現(xiàn)代分析技術(shù)與應(yīng)用：第十八章高效液相色譜法

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1、中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University第十八章第十八章 高效液相色譜法高效液相色譜法(High Performance Liqu

2、id Chromatography, HPLC)中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University 一、概述一、概述 二、二、HPLC系統(tǒng)組

3、成系統(tǒng)組成 三、三、HPLC的類型的類型 四、四、HPLC的應(yīng)用的應(yīng)用 五、五、HPLC的發(fā)展的發(fā)展中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen Unive

4、rsity一、高效液相色譜法概述一、高效液相色譜法概述u HPLC是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對樣品的分析。u 20世紀(jì)60年代末70年代初在氣相色譜、經(jīng)典液相基礎(chǔ)上發(fā)展起來，已成為化工、醫(yī)藥、環(huán)保、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的極廣泛的分離分析技術(shù)。 中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitut

5、e of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University一、高效液相色譜法概述一、高效液相色譜法概述u優(yōu)點(diǎn)：與經(jīng)典液相色譜法比較優(yōu)點(diǎn)：與經(jīng)典液相色譜法比較 顆粒極細(xì)（一般為10 m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高 高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快 高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。紫

6、外檢測器最小檢測限可達(dá)109 g，而熒光檢測器最小檢測限可達(dá)1012 g 色譜柱可反復(fù)使用 樣品用量少，過柱后不被破壞，易回收中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun

7、Yat-sen University一、高效液相色譜法概述一、高效液相色譜法概述u優(yōu)點(diǎn)：與氣相色譜法比較優(yōu)點(diǎn)：與氣相色譜法比較 不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣； 可選用各種溶劑作為流動相，對分離的選擇性有很大作用，選擇性高； 一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical

8、 Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University一、高效液相色譜法概述一、高效液相色譜法概述u優(yōu)點(diǎn)：與氣相色譜法比較優(yōu)點(diǎn)：與氣相色譜法比較中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical

9、 Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University一、高效液相色譜法概述一、高效液相色譜法概述u特點(diǎn)特點(diǎn) 壓力高：壓力高：壓力可達(dá)150 300 kg/cm2 柱效高：柱效高：可達(dá)10000塔板每米，分離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果 靈敏度高：靈敏度高：紫外檢測器可達(dá)0.01 ng，熒光、電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1 pg，樣品消耗少（L數(shù)量級） 選擇性高（分辨率高）：選擇性高（分辨率高）：可同時分離100種左右成分 分析速度快：分析速度快：流

10、速0.1 10 mL/min，樣品分析時間短 應(yīng)用范圍廣：應(yīng)用范圍廣：可分析70%以上有機(jī)化合物中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen Univers

11、ity二、高效液相色譜系統(tǒng)組成二、高效液相色譜系統(tǒng)組成色譜工作站色譜工作站中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University高壓輸液系統(tǒng)高壓

12、輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)（色譜柱）分離系統(tǒng)（色譜柱）檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 二、高效液相色譜系統(tǒng)組成二、高效液相色譜系統(tǒng)組成中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Ph

13、armacology, Sun Yat-sen University輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)高壓輸液泵高壓輸液泵中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen Uni

14、versity輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)高壓輸液泵高壓輸液泵l恒流泵：恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵。l多元（多元（2-42-4）泵：）泵：為了克服流量的脈動。有串聯(lián)式和并聯(lián)式l性能：性能：流量精度高且穩(wěn)定，流量范圍寬，能在高壓下連續(xù)工作，液缸容積小，密封性能好，耐腐蝕l注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：防止固體微粒進(jìn)入泵體，流動相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)，防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，不超過規(guī)定的最高壓力，流動相一般應(yīng)該先脫氣中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute

15、 of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣器進(jìn)樣器l自動進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmac

16、ology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣器進(jìn)樣器l進(jìn)樣閥（六通閥）進(jìn)樣閥（六通閥）中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat

17、-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣器進(jìn)樣器l進(jìn)樣閥（六通閥）：進(jìn)樣閥（六通閥）：每次進(jìn)樣的體積都不應(yīng)小于進(jìn)樣器總體積的10%。l自動進(jìn)樣器：自動進(jìn)樣器：清洗、樣品瓶檢查、參數(shù)設(shè)定（進(jìn)樣器針位置、溫度、進(jìn)樣量等）l注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：使用前檢查進(jìn)樣器針筒是否有裂縫及針尖是否是毛口；檢查樣品瓶是否蓋好，不能太緊或太松；排除殘留，用專業(yè)溶劑洗滌至少5次左右

18、；排除樣品瓶、進(jìn)樣器中的氣泡；在使用進(jìn)樣器的同時，用進(jìn)樣器吸滿液體后再排除液體至所需進(jìn)樣的體積。中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen Univers

