 柱效較高,K(分配系數(shù))較大,完全分離。 K 不是很大,柱效較高,峰較窄,基本分離。 柱效較低,K 較大,但分離的不好。 K 小,柱效低,分離效果更差。,,一分離度的表達式:,R
19、=0.8:兩峰的分離程度可達89%; R=1:分離程度98%(達到定性定量分析的最低要求) R=1.5:達99.7%(相鄰兩峰達到基線分離)。,對濃度不同組分而言:,兩個組分的分離度會隨濃度比的增大而 減小 例: 對多組分而言: 整個色譜分離的分離度取決于Rs最小值的兩個峰。,二分離度影響因素 峰的寬度(峰寬越小, Rs越大) 峰的寬窄主要反映了色譜分離的動力學(xué)特性 兩峰的保留時間之差(tR越大, Rs越大) 反映了色譜分離的熱力學(xué)特性 分離度基本 關(guān)系式:,四控制分離度方法,改變k 調(diào)節(jié)溶劑強度可以改變k 增大---使用較弱溶劑 降低---使用較強溶劑 正相色譜---固定相極性大于移動相
20、 (溶劑極性大溶劑強度大洗脫能力強?。?反相色譜---固定相極性小于移動相 (溶劑極性大溶劑強度小洗脫能力弱大) 例: P307311,更換色譜柱(改變N),措施: a.選擇長柱子(N=L/H) b.填料顆粒盡量小 c.低流速(溶質(zhì)傳質(zhì)阻力小,峰擴展小) d.低的溶劑粘度(提高柱效) e.提高柱溫,改變選擇性系數(shù),,( =1, 不能實現(xiàn)分離),下列途徑改善: a.流動相(梯度洗脫) P279 (適用于極性范圍寬的樣品) b.固定相(換柱,改變填料) c.溫度(改變熱力學(xué)參數(shù)),五. 分離度控制的一般原則:,開始k值很小,若要增大Rs,則首先應(yīng)將k調(diào)整至1 k 10范圍,這樣
21、,不用改變其他條件,就可使Rs增大。 開始k已在1 k 10范圍,但Rs不大,則必須增大N來改善Rs。 k,N的改變都不能增大Rs時,再設(shè)法改變,作業(yè):,思考題: 7,1017,第二章 儀器裝置 四大部件: 高壓輸液泵 進樣器 高效分離柱 檢測器,21 高壓輸液泵 作用:向色譜柱輸送一個連續(xù)、恒定的移動相。 一、對泵系統(tǒng)的要求 1.使用方便(易調(diào)節(jié)流量、過壓保護等) 2.更換洗脫液容易、死體積小 3.有最大工作壓力(20MPa,130MPa) 4.一定流量范圍(直徑小,流量?。凰俣瓤?,流量大。)(0.110ml/min) 5.流量穩(wěn)定性好(流量噪聲、流量波動、流量漂 移) 6.流量
22、精度高,機械往復(fù)式柱塞泵的工作原理:,特點:,能連續(xù)供給恒定體積的移動相,不受整個色譜系統(tǒng)中其余部分稍有變化的影響。 死體積較小,約0.1ml,更換溶劑方便,適用于梯度洗脫。 缺點: 輸出有脈沖波動 二個因素:脫氣不完全 泵的周期性吸液 影響檢測靈敏度。(對紫外檢測器影響不大),梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵,將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室,混合后進入色譜柱。,內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢,高效:填料顆粒分離效率 柱壓降泵的工作壓力 分析時間短:更快流速柱壓降 (超快
