耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶機(jī)制研究

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1、耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶機(jī)制研究 　　摘　要　目的：探討耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的機(jī)制。方法：對(duì)臨床分離的112株流感嗜血桿菌耐藥菌用紙片法作β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定，用PCR法檢測(cè)產(chǎn)酶流感嗜血桿菌中的β-內(nèi)酰胺酶基因的存在。結(jié)果：紙片法測(cè)得產(chǎn)酶菌株32株，產(chǎn)酶率28.6％(32/112)；32株產(chǎn)酶菌中PCR法測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因陽性菌株29株，陽性率為90.6%(29/32)，其中質(zhì)粒DNA模板組陽性為25株，基因組DNA模板組陽性為4例。結(jié)論：(1)流感嗜血桿菌耐氨芐西林主要由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶所造成。(2)PCR法是研究流感嗜血桿菌是否攜帶β-內(nèi)酰胺酶基

2、因及該基因所在位置的簡(jiǎn)便而有效的方法。 　　自1972年第一次發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌因產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶而致耐氨芐西林以來［1］，國外對(duì)耐氨芐西林流感嗜血桿菌的耐藥機(jī)制以及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的分子基礎(chǔ)研究,呈逐年增加趨勢(shì)。1978年Bryan等［2］首次報(bào)道了質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌。此后，圍繞流感嗜血桿菌中的質(zhì)粒編碼β-內(nèi)酰胺酶及其與耐氨芐西林的關(guān)系進(jìn)行了許多研究。我國由于流感嗜血桿菌的分離率較低，對(duì)此問題的研究一直沒有深入。本文作者在本實(shí)驗(yàn)室成功提高流感嗜血桿菌分離率的基礎(chǔ)上［3,4］，分離獲得36株耐氨芐西林的流感嗜血桿菌，用紙片法測(cè)定它們產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的情況后，用PCR方法

3、對(duì)產(chǎn)酶菌中β-內(nèi)酰胺酶基因的存在與否進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶機(jī)制作了初步分析。 　　1　材料和方法 　　1.1　流感嗜血桿菌的分離培養(yǎng)　收集痰或咽拭子標(biāo)本，于1 h內(nèi)接種于改良的哥倫比亞巧克力瓊脂平板中，置5% CO2孵箱，37℃孵育18～24 h,對(duì)疑似流感嗜血桿菌的菌落分別于血瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上作衛(wèi)星試驗(yàn)，僅在血瓊脂平板上衛(wèi)星試驗(yàn)陽性者為流感嗜血桿菌。用常規(guī)的紙片法（K-B法）對(duì)每個(gè)菌株作體外藥物敏感試驗(yàn)，根據(jù)美國NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果。從平板上挑取耐氨芐西林的單菌落接種于含3 ml液體HTM培養(yǎng)液的試管中，于5% CO2孵箱37

4、℃孵育培養(yǎng)過夜，離心收集菌體用于質(zhì)粒制備等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 　　1.2　紙片法測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶　將流感嗜血桿菌培養(yǎng)物經(jīng)超聲裂解后直接涂布于β-內(nèi)酰胺酶紙片上，在15 min內(nèi)變紅者為陽性。超聲儀為Branson Sonifier 250，β-內(nèi)酰胺酶紙片購自O(shè)xid公司。 　　1.3　PCR法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因 　　1.3.1　PCR引物　針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)基因的PCR引物由本校分子遺傳學(xué)開放實(shí)驗(yàn)室用PCGENE軟件PCRPLAN程序設(shè)計(jì)，上海生工生物工程公司協(xié)助合成。引物序列為：上游引物：5′TGGGTGCACGAGTGGGTTAC3′，下游引物：5′TTA

5、TCCGCCTCCATCCAGTC3′。 　　1.3.2　PCR反應(yīng)條件　用PE2400型DNA擴(kuò)增儀,50 μl PCR反應(yīng)體系中含有模板DNA 1 μl、上游下游引物各1 μl（濃度為25 μmol/L），10緩沖液5 μl，dNTP混合物（10 mmol/L）4 μl，并用ddH2O補(bǔ)足至50 μl（Mg2+的終濃度為1.5 mmol/L），以94℃ 3 min→(94℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 1 min，循環(huán)30次)→72℃ 7 min→4℃保溫。PCR反應(yīng)后取10 μl產(chǎn)物點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照。 　　1.3.3　PCR模板的制備　細(xì)

6、菌質(zhì)粒DNA用常規(guī)堿裂解法分離、RNase Ⅰ消化、酚/氯仿抽提純化［3］；細(xì)菌基因組DNA用菌體凍融法制備：取少量細(xì)菌于1.5 ml塑料離心管中，用蒸餾水重懸，加入少量溶菌酶于37℃水浴5 min，放入液氮迅速冰凍5 min，取出后立即放入37℃水箱融化5 min，重復(fù)凍融3次，室溫下1104 r/min離心5 min，吸取上清液到新的離心管，加入1.5倍 體積的無水乙醇于-20℃沉淀30 min，1.5104 r/min離心沉淀，用10 μl TE溶解后備用。 　　2　結(jié)　果 　　2.1　流感嗜血桿菌的分離　自1997年10月至1998年11月,從我院呼吸內(nèi)科及耳鼻

