22《土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)》學(xué)案況家茂

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1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 考點(diǎn)要求 1 ?研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用，進(jìn)行微生物數(shù)量的測(cè)定。 2.能利用選擇培養(yǎng)基分離細(xì)菌，運(yùn)用相矢技術(shù)解決生產(chǎn)生活中有尖微生物的計(jì)數(shù)。雙基過(guò)矢 一、 理論基礎(chǔ) 1. 篩選菌株 (1) 實(shí)驗(yàn)室中微生物篩選的原理：人為提供有利于 等)，同時(shí) 或 其他微生物生長(zhǎng)。 ?生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH (2) 選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許一微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。 (3 )配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù) 種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí) 和 其他種類 根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點(diǎn)加入某種物質(zhì)以達(dá)到選擇的目的。 例如，培養(yǎng)基中不加

2、 入有機(jī)物可以選擇培養(yǎng) 微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培 養(yǎng) ;的微生物?加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。 2. 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 (1 )測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法有 和 (2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目的原理 當(dāng)樣品的 夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一 個(gè) 。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。為了保 證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在 的平板逬行計(jì)數(shù)。此外，測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法 還有 直接計(jì)數(shù)。 3. 設(shè)置對(duì)照 設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié) 果的 。例如為了

3、排除培養(yǎng)基是否被雜菌污染了，需以培養(yǎng) 的培 養(yǎng)基作為空白對(duì)照。 二、 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 矢于土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)操作步驟如下： 1. 取樣：從肥沃、濕潤(rùn)的3 cm左右，再取 土壤中取樣。應(yīng)先一 樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的一中。 2. 制備：準(zhǔn)備牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基 將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白膿培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯 選擇培 養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白膿培養(yǎng)基可以作為 ，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng) 基是否起到了選擇作用。 3. 微生物的與觀察 將10g 土樣加入盛有90 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中(體積為250 mL)，充分搖勻，吸取上清

4、液一，轉(zhuǎn)移至盛有 的生理鹽水的無(wú)菌大試管中，將土樣以 1、101、IO?……依次等 比稀釋至稀釋度，并按照由107?IO?稀釋度的順序分別吸取 進(jìn)行平板涂布操作。每 將涂布好的培養(yǎng)皿放在30C 個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基、1個(gè)牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基。 溫度下培養(yǎng)，及時(shí)觀察和記錄。斜面中，爛睦瞬培贈(zèng)醋琳護(hù)同形態(tài)的菌落接入含 培養(yǎng)基的 4?細(xì)菌的計(jì)數(shù) 2?10的顏色反應(yīng)。 當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)， 出菌的數(shù)目。 毀書(shū)棗進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì) :并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì) 三：思考與討論 (1)如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每

5、克樣品中的菌落數(shù)? (2)為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù) 量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 四：典例分析 類型一選擇培養(yǎng)基的配制 【例1】分析下面培養(yǎng)基的配方： KH2PO4、Na2HP04、MgSO4 7H20、葡萄糖、尿素、瓊脂。 請(qǐng)回答： (1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別 —和 (2)想一想這種培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用 ?如果具有，又是如何進(jìn)行選擇的 類型二統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 【例2】用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為中得到以下幾種統(tǒng)計(jì)106的

6、培養(yǎng)基 結(jié)果，正確的是 A?涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是 B?涂布了兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是 C?涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是 D?涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是 230 215和260,取平均值238 21、212和2墨6，取平均值163 210、240和250,取平均值233 類型三設(shè)置對(duì)照 【例3】用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對(duì)照是 A .未接種的選擇培養(yǎng)基 B ?未接種的牛肉膏蛋白陳(全營(yíng)養(yǎng))培養(yǎng)基C .接種了的牛肉膏蛋白腺(全營(yíng)養(yǎng))培養(yǎng)基D ?接種了的選擇培養(yǎng)基 基礎(chǔ)自測(cè) 一、選擇題 1 . PCR技術(shù)要求使用耐高溫的D