23、速分析) 減少洗脫液用量(4.6mm1mm) 液相色譜的多元洗脫系統(tǒng) P277280,22 色譜柱,組成:精密管徑的不銹鋼管、填料、柱接頭 要求:柱管內(nèi)壁非常光滑 柱接頭設(shè)計要保證系統(tǒng)中引入最小 死體積(柱前、柱后) 能密封高壓液體 兩端加過濾片,柱體為直形不銹鋼管,內(nèi)徑16 mm,柱長540 cm。減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,柱效的影響因素,填料的顆粒度及其均勻性 柱長、填裝的方法與技巧 常用:內(nèi)徑25mm(4.6mm) 柱效一定時,柱長與顆粒度成正比 例如:顆粒度510um、柱長1530cm 顆粒度35um、 柱長7.515cm P282283,23 進樣裝置,六
24、通進樣閥 P280281 結(jié)構(gòu)如圖:,2-4 檢測系統(tǒng) 功能:連續(xù)地將色譜柱中流出的組分隨時間 變化的情況,轉(zhuǎn)變成大小不同的電信 號輸入到記錄儀中,得到色譜圖。 按檢測方式不同,分為: 總體性質(zhì)檢測器(通用型) 示差折射檢測器 溶質(zhì)性質(zhì)檢測器(選擇型) 紫外檢測器、熒光檢測器、電導(dǎo)檢測器,檢測器的性能指標 一個理想檢測器,必須具備下列條件: 靈敏度高 不受溫度及流動相流速變化的影響 響應(yīng)隨組分量的變化而線性地變化 穩(wěn)定性好,操作方便,衡量指標: 靈敏度 S=R/Q 噪音在沒有樣品情況下,檢測器輸出的最大 振幅(溫度、流量、泵) 漂移檢測器在一段時間內(nèi),基線隨時間的增
25、 加而產(chǎn)生的偏離(電壓、流動相) 最小檢測限樣品產(chǎn)生兩倍于噪音信號時的濃度 (檢測下限) 線性范圍檢測信號呈線性變化時,最大和最 小進樣量之比,檢測器,紫外檢測器 (光電二極管陣列檢測器) 示差折光檢測器 熒光檢測器 電導(dǎo)檢測器,a. 紫外檢測器 應(yīng)用最廣,對大部分有機化合物有響應(yīng)。 特點:,靈敏度高; 線性范圍寬; 流通池可做得很小(1mm 10mm ,容積 8L); 對流動相的流速和溫度變化不敏感; 波長可選,易于操作 (波長范圍,常用波長) 200400nm 254nm、280nm 可用于梯度洗脫。,b. 光電二極管陣列檢測器,紫外檢測器的重要進展;
26、 光電二極管陣列檢測器:1024個二極管陣列,各檢測特定波長,計算機快速處理,三維立體譜圖。,光電二極管陣列檢測器,三維:光譜-色譜圖,,檢測原理 比爾定律: A=c L 紫外檢測器優(yōu)點: 靈敏度高(1010g/ml) 對梯度洗脫是一種理想檢測器 局限性: 不能檢測對紫外光沒有吸收的樣品 不能使用對紫外光有吸收的溶劑 P289293,第三章 液固色譜和鍵合相色譜,31 液固吸附色譜 一、原理: 固定相是極性吸附劑,不同組份官能團具有不同極性,因而對固定相的吸附能力不同。 極性越大,吸附能力越強;極性越低,吸附能力越弱而導(dǎo)致分離。,存在競爭吸附:吸附解吸平衡 溶質(zhì)、流動相分子之間 溶質(zhì)中
27、不同官能團之間 競爭的結(jié)果,導(dǎo)致了分離。 溶質(zhì)在柱內(nèi)受到兩種力作用: 固定相的吸附力 流動相的溶解力 當吸附力溶解力 k大 吸附力溶解力 k小,二分離對象:,官能團有差別的不同類型化合物 (烷基類吸附弱,不能分離) 幾何異構(gòu)體 (固定相表面是剛性結(jié)構(gòu) 溶質(zhì)分子官能團與吸附中心的相互作用隨分子的幾何形狀而改變),三填料的類型及其選擇,按形狀分: a. 球形 b. 無定形 按多孔程度分: a. 多孔型 b. 薄殼型 按極性分: a. 極性(硅膠、Al2O3 、MgO、分子篩) b.非極性(活性碳),四、硅膠的活性控制及標準化,硅膠的特點: 活性控制意義: 標準化方法: 市售未處理硅膠加