7、咽喉科呼吸道感染患者中收集634份痰及咽拭子標(biāo)本，分離鑒定出112株流感嗜血桿菌,其中，藥敏試驗(yàn)證明為氨芐西林耐藥的36株。 　　2.2　β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果　36株耐氨芐西林流感嗜血桿菌中，紙片法測(cè)得產(chǎn)酶菌株32株，耐藥菌中產(chǎn)酶率88.9%(32/36)。 　　2.3　PCR法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因結(jié)果　用針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶基因的上游和下游特異性引物擴(kuò)增后，陽性條帶大小為486 bp，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期值相同。32株產(chǎn)酶菌中PCR陽性菌株29株，陽性率為90.6%。其中以質(zhì)粒為模板PCR陽性菌株25株，占產(chǎn)酶菌的78.1%（25/32)；對(duì)7株質(zhì)粒DNA模板PCR陰性的菌株，

8、以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有4株為陽性。 　　3　討　論 　　國外對(duì)耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的分子機(jī)制研究，主要采用的方法是在大量培養(yǎng)細(xì)菌的基礎(chǔ)上，通過CsCl密度梯度超離心等方法獲取較大量的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析、瓊脂糖凝膠電泳、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗(yàn)等，大致分析質(zhì)粒DNA的大小、結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證質(zhì)粒介導(dǎo)的耐氨芐西林表型等，獲得質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)酶及其與耐氨芐西林藥物的關(guān)系等的可靠證據(jù)［6］。但是，自然狀態(tài)的流感嗜血桿菌菌株中所攜帶的野生型質(zhì)粒的大小、結(jié)構(gòu)、拷貝數(shù)差異非常大，對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的數(shù)量、質(zhì)粒抽提純化的方法提出了很高的要求，其結(jié)構(gòu)的變異也造成電泳

9、、酶切分析等方法難以做到精確分析質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。另外，野生型質(zhì)粒的分子量通常較大，常用的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)成功率不高；再加上野生型菌株中所含質(zhì)粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而這些方法都未能直接鑒定質(zhì)粒DNA中是否攜帶有編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因。 　　鑒于上述情況，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶基因的特異性引物，對(duì)所分離獲得的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的耐氨芐西林流感嗜血桿菌中該酶編碼基因的存在情況進(jìn)行了直接的PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，32株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌，用可靠的堿變性法獲取的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽性率達(dá)到78.1%，而7株質(zhì)粒DNA模板PCR陰性的產(chǎn)酶菌株中，有4株在以染色體DNA樣品為模板進(jìn)行的PCR反

10、應(yīng)中表現(xiàn)陽性。這些結(jié)果提示耐氨芐西林的流感嗜血桿菌編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因主要存在于所攜帶的質(zhì)粒DNA上，而有少部分酶基因位于染色體DNA上，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致。從方法上看，本研究所采用的PCR法直接檢測(cè)耐氨芐西林流感嗜血桿菌中β-內(nèi)酰胺酶基因的方法，特異性高，標(biāo)本產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列具有高度的特異性；敏感性高，PCR方法可將待測(cè)DNA片斷的量擴(kuò)大百萬倍，可以檢測(cè)細(xì)菌含量極微的標(biāo)本；既可以測(cè)質(zhì)粒模板β-內(nèi)酰胺酶基因，也可以測(cè)染色體模板β-內(nèi)酰胺酶基因；如果配合PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定等，還可用于β-內(nèi)酰胺酶分類、基因序列分析、分子流行病學(xué)調(diào)查等。但PCR方法有假陽性的情況，如β-內(nèi)酰胺酶基

11、因結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變異但未影響PCR引物結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，可能存在PCR陽性但基因并無活性的情況。從理論上講，能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的菌株均應(yīng)有相應(yīng)的編碼基因存在，但本實(shí)驗(yàn)中有3株P(guān)CR陰性，可能的原因是模板制備過程以及PCR反應(yīng)過程所造成的假陰性所致。雖然國外有用PCR方法檢測(cè)流感嗜血桿菌菌株、β-內(nèi)酰胺酶基因及其分類的報(bào)道［7］，國內(nèi)袁藝等［8］曾用PCR法檢測(cè)流感嗜血桿菌菌株，但對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的耐氨芐西林流感嗜血桿菌，分別以其質(zhì)粒DNA和染色體DNA為模板，用PCR方法測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因，研究其產(chǎn)酶和耐藥機(jī)制的，國內(nèi)外均未見報(bào)道。 　　參考文獻(xiàn) 　　1　Gunn BA, Woodal

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