7、NA聚合酶，這種酶要能忍受你來(lái)尋找這 93C左右的高溫。如果請(qǐng) 種 耐高溫的酶，你會(huì)去哪里尋找 () A?土壤中 海水中 C .熱泉中 D.冷庫(kù)中 2 ?下列能選擇出分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基是 A . KH2PO4、Na2HP04、MgS04 7H20、葡萄糖、尿素、瓊脂、水 B . KH2PO4、Na2HP04、MgS04 7H2O、葡萄糖、瓊脂、水 C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSOq 7H2O、尿素、瓊脂、水 D . KH2PO4、Na2HP04、MgS04 7H20、牛肉膏、蛋白腺、瓊脂、水; 3. 某冋學(xué)在稀釋倍數(shù)為 106的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)

8、的平均值為 234，那么每克樣 品中的菌落數(shù)是(涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為 o.1 mL)...( ) A . 2.34 氷 0 B . 2.34 X0 C ? 234 D. 23.4 4?在做分離分解尿素的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)1 06培養(yǎng)基上篩選出大約150個(gè)菌落，而其他同 學(xué)只選擇出大約50個(gè)菌落。A同學(xué)的結(jié)果產(chǎn)生原因( ) ①由于土樣不同②由于培養(yǎng)基污染③由于操作失誤 ④沒(méi)有設(shè)置對(duì)照 A g③ B .噩④ C .(D?? D .(D?? 5 矢 于土壤取樣的敘述錯(cuò)誤的是 0 A ?土壤取樣，應(yīng)選取肥沃、濕潤(rùn)的土壤 B .先鏟去表層土 3cm

9、左右，再取樣 C .取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌 D .應(yīng)在火焰旁稱取土壤 6 下列矢于從土壤中分離細(xì)菌的操作 步驟中，正確的是 ( ①土壤取樣②稱取10g 土壤取出加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中行平板涂布 ④依次 ③吸取0.1 mL進(jìn) 稀釋至 10〔、102、103、1。4、1。5、1。6、107 稀釋度 A ?①7②7③7④ B ?①7③7②7④ C ?①7②7④7③ D ?①7④7②7③ 7.下列矢于測(cè)定土壤中細(xì)菌數(shù)量的敘述，正確的是 A .一般選用103?IO?倍的稀液分別涂布 B ?測(cè)定放線菌的數(shù)量，一般選用 C .測(cè)定真菌的數(shù)量，一般選用 D.當(dāng)?shù)谝?/p>

10、次測(cè)量某種細(xì)菌的數(shù)量， 103、IO 4和105倍稀釋 103、104和IO：倍稀釋 可以將 1?107倍的稀釋液分別涂布到平板上 8.下列矢于微生物的培養(yǎng)敘述錯(cuò)誤的是 A .細(xì)菌一般在30?37C的溫度下培養(yǎng)1?2 d B ?放線菌一般在25?28 C的溫度下培養(yǎng)5?7 d C .霉菌一般在25?28 C的溫度下培養(yǎng)3?4 d D .不同種類的微生物，一般需要相同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間 9.下列操作需要在火焰旁進(jìn)行的一組是 ( ) ①土壤取樣②稱取土壤③稀釋土壤溶液④涂布平板⑤微生物的培養(yǎng) c 10. B .?o)?(5)@? D .②③④ 下列口J以鑒

11、定出分解尿素的細(xì)菌的方法是 A?以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加人酚紅指示劑 B?以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入二苯胺試劑 C?以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入蘇丹川試劑 D ?以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入雙縮腺試劑 11. 土壤取樣時(shí)最好選擇哪種環(huán)境中的土壤做分離細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)A .街道旁 B .花盆中 C ?農(nóng)田中 D .菜園里 二、非選擇題 12. 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目一般用稀釋涂布平板法，當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的 一個(gè) ，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè) 。計(jì)數(shù)時(shí)一般選擇菌落數(shù)在 的平板 計(jì)數(shù)。 13. 在做本課題實(shí)驗(yàn)時(shí)，一位同學(xué)在稀釋倍數(shù)為 106的培養(yǎng)基中涂布了 3個(gè)

