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1、1方法原理2氣相色譜儀3實(shí)驗(yàn)技術(shù)4氣相色譜應(yīng)用實(shí)例5實(shí)驗(yàn) 第 六 章 高 效 液 相 色 譜 法 第 六 章 高 效 液 相 色 譜 法 第 六 章 高 效 液 相 色 譜 法 第 一 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 的 主 要 類(lèi) 型u 高效液相色譜（H PLC）分析的分類(lèi) 液固吸附色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上的分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離； 液液分配色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離； 離子交換色譜法； 體積排阻色譜法； 離子對(duì)色譜法； 親和色譜法； 第 一
2、 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 的 主 要 類(lèi) 型v 高效液相色譜分析的特點(diǎn) 能實(shí)現(xiàn)高效的分離; HPLC完成一次分離分析一般只需幾分鐘到幾十分鐘，比經(jīng)典液相色譜快得多; 靈敏度高，使HPLC的最小檢測(cè)量可達(dá)10-1110-9g; 能與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，自動(dòng)化程度高； 應(yīng)用范圍廣，對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制； 流動(dòng)相可選擇范圍廣，可通過(guò)改變流動(dòng)相組成來(lái)改善分離效果； 餾分容易收集，更有利于制備； 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 1、貯液器和吸濾器：一 、 高 壓 輸 液 系 統(tǒng)貯液器: 1-2L的 玻 璃 瓶溶劑吸濾器: Ni合
3、金，孔約0.45 m，防止顆粒物進(jìn)行泵內(nèi)。 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 2、高壓輸液泵 要求流量準(zhǔn)確可調(diào)、可調(diào)范圍寬：流動(dòng)相流速在0.5-2mL/min，輸液泵的最大流量5-10mL/min耐高壓：輸出壓力常達(dá)30-60MPa液流穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 活塞型往復(fù)泵液相色譜儀中使用最廣泛的恒流泵 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 雙活塞型往復(fù)泵 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 離線超聲波振蕩脫氣在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣在線真空脫氣裝置3、脫氣裝置 ：將相對(duì)分子量小的氣體從溶劑中除去 第
4、 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 4、梯度洗脫裝置：為什么要進(jìn)行梯度洗脫？ 使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離梯度洗脫：在分離過(guò)程中逐漸改變流動(dòng)相組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、pH值等。 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 高壓梯度： 用于二元梯度，用兩個(gè)泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩溶液至混合器 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 低壓梯度： 只用一個(gè)高壓泵，在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 二 、 進(jìn) 樣 系 統(tǒng)將樣品溶液準(zhǔn)確送入色譜柱的裝置 手動(dòng)方式、自動(dòng)方式 密封性好、死體積小、重復(fù)性好、進(jìn)樣
5、時(shí)引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)要很小。進(jìn)樣器要求常用手動(dòng)進(jìn)樣器六通閥進(jìn)樣器， 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 六通閥進(jìn)樣Load Inject 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 三 、 色 譜 柱柱 長(zhǎng) 1530cm， 內(nèi) 徑 45mm基質(zhì) (硅膠或高分子聚合物微球)功能層(固定在基質(zhì)表面對(duì)樣品分子保留起實(shí)質(zhì)作用的有機(jī)分子或功能團(tuán)) 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 四、 檢測(cè)系統(tǒng) 用來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。 溶質(zhì)性檢測(cè)器：僅對(duì)被分離組分理化特性響應(yīng)紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器總體檢測(cè)器：對(duì)試樣和洗脫液總理化性質(zhì)響應(yīng)示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器 第 二
6、節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 石 英 窗接 色 譜 柱UV 光 電倍 增 管廢 液1、紫外檢測(cè)器微量吸收池，光程為2-10mm, 體積約為110 L最小檢測(cè)量10-9gml-1對(duì)流量和溫度波動(dòng)不敏感可用于梯度洗脫。 最常用的通用型檢測(cè)器 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 光電二極管陣列檢測(cè)器時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)三維譜 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 2、熒光檢測(cè)器靈敏度高選擇性好樣品量很小適合藥物和生化樣品分析 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 3、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器適于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 光
7、 源調(diào) 零光 學(xué) 零參 比 樣 品平 面 鏡 透 鏡 光 電 轉(zhuǎn) 換 記 錄 儀放 大 器遮 光 板溶劑相和樣品+溶劑相對(duì)光的折射率不同，造成兩束光強(qiáng)度差變化，差示信號(hào)放大記錄代表樣品濃度通用型檢測(cè)器，靈敏度為10-7g/ml 對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗4、示差折光檢測(cè)器 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 接 參 比 電 極和 對(duì) 電 極 接 色 譜 柱Teflon塑 料 塊 1 cm 工 作 電 極(Pt, Au, 碳 糊 )5、安培檢測(cè)器 利用待測(cè)物在工作電極表面發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生電流，此電流大小與待測(cè)物濃度成正比。 流動(dòng)相必須含電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。只能檢測(cè)具有電活性的物質(zhì)。 第
8、二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 五 、 數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)色譜工作站在線顯示自動(dòng)采集處理儲(chǔ)存自動(dòng)控制 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 1、 定 性 分 析色譜鑒定法：保留時(shí)間對(duì)照化學(xué)鑒定法：利用專(zhuān)屬化學(xué)反應(yīng)對(duì)分離 后收集的組分定性色譜-光譜聯(lián)用定性 非在線色譜光譜聯(lián)用法： 色譜光譜聯(lián)用儀 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應(yīng) 用 2、 定 量 分 析外標(biāo)法：外標(biāo)工作曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法、外標(biāo)二點(diǎn)法等 不需知道校正因子，但需進(jìn)樣量準(zhǔn)確內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)工作曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)對(duì)比法 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應(yīng) 用 1、在食品分析中的應(yīng)用食品營(yíng)養(yǎng)成分分析：蛋
9、白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)、色素、維生素、香料、礦物質(zhì)等；食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑、抗氧化劑等；食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多環(huán)芳烴等。 2、在環(huán)境分析中的應(yīng)用 多環(huán)芳烴、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類(lèi)）殘留等。3、H PLC的應(yīng)用領(lǐng)域 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應(yīng) 用 3、在生命科學(xué)中的應(yīng)用 分子水平上研究生命科學(xué)、遺傳工程、臨床化學(xué)、分子生物學(xué)等必不可少的工具低分子量物質(zhì)：氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、類(lèi)固醇、卟啉、糖類(lèi)、維生素等分離和測(cè)定高分子量物質(zhì)：多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶的純化、分離和測(cè)定 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應(yīng) 用 4、在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用 體液中代謝物測(cè)定；藥代動(dòng)力學(xué)研究；臨床藥物監(jiān)測(cè)：合成藥物：抗生素、抗憂郁藥、黃胺類(lèi)藥等天然藥物：生物堿（吲哚堿、強(qiáng)心甙）等5、在無(wú)機(jī)分析中的應(yīng)用 陽(yáng)、陰離子的分析等。 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應(yīng) 用
儀器分析(高職)黃一石主編 第六章 高效液相色譜法
