十字花科植物DFR蛋白的生物信息學(xué)分析

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1、十字花科植物DFR蛋白的生物信息學(xué)分析 植物花色主要是由類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜色素三大色素決定的。花青素是一類十分重要的類黃酮化合物，廣泛分布于各種植物中，其賦予了植物花、葉和果實各種顏色【1】，它主要調(diào)控花、葉和果實生成紅色、紫色和藍(lán)色?；ㄉ蘸铣蛇^程中，二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變成花色苷的反應(yīng)非常復(fù)雜，二氫黃酮醇4-復(fù)原酶〔dihydroflavonol4-reductase，DFR〕是這一轉(zhuǎn)變中起作用的第一個酶，失去DFR活性的突變體產(chǎn)生象牙色或者白色【2】。DFR是花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，是一個重要的調(diào)控點。它以二氫堪非醇〔dihydrokaempferol，DHK〕、二氫櫟皮黃酮〔di

2、hydroquercetin，DHQ〕和二氫楊梅黃酮〔dihydromyricetin，DHM〕為底物，在輔因子NADPH的作用下將4位的羰基復(fù)原為羥基，產(chǎn)生相應(yīng)的不穩(wěn)定無色花青苷元，然后這些無色花青苷元在花色素合酶〔anthocyanidinsynthase，ANS〕和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶〔flavonoid3-O-glucosyltransferase，3GT〕的催化下分別形成矢車菊素、天竺葵素和翠雀素[3-5]。DFR基因調(diào)控機(jī)制的研究對于了解花色素苷生化合成途徑和花朵顯色的分子機(jī)制有重要的意義【6】。目前，DFR基因在很多植物中均已被克隆，由于DFR基因具有底物特異性，利用該特點可

3、以定向改良花的顏色【7】。自1987年Meyer等[8]將玉米DFR基因?qū)氚珷颗C01突變體使花色由白色變?yōu)榈u紅色以來，其在改造花色方面的應(yīng)用取得了很多進(jìn)展[9-12]。該研究采用生物信息學(xué)的方法，對十字花科植物DFR氨基酸序列的組成成分、理化特性、亞細(xì)胞定位、功能結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行預(yù)測和推斷，以期為進(jìn)一步研究十字花科花色素苷生物合成的分子機(jī)制以及選育不同花色的植物資源提供根底資料。1材料與方法1.1數(shù)據(jù)獲取以dihydroflavonol4reductase為信息探針?biāo)阉鱊CBIGene數(shù)據(jù)庫〔s：//ncbi.nlm.nih.gov/gene/〕，獲得十字花科植物的基因序列及編碼的相應(yīng)蛋白

4、質(zhì)序列。1.2DFR蛋白質(zhì)序列分析及亞細(xì)胞定位利用ProtParm在線分析軟件〔：//web.expasy.org/protparam〕預(yù)測各蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及等電點信息[13]。使用WoLFPSORT在線分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位〔：//genscript -/wolf-psort.html〕。1.3DFR蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與磷酸化位點分析通過NCBICDD〔s：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi〕〕平臺獲取蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域[14];利用MEMEVersion4.12.0軟件分析蛋白質(zhì)的保守Motif〔：//meme-suite.

5、org/tools/meme〕[15];利用NetPhos3.1進(jìn)行蛋白質(zhì)的磷酸化位點預(yù)測〔：//cbs.dtu.dk/services/NetPhos/〕[16-17]。1.4DFR蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析利用SOPMA工具〔s：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html〕預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。1.5DFR蛋白質(zhì)同源性比較及進(jìn)化分析用DNAMAN8軟件進(jìn)行序列多重比對分析;使用MEGA7.0軟件中的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用pdistance模型，并設(shè)置Bootstrap值為1000進(jìn)行校正，生成最終的系統(tǒng)進(jìn)化

6、樹[18]。2結(jié)果與分析2.1DFR蛋白序列分析及亞細(xì)胞定位利用NCBIGene數(shù)據(jù)庫，筆者選取了24個其中擬南芥〔Arabidopsisthaliana〕2個、琴葉擬南芥〔Arabidopsislyrata〕3個、甘藍(lán)型油菜〔Brassicanapus〕5個、甘藍(lán)〔Brassicaoleracea〕3個、白菜型油菜〔Brassicarapa〕3個、亞麻芥〔Camelinasativa〕5個、蘿卜〔Raphanussativus〕3個。這些蛋白質(zhì)中序列最長的是RsDFR01〔387aa〕，最短的是AtDFR0401〔326aa〕;外顯子數(shù)目5～7個，大局部都有6個外顯子;分子質(zhì)量36481.8

7、9～43129.21Da;等電點最大的為AlDFR03〔pI=8.80〕，最小的是AlDFR01〔pI=5.07〕，大局部DFR蛋白等電點呈現(xiàn)酸性;利用WoLFPSORT分析亞細(xì)胞定位說明有2個基因所編碼的蛋白定位在細(xì)胞核，17個定位在葉綠體，5個定位于細(xì)胞質(zhì)〔表1〕，可見大多數(shù)基因編碼的蛋白都定位于葉綠體中。2.2蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與磷酸化位點分析DFR蛋白屬于SDR〔shortchaindehydrogenase/reductase，SDR〕蛋白家族，該基因家族有2個高度保守功能結(jié)構(gòu)域，即NADP的結(jié)合功能域和底物特異結(jié)合功能域。利用NCBI的CDD在線分析24個十字花科植物的DFR基因所編