12、平板，統(tǒng)計(jì)的 菌落數(shù)分別為21 >212和256，該同學(xué)以這3個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。你認(rèn)為這一結(jié)果 是否接近真實(shí)值？如果需要改進(jìn)，如何改進(jìn)？ 14. 在進(jìn)行操作本課題實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)特別注意： 、 、 。 15. 在做本課題實(shí)驗(yàn)時(shí)，甲同學(xué)篩選出的菌落與其他同學(xué)不同，并且他在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)并沒(méi)有設(shè)置對(duì)照。思考下 列問(wèn)題： (1) 你認(rèn)為出現(xiàn)甲同學(xué)這種結(jié)果的原因可能是什么 ？ (2) 要幫助甲同學(xué)排除可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，需要設(shè)置 ，實(shí)驗(yàn)方案有兩種： 一種方案是可以由其他同學(xué)用與甲同學(xué) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與甲同學(xué)一致，則證 明甲同學(xué) ，如果結(jié)果不同，則證明甲同學(xué)存在操作

13、 或 的配制有問(wèn)題。 另一種方案是將甲同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加 的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照， 證明培養(yǎng)基是否受到 (3) 由此問(wèn)題你得出的啟示是什么 16 ?在105稀釋度下求出3個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值是 63,那么每克樣品中的菌落數(shù)是 多少？ 參考答案： 一、 1 (1)目的菌珠抑制阻止(2)特定抑制 阻止(3)自養(yǎng)能固氮的微生物； 2(1 )有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)。 (2).稀釋度 細(xì)菌 30-300顯微鏡 3.非測(cè)試因素 可信度無(wú)雜菌污染 二、 1 ? 土壤，鏟去表層土。2.培養(yǎng)基多于對(duì)照均數(shù) 3.培養(yǎng) 1 ml 9ml 0.1 mL 4.30-300

14、 三：思考與討論 1統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行 計(jì)算 最好能統(tǒng)計(jì) 3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值， 2這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù) 約為 (單位：株/kg )是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣2185萬(wàn)， 放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。 同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提 此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離， 供選擇培養(yǎng)的條件。 四：典例分析 類型一選擇培養(yǎng)基的配制 1解析：碳源是提供碳元素的物質(zhì)，氮源是提供氮元素的物質(zhì)。所以碳源是葡萄糖，氮源是 尿素。絕大多數(shù)生物都能 利用葡萄糖，但是

15、，只有能合成腺酶的微生物才能分解尿素，所以這種培養(yǎng)基對(duì)微生物有選擇作用。選擇的原則是只 有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(zhǎng)。答案：(1)葡萄糖尿素9)有選擇作用。因?yàn)榇伺浞街心蛩厥俏ㄒ坏?，?此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(zhǎng)。 啟示：選擇培養(yǎng)基篩選微生物的原理：人為提供有利于目的茵株生長(zhǎng)的條件度、pH等)，同時(shí)抑(包括宮養(yǎng)、溫 制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。 2解析：在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少 3個(gè)平板.作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與 準(zhǔn)確性，所以A、B不正確。C項(xiàng)雖涂布了 3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另兩個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在 操作過(guò)程中可能岀現(xiàn)了錯(cuò)誤， 因此，不能簡(jiǎn)單

16、地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值 用來(lái)求平均值。 答案：D 啟示：在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少 3個(gè)平板作為重復(fù)組；在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考 慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn)。 3解析：將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選 擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此， 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基作為對(duì)照。對(duì)照遵循的原則是單一變量，所以與選擇培養(yǎng)基一樣接種、培養(yǎng)。 答案：C 啟示：對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測(cè)試的條件以外， 其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)，其作用是比照實(shí)驗(yàn)組， 排除任何其他可能原因的干擾，證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。 基礎(chǔ)自測(cè) 一、1. C2. A3. B4. A5. C6. C 7. B8. D9. D 10. A11. D 活菌 30 ?300 13.不接近真 實(shí)值，需要重新實(shí)驗(yàn)。 作好標(biāo)記 規(guī)劃時(shí)間 二、12.菌落 14. 無(wú)菌操作 15. (1)可能的原因 有兩種：一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。 (2) 對(duì)照實(shí)驗(yàn)一樣的土樣，無(wú)誤，失誤培養(yǎng)基土樣污染。 (3) 啟示：做實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要設(shè)置對(duì)照。 少年智則國(guó)智，少年富則國(guó)富，少年強(qiáng)則國(guó)強(qiáng)，少年獨(dú)立則國(guó)獨(dú)立，少年自由則國(guó)自由，少 年逬步則國(guó)進(jìn)步，少年勝 于歐洲，則國(guó)勝于歐洲，少年雄于地球，則國(guó)雄于地球。