河南科技學(xué)院常景玲第六章.ppt

《河南科技學(xué)院常景玲第六章.ppt》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《河南科技學(xué)院常景玲第六章.ppt（37頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

,,6.1微生物發(fā)酵與制藥6.2微生物生長(zhǎng)與生產(chǎn)的關(guān)系6.3制藥微生物生產(chǎn)菌種建立6.4培養(yǎng)基制備6.5滅菌工藝6.6發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)6.7發(fā)酵工藝過(guò)程的控制6.8青霉素的生產(chǎn)工藝,第六章微生物發(fā)酵制藥工藝,,,青霉素的概述生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性發(fā)酵工藝過(guò)程提煉工藝過(guò)程,6.8青霉素的生產(chǎn)工藝,,1929:Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無(wú)法分離并用作藥物。1939：牛津病理家HowardFlorey化學(xué)家ErnstChain,NormanHeatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)霉菌，培養(yǎng)里提取，測(cè)活性，青霉素結(jié)晶。,6.8.1概述－發(fā)現(xiàn)（1）,1940:8只鼠注射鏈球菌，提取物對(duì)4只治療。未經(jīng)治療鼠在24小時(shí)內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。1941年2月開(kāi)始治療第一批人類病人。1943：威斯康辛大學(xué)小組，取得突破生產(chǎn)菌表面培養(yǎng)：幾十個(gè)單位。深層培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉：100U/ml。X、UV誘變育種：1000－1500U/ml。不產(chǎn)色素變種：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。,,細(xì)胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類似物競(jìng)爭(zhēng)性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長(zhǎng)中的細(xì)胞有效，靜止細(xì)胞無(wú)效高效、安全的抗細(xì)菌感染藥物,6.8.1概述－作用機(jī)理（2）,,（1）臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。（2）各種半合成抗生素的原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素頭孢菌素母核。,6.8.1概述－應(yīng)用（3）,6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic6APA）苯乙酰衍生物。側(cè)鏈基團(tuán)不同，形成不同的青霉素G：芐基青霉素，C6H5CH2-CO-，為主雙氫霉素F：戊青霉素X：對(duì)羥芐基青霉素F：2-戊烯基青霉素K：庚青霉素V：苯氧甲基青霉素產(chǎn)品：鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺,6.8.1概述－分子結(jié)構(gòu)及衍生物（4）,產(chǎn)黃青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。青霉穗:分生孢子鏈狀??深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。,6.8.2青霉素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性,第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：脂肪包涵體，貯藏物，嗜堿性很強(qiáng)。第4期：空泡，嗜堿性減弱，開(kāi)始產(chǎn)生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：個(gè)別細(xì)胞自溶，胞內(nèi)無(wú)顆粒，釋放氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。,發(fā)酵培養(yǎng)下的生長(zhǎng)過(guò)程及細(xì)胞學(xué)變化,規(guī)定時(shí)間取樣，顯微鏡觀察7個(gè)時(shí)期的態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長(zhǎng)期，3期的菌體適宜種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過(guò)工程措施，延長(zhǎng)此期，獲得高產(chǎn)。第6期到來(lái)之前結(jié)束發(fā)酵。,鏡檢控制,青霉素生產(chǎn)流程框圖,斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7天，25℃注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。,6.8.3發(fā)酵工藝過(guò)程,一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；300-350rpm；pH自然，溫度271℃,40h二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，251℃。10-14h質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h,2、種子罐培養(yǎng)工藝,三級(jí)罐：生產(chǎn)罐；接種量20％培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.參數(shù)條件：通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小時(shí):pH6.4-6.6，26℃；60小時(shí)后:pH6.7,24℃。,3、生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝,操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3.帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。發(fā)酵周期：180-220h,4、發(fā)酵培養(yǎng)與過(guò)程控制,青霉素的生產(chǎn)周期,發(fā)酵動(dòng)力學(xué),前40小時(shí)：培養(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)物40小時(shí)后：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態(tài)：延長(zhǎng)合成期，提高產(chǎn)量。碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。,（1）過(guò)程控制——補(bǔ)料分批操作控制基質(zhì)濃度,根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動(dòng)范圍較窄，濃度過(guò)低使抗生素合成速度減慢或停止，過(guò)高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開(kāi)始升高時(shí)流加糖。濃度：500kg/M3，流速:1.0-2.5kg/M3.h,流加碳源控制,玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素氨基氮濃度：0.01-0.05%。,流加氮源控制,無(wú)機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對(duì)青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁涂環(huán)氧樹(shù)脂保護(hù)層。,鹽離子控制,時(shí)期：合成階段種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸毒性：抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和青霉素合成。策略：低濃度流加濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%控制：保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。,（2）添加青霉素側(cè)鏈前體,表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保護(hù)劑；分散劑,提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加,適宜菌絲生長(zhǎng)溫度30℃，分泌青霉素20℃。20℃青霉素破壞少，周期很長(zhǎng)。變溫控制，不同階段不同溫度。生長(zhǎng)階段:較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃,（3）溫度控制,合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過(guò)7.0直接加酸或堿：自動(dòng)控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）,（4）pH控制,＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長(zhǎng)和耗氧量不同。,（5）溶氧控制,天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。,（6）消沫,青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。,2.8.4提煉工藝過(guò)程,青霉素的存在部位：發(fā)酵液濃度較低：10－30Kg/M3含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過(guò)程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白,1、預(yù)處理,鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0.5-2.0%。板框式過(guò)濾機(jī)過(guò)濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提取（收率90％）,2、過(guò)濾,原理：青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃取：2－3次。,3、溶劑萃取,正相萃?。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機(jī)分離（濃縮1.5-2.1）反相萃?。簆H6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。反復(fù)萃取2－3次，達(dá)到結(jié)晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。,逆流萃取過(guò)程,萃取液中添加活性炭，除去色素過(guò)濾，除去活性炭。,4、脫色,加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。,5、結(jié)晶——直接結(jié)晶,萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。加3-4倍體積丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過(guò)洗滌、干燥（60℃真空16h），磨粉，裝桶，得到青霉素產(chǎn)品。,5、結(jié)晶——共沸蒸餾結(jié)晶,青霉素的概述生產(chǎn)菌特性發(fā)酵工藝過(guò)程提煉工藝過(guò)程,小結(jié),（1）青霉素發(fā)酵工藝的建立對(duì)抗生素工業(yè)有何意義？（2）如何根據(jù)青霉素生產(chǎn)菌特性進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程控制？（3）青霉素發(fā)酵過(guò)程的控制原理及其關(guān)鍵點(diǎn)是什么？（4）青霉素提煉工藝中采用了哪些單元操作，為什么？,思考題,