28、熱46小時,活化去水,再加進定量水分,使吸附劑含水量保持恒定。 (100m2表面積含水0.020.03g為佳),吸附強度分類,根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)類型,可將它們 在硅膠上 的吸附強度排序:P315 歸納: 官能團不同極性不同吸附強度不同 幾何異構(gòu)體空間位置不同吸附強度不同 P314-316 P331-333,分子空間效應(yīng)。 與官能團相鄰的大烷基可能降低保留能力;(位阻效應(yīng)) 順式化合物的保留能力可能比反式化合物強; 對位化合物的保留能力可能比鄰位化合物強。,五樣品分子結(jié)構(gòu)對保留的影響,對吸附色譜來說, 主要取決于樣品分子所含的官能團的類型及其數(shù)目。 常見官能團的吸附強度: 不吸附:烷烴 弱吸附:烯烴
29、、硫醇、硫醚、單環(huán)或雙環(huán)芳 烴、鹵代芳烴 中等吸附:多環(huán)芳烴、醚、腈、硝基物、大多 數(shù)羰基化合物 強吸附:醇、酚、胺、酰胺、亞楓、酸和多 官能團化合物,六、 液相色譜的流動相,1. 流動相實用要求 (1)溶劑的純度和化學(xué)特性必須滿足 色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求。,(2)避免使用與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)溶劑。 (使用AI2O3-避免酸、使用硅膠避免堿),(3)溶劑應(yīng)不干擾使用檢測器的正常工作,與檢測器相匹 配。 使用的溶劑應(yīng)當易于除去,不干擾對分離組分的回收。,2. 流動相分類,按流動相組成分:單組分和多組分; 按極性分:極性、弱極性、非極性; 按使用方式分:一般淋洗和梯度
30、淋洗。 常用溶劑: 正相:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、 正戊烷 正庚烷 反相: 甲醇、乙腈、水溶液。,LSC 流動相的選擇,在吸附色譜中, 對溶質(zhì)保留值和分離選擇性起主導(dǎo)作用的是溶質(zhì)與固定相的作用, 流動相主要是調(diào)節(jié)溶質(zhì)的保留值在適當范圍內(nèi)。 溶劑強度洗脫能力 k 液固吸附色譜的流動相值要適當, 常用正己烷、正庚烷, 添加少量CH2Cl2、CHCl3、CH3CN和CH3OH。 (混合后的溶劑強度在兩種純?nèi)軇┲g),液固色譜的應(yīng)用特點: 對具有不同極性取代基的化合物表現(xiàn)出較高的選 擇性,但對同系物的分離能力較差 對強極性或離子型樣品,因有時會發(fā)生不可逆 吸附,液固色譜常不能獲得滿意的分離結(jié)果
31、。 吸附劑的含水量對吸附劑活性、樣品容量和保 留值有較大影響 液固吸附色譜主要應(yīng)用于: 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體的分離。,,思考:在液固色譜中,以硅膠為固定相,對以下四 組分進行分離,流出色譜柱的順序可能是: a.鄰苯二胺 b對苯二胺 c間苯二胺 a. 苯酚 b. 對羥基苯胺 c. 苯胺 d. 苯,1 2,作業(yè),思考題: 19、20、2225、2729、3144,3-2 反相鍵合相色譜,,鍵合相色譜是目前HPLC中最常見的分離模式, 約80%的HPLC是采用反相鍵合相色譜。 烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析,反相鍵合相色譜 定義固定相通過某種化學(xué)反應(yīng)將有機分 子以共價鍵結(jié)合在色