19、ity分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)色譜柱色譜柱中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)色譜柱色譜柱l由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)

20、）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。是裝填有固定相用以分離混合組分的柱管。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。色譜柱分填充柱和開管柱兩大類。液相色譜通常均采用填充柱。l粒度一般為3、5、7、10 m等，柱效理論值可達(dá)5 16萬/米。一般的分析只需5000塔板數(shù)；同系物分析，只要500即可；較難分離物質(zhì)可采用2萬的柱子，10 30 cm左右柱長能滿足復(fù)雜混合物的分析 l預(yù)柱、分析柱、制備柱預(yù)柱、分析柱、制備柱中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstit

21、ute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測器檢測器l紫外吸收檢測器（紫外吸收檢測器（UVD）l二極管陣列檢測器（PDAD）l熒光檢測器（FLD） l示差折光檢測器（RID） l蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD） l質(zhì)譜檢測器（質(zhì)譜檢測器（MSD）靈敏度（sensitivity）高（檢測限低）

22、噪音（noise）低線性范圍（linear range）寬重復(fù)性（repeatability）好 適用范圍廣（通用型、專屬型）性能要求性能要求中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacolo

23、gy, Sun Yat-sen University液相色譜檢測器液相色譜檢測器CAD電噴霧檢測器（常規(guī)型）電噴霧檢測器（常規(guī)型） VWD、DAD、MWD （常規(guī)型、快速型）（常規(guī)型、快速型） CAD電噴霧檢測器（快速電噴霧檢測器（快速型）型） 電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器 熒光檢測器（常規(guī)型、快速型）熒光檢測器（常規(guī)型、快速型） 質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-

24、sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University紫外檢測器紫外檢測器(ultraviolet detector)(ultraviolet detector)檢測原理：檢測原理：朗伯比爾 (Lambert-Beer) 定律，響應(yīng)信號（吸光度）與濃度成正比A=Cl特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度較高（10-610-9 g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）局

25、限：局限：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長專屬型、濃度型檢測器中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University紫外

26、檢測器紫外檢測器(ultraviolet detector)(ultraviolet detector)固定波長檢測器固定波長檢測器 ：254 nm可變波長檢測器可變波長檢測器：光源為氘燈（和鎢燈）， 200400（800）nm， 單色器，流通池（試樣），光電管；光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似 光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 (photodiode array detector， PDAD) ：一系列光電二極管，一個二極管對應(yīng)接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光；復(fù)光通過流通池，再進(jìn)入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時獲得各波長的信號強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜。獲得三維光譜色譜圖，

27、判斷峰純度。吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量。 中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University紫外檢測器紫外檢測器(ultra

28、violet detector)(ultraviolet detector)中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University熒光檢測器熒光

29、檢測器(fluorescence detector(fluorescence detector，F(xiàn)D)FD)檢測原理：檢測原理：化合物受紫外光激發(fā)后，發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的光，稱為熒光；熒光強(qiáng)度 (F) 與激發(fā)光強(qiáng)度 (I0) 及熒光物質(zhì)濃度 (C) 之間的關(guān)系為： F=2.3QKI0Cl （Q為量子產(chǎn)率，K為熒光效率，為摩爾吸光系數(shù)，l為光徑長度）。F=KC 特點(diǎn)：特點(diǎn)：選擇性好，專屬型檢測器；靈敏度比紫外檢測器高（檢測限10-10 g/ml）激發(fā)波長激發(fā)波長( ex)和發(fā)射波長和發(fā)射波長( em)的選擇：的選擇：激發(fā)波長相對發(fā)射波長能量較高，發(fā)射波長一般較激發(fā)波長要長。固定某一發(fā)射波長，

30、掃激發(fā)光譜，得到一條類似正弦波的圖譜，最大值處為最大激發(fā)波長。通過選定此值作為激發(fā)波長來激發(fā)電子，得發(fā)射圖譜。譜圖中最大值處可用來作為定性和定量分析的依據(jù)。 中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Ph

31、armacology, Sun Yat-sen University熒光檢測器熒光檢測器(fluorescence detector(fluorescence detector，F(xiàn)D)FD)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；選擇性好，能避免不發(fā)熒光成分的干擾；線性范圍較寬；受外界條件的影響較小。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍較窄；易受背景熒光和猝滅效應(yīng)等干擾，如含鹵素離子、重金屬離子、氧分子及硝基化合物等成分時應(yīng)特別注意。應(yīng)用：應(yīng)用：可測定氨基酸、胺類、維生素、甾族化合物及某些代謝藥物等。中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun

