過氧化氫酶的活力和動力學常數(shù)測定生化實驗技術

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1、 實驗二、過氧化氫酶的活力和動力學常數(shù)測定高錳酸鉀滴定法高錳酸鉀滴定法一、實驗目的一、實驗目的l1.掌握酶活力測定的方法掌握酶活力測定的方法l2.了解過氧化氫酶在生物體中的作用原理了解過氧化氫酶在生物體中的作用原理l3.掌握測定過氧化氫酶米氏常數(shù)的基本原理和掌握測定過氧化氫酶米氏常數(shù)的基本原理和方法方法二、實驗原理二、實驗原理l過氧化氫酶（過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。是還原劑。

2、lR(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3+OH)lR(Fe3+OH)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2l總反應式總反應式：2 H2O2 2H2O+O2過氧化氫酶過氧化氫酶l據(jù)此，可根據(jù)據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或的消耗量或O2的生成量測定的生成量測定該酶活力大小。該酶活力大小。l在反應系統(tǒng)中加入過量的在反應系統(tǒng)中加入過量的H2O2溶液，經(jīng)酶促反溶液，經(jīng)酶促反應后，用標準高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴應后，用標準高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的定多余的H2O2，即可求出消耗的，即可求出消耗的H2O2的量。的量。l5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4 =5O2+2K

3、HSO4+8H2O+2MnSO4l酶促反應速度可用單位時間底物的減少量表示，即求酶促反應速度可用單位時間底物的減少量表示，即求出單位時間內(nèi)反應前后出單位時間內(nèi)反應前后H2O2濃度差，即可計算出酶促濃度差，即可計算出酶促反應速度。反應速度。l米氏方程的倒數(shù)形式，即雙倒數(shù)作圖法米氏方程的倒數(shù)形式，即雙倒數(shù)作圖法（LineweaveR-Burk法）如下：法）如下： S為底物濃度（為底物濃度（mol/L） v0為初速度（為初速度（mol/L*min） vmax為最大反應速度（為最大反應速度（mol/L*min） Km為米氏常數(shù)（為米氏常數(shù)（ mol/L）l用雙倒數(shù)法（以用雙倒數(shù)法（以1/v0對對1/S

4、作圖）作圖） 計算米氏常數(shù)計算米氏常數(shù)Km和最大反應速度和最大反應速度vmaxmaxmax011vSvKvm三、材料、試劑與器具三、材料、試劑與器具 1.1.材料：材料：新鮮馬鈴薯2.2.試劑：試劑：（1）10% H2SO4；（2）0.2mol/L磷酸緩沖液pH7.8；（3）0.02mol/L高錳酸鉀標準液配制：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000mL ，臨用前用草酸鈉標定。 高錳酸鉀溶液標定：高錳酸鉀溶液標定： 取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10% H2SO4H2SO4溶液于錐形瓶中，溶液于錐形瓶中，加熱至（加熱至（75758585）（見冒熱氣），趁

5、熱用（見冒熱氣），趁熱用KMnOKMnO4 4標準溶標準溶液滴定，剛開始反應較慢，滴入一滴液滴定，剛開始反應較慢，滴入一滴KMnOKMnO4 4標準溶液搖動，標準溶液搖動，待溶液褪色，再加第二滴待溶液褪色，再加第二滴KMnOKMnO4 4（此時生成的（此時生成的MnMn2+2+起催化作起催化作用）。隨著反應速度的加快，滴定速度也可逐漸加快，但用）。隨著反應速度的加快，滴定速度也可逐漸加快，但滴定中始終不能過快，不斷搖動或攪拌。滴定至溶液呈滴定中始終不能過快，不斷搖動或攪拌。滴定至溶液呈現(xiàn)微紅色并持續(xù)半分鐘不褪色即為終點。現(xiàn)微紅色并持續(xù)半分鐘不褪色即為終點。l離子反應方程式：離子反應方程式：2M

6、nO2MnO4 4- -+5C+5C2 2O O4 42-2-+16H+16H+ +2 Mn 2 Mn 2+2+10CO+10CO2 2+ 8 H+ 8 H2 20 0l計算公式：標定的計算公式：標定的 KMnO4KMnO4 C=0.2/V mol/L C=0.2/V mol/L（4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大約等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標準0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性條件下）進行標定；（5）0.1mol/L草酸鈉：稱取優(yōu)級純Na2C2O4 13.4g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。3.器具器具（1）恒溫水