32、譜擔體的表面, 這種色譜類型稱之。 制備硅膠基質(zhì)化學(xué)鍵合固定相注意點: 鍵合反應(yīng)前,將硅膠表面硅氧烷全部水 解為硅烷醇。 除去硅膠表面吸附水,使表面完全呈自 由硅醇基。,形成化學(xué)鍵合固定相 具備條件: 所用基質(zhì)材料 應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性 有能與基質(zhì)表面發(fā)生 化學(xué)反應(yīng)的官能團,化學(xué)鍵合固定相 (P303),a. 硅氧碳鍵型: SiOC b. 硅氧硅碳鍵型:SiOSi C 穩(wěn)定,耐水,耐光,耐有機溶劑,應(yīng)用最廣 c. 硅碳鍵型: SiC d. 硅氮鍵型: SiN,化學(xué)鍵合固定相的特點:,(1)傳質(zhì)快: 表面無深凹陷。 (2)壽命長: 化學(xué)鍵合,耐流動相沖擊; 穩(wěn)定。
33、(3)選擇性好: 可鍵合不同官能團,提高選 擇性 (4)有利于梯度洗脫。 由于產(chǎn)生弱極性固定相,因而擴展了反相色譜分離技術(shù)的應(yīng)用。反相色譜正相色譜,存在著雙重分離機制:,由鍵合基團的覆蓋率決定 高覆蓋率:分配為主; 低覆蓋率:吸附為主。 常用反相鍵合固定相: C18、C8 P300P302,反相色譜保留機理,兩種觀點: 疏溶劑理論 (溶質(zhì)與極性溶劑疏遠) 雙保留機理 (殘留羥基),影響溶質(zhì)保留的因素 流動相 組分的保留隨流動相極性的減少而減少, ln k H2O % , 有機溶劑% 增大, 極性下降, k值隨之下降。,思考:在ODS柱上,用70%甲醇/水或60%甲醇/水洗脫苯系物,
34、哪一種流動相使苯系物的保留值大,為什么?, 鍵合固定相: a.烷基覆蓋量增加,k值隨之增大。 b.烷基鏈長增加, k值隨之增大。 思考: 同樣是70%甲醇流動相,苯在C18比C8柱上的保留值大,為什么?, 溶質(zhì) 非離子化合物:極性大, k值小 非極性化合物:分子表面積大, k值大 同系物:鏈長增大, k值增大 苯系物:環(huán)數(shù)增大, k值增大; 若化合物的非極性部分相同, 極性官能團增 加, 則k值下降 幾何異構(gòu)體:能形成內(nèi)氫鍵的異構(gòu)體的化合 物 k值大。,,反相色譜中流動相選擇,水有機改善劑 常用:甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán) 極性:有機改善劑水 洗脫能力:有機改善劑水 極性順序:甲
35、醇乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃 洗脫能力:水甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫 呋喃,反相鍵合相色譜的優(yōu)點:,流動相可選用水溶性 樣品的溶解度范圍提高 流動相可變性大 柱重現(xiàn)性好 固定相表面化學(xué)能低 平衡容易 梯度洗脫 固定相選擇多 固定相耐溶劑沖洗 熱穩(wěn)定性好,缺點:,流動相PH范圍要控制(PH28) pH太低:Si-C鍵易斷裂 pH太高:硅膠基質(zhì)易溶解 游離的硅羥殘基影響分離(封尾) P328-331,思考 烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析,出峰順序? 如何選擇色譜條件? 如何優(yōu)化分離?,第四章、離子交換色譜,離子對色譜,離子交換色譜: 適用于離子型物質(zhì)的分離和分析,,,4-1 離子交換色譜