8、碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，除了BnaDFRA402只發(fā)現(xiàn)酶活性部位和底物特異結(jié)合區(qū)域，其他的基因編碼的蛋白均具有酶活性部位、NADP結(jié)合位點和底物特異結(jié)合位點〔表2〕。利用在線軟件MEME分析了DFR蛋白的保守motif，搜索了5個較保守的motifs〔圖1〕，大局部DFR蛋白都含有5個較保守的motifs，但BnaDFRA402只有4個motifs，缺失motif1;BoDFRC702、BrDFRA302、RsDFR03和AlDFR03只有3個，缺失motif1和motif4〔圖2〕。從保守motif序列和位置來看，這些保守的motif均處于保守結(jié)構(gòu)域中，即酶活性部位、NAD〔P〕結(jié)合位點和底物特

9、異結(jié)合位點區(qū)域，也進(jìn)一步說明這些位點對于DFR蛋白功能是保守的。蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測顯示，其均含有多個磷酸化位點，平均45個磷酸化位點，以BnaDFRC701最多，有53個，AtDFR0401最少，僅30個;3種磷酸化類型中，以絲氨酸〔Ser〕磷酸化位點最多，其中又以BnaDFRC701最多〔32個位點〕，CsDFR1801最少〔18個位點〕;其次是蘇氨酸〔Thr〕磷酸化位點，以AlDFR01和AlDFR02最多〔19個位點〕，AtDFR0401最少〔8個位點〕;以酪氨酸〔Tyr〕磷酸化位點最少〔圖3〕?？梢姡只艱FR蛋白的磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔。2.3DFR蛋白

10、的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用SOPMA軟件對DFR蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖4所示，24個DFR蛋白的二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)那么卷曲組成，其中α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)元件，所占比例為33.85%～51.85%，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最低，以CsDFR2021最高為13.53%，CsDFR1201最低僅為7.43%。2.4DFR蛋白質(zhì)同源性比較分析利用DNAMAN對十字花科DFR蛋白進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果說明24個DFR蛋白的氨基酸序列，由于具有種屬差異，相似性為57.16%，但在重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域序列保守性高，如DFR與NADP結(jié)合區(qū)域和底物結(jié)合區(qū)域〔圖5〕。2.5DFR蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的

11、構(gòu)建根據(jù)不同植物DFR蛋白氨基酸多序列比對結(jié)果，結(jié)合鄰近連接法用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖6所示，24個DFR蛋白共分成兩大族，其中AlDFR03、RsDFR03、BoDFRC702和BrDFRA302聚為一族，其他20個蛋白聚為一族。由此看出，同一種屬的DFR蛋白并不完全聚在一起，有些甚至不在同一個族，因此該類蛋白不宜用于十字花科的親緣關(guān)系鑒定及遺傳進(jìn)化分析。3結(jié)論與討論花色是衡量欣賞植物的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，改變花色一直是轉(zhuǎn)基因花卉研究比較熱門的問題。隨著鄉(xiāng)村旅游的開展，油菜花旅游逐年升溫，但單一的黃色油菜花限制了其欣賞價值，因此創(chuàng)制新花色油菜有重要意義。二氫黃酮醇4-復(fù)原酶屬于NA

12、DPH依賴性短鏈復(fù)原酶家族，又屬于細(xì)胞色素P450家族，作為花色素苷合成的關(guān)鍵酶而受到廣泛關(guān)注。隨著測序技術(shù)的開展，公共數(shù)據(jù)量日益增加促使生物信息學(xué)成為后基因組時代用于預(yù)測和研究基因功能的重要方法。該研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對擬南芥、甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、蘿卜等十字花科植物的24個DFR蛋白序列的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測和分析，結(jié)果說明十字花科的DFR蛋白均具有NAD〔P〕結(jié)合位點和底物特異結(jié)合位點，且序列較為保守，亞細(xì)胞定位主要在葉綠體，磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔，但不同種屬的DFR蛋白序列具有一定差異，同一種屬的DFR蛋白并不聚在一起，說明這些DFR在功能

13、上也是有差異的，這些分析為該類基因表達(dá)和功能研究提供了參考，也為將來研究油菜花色形成分子機(jī)制及利用基因工程技術(shù)創(chuàng)新彩色油菜種質(zhì)資源提供了根底資料。參考文獻(xiàn)【1】陳大志，周嘉裕，李萍.二氫黃酮醇-4-復(fù)原酶的生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)通報，2021〔12〕：206-212.【2】楊宏霞，曲柏宏，劉振坤，等.延邊蘋果梨PyDFR基因的克隆及表達(dá)分析[J].北方園藝，2021〔4〕：99-103.【3】周琳，王雁，任磊，等.牡丹二氫黃酮醇-4-復(fù)原酶基因PsDFR1的克隆及表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報，2021，47〔9〕：885-892.【4】TANAKAY，SASAKIN，OHMIYAA.B

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