7、?。唬?）研缽；三角瓶50ml4；酸式滴定管（10ml）；容量瓶25ml1等四、實驗步驟四、實驗步驟（一）酶液提取（一）酶液提取l取新鮮馬鈴薯取新鮮馬鈴薯5g加入加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用該緩沖液容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將緩沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一沖洗研缽，并將緩沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一緩沖液定容，緩沖液定容，4000rpm離心離心15min，上清液即為，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。過氧化氫酶的粗提液。（二）酶活力的測定（二）酶活力的測定1.反應反應l取取50ml三角瓶三角瓶4個（兩個測定兩個對照

8、），測定瓶中加入個（兩個測定兩個對照），測定瓶中加入酶液酶液2.5ml，對照瓶中加入煮死酶液，對照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時計時，于，同時計時，于30恒溫水浴中保溫恒溫水浴中保溫10min，立即加入，立即加入10% H2SO4 2.5ml。2.滴定滴定l用用0.02mol/L KMn4標準溶液滴定標準溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色，至出現(xiàn)粉紅色（在（在30s內(nèi)不消失）為終點。內(nèi)不消失）為終點。3.計算計算l酶活力用每克鮮重樣品酶活力用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示的毫克數(shù)表示l酶活酶活(mgH2O2/gmin)=

9、l式中：式中： A對照對照KMnO4滴定毫升數(shù)；滴定毫升數(shù)； B酶反應后酶反應后KMnO4滴定毫升數(shù)；滴定毫升數(shù)； VT酶液總量（酶液總量（ml）；）； V1反應所用酶液量（反應所用酶液量（ml）；）； F W樣品鮮重（樣品鮮重（g）；）； 1.71ml 0.02mol/L的的KMnO4相當于相當于1.7mg H2O2().ABVFWVtT171（三）動力學常數(shù)的測定（三）動力學常數(shù)的測定（vmax和和Km）l取取100mL錐形瓶錐形瓶5個，編號后按下表加入試劑個，編號后按下表加入試劑l各瓶分別加好各瓶分別加好H2O2和蒸餾水后，再依次加入酶液和蒸餾水后，再依次加入酶液0.5mL，混勻，記錄各

10、瓶起始反應的時間。反應，混勻，記錄各瓶起始反應的時間。反應5min后立即加入后立即加入25% H2SO4 2.0mL終止反應，終止反應，試劑編號123450.05mol/L H2O2(mL)1.001.251.672.505.00蒸餾水(mL)8.508.257.837.04.51.反應反應l用用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的滴定各瓶中剩余的H2O2至微紅色，至微紅色，記錄消耗的記錄消耗的KMnO4溶液毫升數(shù)。溶液毫升數(shù)。l分別求出各瓶反應前后的底物濃度分別求出各瓶反應前后的底物濃度S0、S1，并計算反，并計算反應速度應速度v0： S0=C1V1/10 S1=2.5C2V2/

11、10 v0=(C1V1-2.5C2V2)/5l以以1/v0對對1/S作圖作圖 求出求出Km和和Vmax （用（用excel作圖）作圖）2.滴定滴定3.計算計算S0為反應前的底物濃度（為反應前的底物濃度（mol/L）S1為反應后的底物濃度（為反應后的底物濃度（mol/L）C1為為H2O2的濃度（的濃度（mol/L）C2為為KMnO4用液的濃度（用液的濃度（mol/L）V1為為H2O2的體積（的體積（mL）V2為滴定消耗的為滴定消耗的KMnO4用液的體積（用液的體積（mL）v0為反應速度（為反應速度（mmol/min）5為反應時間（為反應時間（min）10為反應液體積（為反應液體積（mL）注意事項

12、注意事項l每個三角瓶內(nèi)的酶促反應時間要精確控制在每個三角瓶內(nèi)的酶促反應時間要精確控制在5min。l各反應瓶的滴定終點微紅色應為同一標準。各反應瓶的滴定終點微紅色應為同一標準。l使用前，應檢查滴定管是否滲漏，滴定過程中應使用前，應檢查滴定管是否滲漏，滴定過程中應該保證逐滴加入。該保證逐滴加入。六、研討題六、研討題l1.影響過氧化氫酶活力測定的因素有哪些影響過氧化氫酶活力測定的因素有哪些?l2.過氧化氫酶與哪些生化過程有關過氧化氫酶與哪些生化過程有關?l3.什么是酶的什么是酶的Km和和Vmax？如何測定？如何測定？l4.在反應速度的測定中，加入硫酸有哪些作用？在反應速度的測定中，加入硫酸有哪些作用？l5.過氧化氫酶的活力測定還有另外一種方法，即紫外吸收過氧化氫酶的活力測定還有另外一種方法，即紫外吸收法，原理是法，原理是H2O2在在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間隨反應時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活力。請你查閱資料設計一個應用該方法測定過氧化氫的活力。請你查閱資料設計一個應用該方法測定過氧化氫酶活力的實驗。酶活力的實驗。