36、 一.原理:用離子交換劑作固定相,以具有一定pH值的緩沖溶液作流動相,樣品中各離子依據(jù)它們與離子交換劑的交換能力大小來進行分離的色譜方法。,原理:流動相(溶質(zhì)離子)+離子交換劑(反離子), 平衡時,平衡常數(shù)為,控制k可以改變流動相的離子強度注:只有當溶質(zhì)呈離子狀態(tài)時,才能在離子 交換柱上有保留(流動相p和溶質(zhì)都是很重要的參數(shù)),二、離子交換劑 陽離子交換劑帶負電荷官能團 -SO3-(磺酸型)、 -COO-(羧酸型) 陰離子交換劑帶正電荷官能團 NH3(氨基型)、NR3(季胺型),常見:硅膠為基體的鍵合相離子交換劑 例,pH對交換容量的影響:,強酸、強堿性離子交換劑,交換性能不受
37、pH影響,交換容量恒定。 弱酸性陽離子交換劑,在較高pH條件下 弱堿性陰離子交換劑,在較低pH條件下 發(fā)生離子交換 pH與交換容量關(guān)系圖,三、離子交換色譜的影響因素,流動相PH的影響 例:弱酸 :HAH++A- PHA- 交換能力tR PHA- 交換能力tR 弱堿:-NH2+H+-NH3+ PHNH3+ 交換能力tR PHNH3+ 交換能力tR 對分離不同PKa的酸堿是個有利因素 例,流動相中反離子的 形式和濃度 交換平衡常數(shù)KB/A: 反映了溶質(zhì)和交換劑的親和力大小 親合力影響因素: a.電荷數(shù)親合力 b.離子的水合體積親合力 c. 離子極化率親合力,對磺酸型陽離子交換樹脂,
38、一價陽離子的洗脫強度順序: Cs+Rb+ K+NH4+ Na+H+ Li+ 二價陽離子的洗脫強度順序: Ba2+Pb2+ Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+ 對季胺型陰離子交換樹脂,陰離子的洗脫強度順序: ClO4- I- HSO4- SCN- NO3- Br- NO2- CN- Cl- BrO3- OH- HCO3- H2PO4- IO3- CH3COO- F- 注:調(diào)節(jié)離子強度常用Na2SO4、NaNO3, 不采用NaCI 增加離子強度類似于增加洗脫強度,三者相互作用力關(guān)系: .溶質(zhì)對R+的親合力交換能力 tR .流動相離子對R+親合力 洗脫能力 tR 有機溶劑影響 有機溶劑溶劑
39、強度 洗脫能力 k P335337,作業(yè):,思考題: 21、4651、59、60,四.離子抑制法,定義在反相色譜中,通過調(diào)節(jié)流動相pH 值,抑制組分解離,增加其在固定相上 的保留,以達到分離的目的。,分離對象:弱酸、弱堿性物質(zhì) k影響因素:與流動相pH值有關(guān) 弱酸 HA: pHHA 疏水締合tRk pHHA 疏水締合tRk 弱堿A: pHHA+ tR k pHHA+ tR k pH- k關(guān)系曲線圖 但對強酸,強堿不適合。為什么?,4-2 離子對色譜 P333335,定義-將一種與溶質(zhì)離子電荷相反的離子(反離子),加 到流動相中與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對,能 夠在兩相之
40、間進行分配。 反相離子對色譜: 非極性的疏水固定相(C18柱),含有反離子Y+的甲醇-水或 乙腈-水作為流動相,試樣離子X-進入流動相后,生成疏水性離子對X-Y+。 X+水相 + Y-水相 = X+Y-有機相,基本原理:,X+水相 + Y-水相 = X+ Y-有機相 形成的離子對化合物X+Y-,在兩相間進行分配 平衡常數(shù):,溶質(zhì)的容量因子k為:,容量因子隨KXY和Y-水相的增大而延長,而KXY取決于反離子和固定相的性質(zhì),則控制流動相中加入的反離子特性和濃度可以調(diào)節(jié)組分保留時間,達到提高色譜分離選擇性的目的。,常見:固定相:化學(xué)鍵合相 流動相:緩沖溶液(含反離子) 有機改善劑
41、 離子對試劑:,陰離子分離:常用烷基銨類(十六烷 基三甲胺、四丁基胺) 陽離子分離:常用烷基磺酸鹽(己烷磺 酸鈉、高氯酸鹽)。,四、影響反相離子對色譜分離選擇性因素,1.溶劑極性的影響 極性有機溶劑比例洗脫強度k 2.離子強度的影響 水溶液中離子強度 洗脫能力 k 3.PH值的影響 弱酸:PH值接近7組分完全電離最易形成 離子對k最大 PHX-HX 固定相中離子對減少k 一般:PH=27.4 PH8 硅膠溶解,,4.離子對試劑性質(zhì)和濃度的影響 離子對試劑烷基鏈疏水性締合物 k 無機鹽離子對試劑疏水性減少締合物k 離子對試劑濃度:10-410-2mol/L 5.溫度的影
42、響 流動相粘度大, 溫度柱效,思考: 1.反相離子對色譜中,那些因素影響組分的保留?如何影響? 2.離子交換色譜中,溶質(zhì)、固定相、流動相三者間具有怎樣的關(guān)系?它們是如何影響組分的保留的?,第五章: 體積排阻色譜法 (凝膠色譜法),根據(jù)化合物分子大小和形狀差別進行分離的方法 分離對象: 高分子化合物、生物大分子樣 品、蛋白質(zhì)樣品。 固定相:凝膠(具有一定大小孔徑分布),原理:按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙中通過,出峰最慢;中等分子只能通過部分凝膠空隙,中速通過;而大分子被排斥在外,出峰最快; 凝膠色譜的校正曲線 MV關(guān)系曲線 (分子量越小,滲透越深,洗脫體積越大),凝膠色
43、譜特點:,a.樣品峰全部在溶劑的保留時間前洗脫 b.柱內(nèi)的峰擴展較小 c.峰較窄,有利于檢測 d.采用示差檢測器 不足:a.峰容量小 b.不能分離大小相似、分子量接近 的組分,固定相,(1)半剛性凝膠 高交聯(lián)度的聚苯乙烯,孔徑范圍較寬。常以有機溶劑作流動相。 孔徑10nm 分子量103 孔徑10200nm 分子量50107 (2)剛性凝膠 多孔硅膠,它既可用水溶性溶劑,又可用有機溶劑作流動相,可在較高壓強和較高流速下操作,但易拖尾。,凝膠的選擇:,滲透極限可以分離的最高分子量 (與孔徑有關(guān): 孔徑大,滲透極限大) 分離范圍校正曲線的線性部分 不同凝膠有不同的滲透極限和分離范圍,移動
44、相選擇 P321326, 339 341,a.能溶解樣品 b.不應(yīng)造成填料太大的溶脹或收縮 c.控制PH和離子強度,可消除非排除機理的影響 (離子強度0.050.1 常用磷酸鹽或硫酸鹽 PH接近中性為宜) d.盡量降低溶劑粘度(加電介質(zhì)) e.選擇與樣品折射率差別大的溶劑,提高靈敏度 樣品濃度:0.010.5% 常用:甲苯、苯、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、四氫呋 喃、水溶液,色譜分離方法的選擇,要正確地選擇色譜分離方法,必須做到 了解樣品的有關(guān)性質(zhì). 熟悉各種色譜方法的主要特點及其應(yīng)用范圍。 選擇色譜分離方法的主要依據(jù): 樣品的分子量的大小, 在水中和有機溶劑中的溶解度,極
45、性和穩(wěn)定程 度 化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。,一、分子量 對于分子量較低(一般在200以下),揮發(fā)性比較好,加熱又不易分解的樣品,可以選擇氣相色譜法進行分析。 分子量在2002000的化合物,可用液固吸附、鍵合相色譜和離子交換色譜法。 分子量高于2000,則可用排阻色譜法。,二、溶解度 水溶性樣品最好用離子交換色譜法和離子對色譜法; 微溶于水,但在酸或堿存在下能很好電離的化合物,也可用離子交換色譜法; 油溶性樣品或相對非極性的混合物,可用液-固色譜法。,三、化學(xué)結(jié)構(gòu) 若樣品中包含離子型或可離子化的化合物,可首先考慮用離子交換色譜。 異構(gòu)體的分離可用液固色譜法; 同系物可用反相鍵合相
46、色譜法; 對于高分子聚合物,可用體積排阻色譜法,小結(jié):,a.已知結(jié)構(gòu)試樣查閱文獻資料以其他色譜分離技術(shù)作參考 b.分子量較大(M2000)蛋白質(zhì)、高聚物凝膠色譜法 c.分子量較?。?M2000)試樣多種溶劑中溶解度情況決定分離類型、填料、流動相 由于試樣組分的復(fù)雜性,還需對試樣的來源、性質(zhì)等作詳細了解,以作選擇參考。,分離類型選擇,,應(yīng)用 目前已普及于幾乎所有重要的分析學(xué)科領(lǐng)域和許多科研生產(chǎn)部門,高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的大分子和離子型物質(zhì),各種高分子化合物和不穩(wěn)定化合物。,例如:蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農(nóng)藥、甾族化合
47、物、多環(huán)芳烴、合成聚合物、瞟吟、維生素、除銹劑、防老劑等等。,,農(nóng)藥的分析,作業(yè):,思考題: 54,55,56,57,58,第六章、實驗技術(shù)和輔助實驗技術(shù),61 定性和定量分析 一、定性分析 利用保留值定性 a.與標準物對照 b.將標準物加入樣品中 c.二極管陣列檢測器 聯(lián)機定性 收集洗脫液后定性分析,二、定量分析,標準曲線法(外標法) 是一種簡便、快速的絕對定量方法。 步驟: 用標準樣品配制成不同濃度的標準系列,在與欲測組分相同的色譜條件下,準確進樣,測量各峰的峰面積或峰高,用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線。 特點: 適用于大量分析色譜條件完全相同,歸一化法(所有組分都出峰,并在
48、檢測器上都 有信號) 內(nèi)標法(選取合適內(nèi)標物.準確度,精密度較 好) 標準加入法(加入標準樣品,利用加入 前后峰面積變化計算),三、影響定量分析結(jié)果準確度因素,樣品制備 a. 樣品溶劑與洗脫液互溶性好 b. 將干擾組分盡可能分離 c.含量低時必須富集 回收率試驗:標準物加入到已知含量被測樣 品中用制備樣品同樣方法處理定量 測定,得回收率。 回收率(測定值樣品值)/加入量 目的:檢驗被測組分在制備中是否100%定量 轉(zhuǎn)化,儲存條件:低溫、干燥、避光 樣品制備方法:a.溶解(超聲波、離心) b.濃縮 c. 萃取 d.預(yù)分離 e.衍生化 進樣技術(shù) 影響因素:a.進
49、樣裝置的準確度和精度 b.分析人員對進樣技術(shù)的熟練程度 進樣六通進樣閥(定量進樣管34倍),檢測器特性 穩(wěn)定性和線性范圍直接影響定量準確性 a.被測組分濃度和響應(yīng)值呈線性關(guān)系 b.進樣量不能超出線性范圍 注:定量分析不宜采用梯度洗脫(基 線易漂移),62 HPLC實驗技術(shù),一、色譜柱的保養(yǎng) 新柱要作凈化處理 平時使用: a.正式進樣前,先用流動相沖平衡 b.一種流動相換另一種時,需互溶 柱的儲存: 儲存于相對惰性溶劑中(反相柱用甲醇) 對復(fù)雜樣品或易污染樣品,應(yīng)裝預(yù)柱 實驗結(jié)束時,當洗脫液用緩沖液,應(yīng)先水沖柱甲醇保護,二、流動相的處理,流動相的脫氣 原因:a.高柱壓下流動相中空氣,會在
50、柱 的洗脫 液流中形成氣泡,干擾檢測器信號。 b.除去氧(氧易與固定相、流動相反應(yīng), 不利于柱 穩(wěn)定) 脫氣方法:a.真空脫氣法 b.惰性氣體吹脫法 c.超聲波脫氣法,,流動相的純化 a.將溶劑通過干燥的多孔硅膠漏斗(0.45) b.在進樣器之前設(shè)置預(yù)柱,將雜質(zhì)吸附掉 流動相配制 a.先配制再脫氣,或先脫氣再配制 b.對含量少的溶劑必須用移液管精確量取 c.如用緩沖液,濃度應(yīng)盡量低些 (0.0010.01mol/L),三、樣品的預(yù)處理,目的:除去微粒 減少干擾雜質(zhì) 微量組分濃縮 改善分離效果 儀器和色譜柱得到保護 對樣品預(yù)處理,達到以下要求:
51、 樣品全部轉(zhuǎn)化為溶液 溶液濃度低 溶劑洗脫強度低于流動相,與流動相相溶,預(yù)處理常用方法,萃取法 水溶液試樣被分析物質(zhì)用有機溶劑萃取 常用:CHCl3、CH2Cl2、正己烷、二乙醚、 苯、乙酸乙酯 脂溶性非離子型化合物雜質(zhì)形成鹽萃取到 水相 吸附法:a.薄層吸附: 吸附劑硅膠、氧化鋁 b.預(yù)柱吸附:(被分析物吸附到柱上) 膜過濾法:去除蛋白質(zhì) 衍生化法:,63 HPLC輔助實驗技術(shù),一、化學(xué)衍生化技術(shù) 柱前衍生化被測組分通過衍生化反應(yīng),生成衍生化產(chǎn)物,然后通過色譜柱進行分離、測定。 優(yōu)點:不受反應(yīng)條件限制、允許較長反應(yīng)時 間、試劑過量易除去 缺點:反應(yīng)后易產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物,給分
52、 離帶來困難,,柱后衍生化樣品先通過色譜柱流出的組分分別與衍生化試劑反應(yīng),衍生化產(chǎn)物進入檢測器 優(yōu)點:可自動連續(xù)進行、操作簡便,不會 因衍生化反應(yīng)給色譜分離帶來困難 缺點:儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜、要求反應(yīng)時間短, 重現(xiàn)性好、柱后死體積大 無論柱前、柱后,都要求: a.反應(yīng)定量進行 b.副反應(yīng)和過量試劑不影響檢測,二、柱切換技術(shù),應(yīng)用范圍:分離分析極性范圍很寬的多組 分樣品,可用梯度洗脫代替。 該技術(shù): 樣品富集、純化、制備、切割 柱切換閥要求: a.能承受無數(shù)次切換循環(huán) b.死體積小 c.閥材料無吸附性、耐腐蝕,三、制備色譜,分析色譜在樣品分離基礎(chǔ)上, 作定性、定量分析 (進樣量?。?制備色譜在分離基礎(chǔ)上,獲得 純物質(zhì)(進樣量大),液相制備色譜儀,遇到的典型問題,獲得最大制備量的途徑,微量和痕量組分的分離制備,再循環(huán)技術(shù)將含有重疊峰的組分洗脫液從檢測器出口泵色譜柱,進行第二、三次分離,能得到良好分離效果對儀器要求:制備數(shù)mg以下分析色譜儀,3mg為最大進樣量制備數(shù)十mg制備型色譜儀,內(nèi)徑:23.4mm、流量10ml/min樣品濃度:a.制備色譜:0.110% b.分析色譜:0.050.5,
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