32、Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)色譜工作站色譜工作站l輔助色譜儀器采樣、收集色譜檢測器當(dāng)中的電壓信號數(shù)據(jù)分析處理的工作站輔助軟件。l不同公司、不同型號的儀器軟件系統(tǒng)不一：賽默飛世爾色譜工作站（美國）Chromel

33、on、沃特世色譜工作站Empower安捷倫色譜工作站（美國）OpenLabs ChemStationl可更新升級數(shù)據(jù)處理、管理軟件數(shù)據(jù)處理、管理軟件數(shù)據(jù)庫軟件數(shù)據(jù)庫軟件中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinic

34、al Pharmacology, Sun Yat-sen University數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)色譜工作站、色譜工作站、數(shù)據(jù)處理、管理軟件、數(shù)據(jù)庫軟件數(shù)據(jù)處理、管理軟件、數(shù)據(jù)庫軟件l獲得的色譜數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)可靠、安全、完整、可溯源。 l需經(jīng)規(guī)范和系統(tǒng)驗(yàn)證l應(yīng)設(shè)系統(tǒng)管理員和信息安全管理負(fù)責(zé)人。色譜數(shù)據(jù)只允許經(jīng)過授權(quán)的進(jìn)入，并能追蹤和記錄數(shù)據(jù)的創(chuàng)建、修改和刪除l必須定期對色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行完全和準(zhǔn)確的拷貝l審計(jì)跟蹤：保證初始的色譜數(shù)據(jù)不被修改和刪除，發(fā)現(xiàn)和記錄對色譜數(shù)據(jù)的增補(bǔ)、修改、刪除詳細(xì)情況， 并保存這些增補(bǔ)、修改、刪除信息。中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institut

35、e of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University高效液相色譜高效液相色譜高壓泵高壓泵色譜柱色譜柱檢測器檢測器色譜峰色譜峰行為行為測定測定靈敏度靈敏度流動流動相相測定測定穩(wěn)定性穩(wěn)定性樣品樣品處理處理方法

36、方法內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)物物軟件系統(tǒng)軟件系統(tǒng)中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University三、高效液相色譜類型三、高效液相色譜類型根據(jù)色譜柱（分離機(jī)

37、制）分類根據(jù)色譜柱（分離機(jī)制）分類 吸附色譜法（adsorption chromatography） 分配色譜法（partition chromatography） 離子色譜法(ion chromatography)：離子交換色譜法（IEC），抑制型、非抑制型 空間排阻色譜法(size exclusion chromatography)：凝膠色譜法 鍵合相色譜法（bonded-phase chromatography）：反相（反相（reversed reversed phasephase，RPRP）鍵合相色譜法）鍵合相色譜法 親合色譜法（affinity chromatography，AC）

38、手性色譜法（chiral chromatography，CC） 膠束色譜法（micellar chromatography，MC） 電色譜法（electrochromatography，EC） 生物色譜法(biochromatography，BC)中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, S

39、un Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University三、高效液相色譜類型三、高效液相色譜類型色譜柱（固定相）要求色譜柱（固定相）要求顆粒細(xì)且均勻傳質(zhì)快機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)柱溫適當(dāng)相同填料，不同廠家，不同批號，色譜特征可能不同相同填料，不同廠家，不同批號，色譜特征可能不同中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of

40、Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University三、高效液相色譜類型三、高效液相色譜類型鍵合相色譜法鍵合相色譜法以化學(xué)鍵合相（采用鍵合反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相）為固定相的色譜法 硅氧烷型：氯硅烷與硅膠進(jìn)行烷化反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過程中不易流失，使用周期長；柱效高；重現(xiàn)性好；能

41、使用的流動相（可梯度洗脫）和鍵合相的種類多，分離的選擇性高分類分類（根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動相極性的相對強(qiáng)弱）：正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）鍵合相色譜法中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityIn

42、stitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University三、高效液相色譜類型三、高效液相色譜類型鍵合相色譜法鍵合相色譜法鍵合相的種類鍵合相的種類l 非極性鍵合相：非極性鍵合相：非極性烴基，如C18C8C1與苯基等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜；長鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩(wěn)定性更好l 弱極性鍵合相：弱極性鍵合相：醚基和二羥基等鍵合相；用于反相或正相色譜l 極性鍵合相：極性鍵合相：常用氨基氰基鍵合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2CN)鍵合硅膠；一般用于正相色譜 化學(xué)鍵合相要求：小粒度，均勻，球形化學(xué)鍵合相要求：小粒度，均勻

43、，球形中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University三、高效液相色譜類型三、高效液相色譜類型鍵合相色譜法鍵合相色譜法流動相的要求流動相的

44、要求l pH一般應(yīng)在2-8，否則會引起硅膠溶解 (也有適用寬pH范圍的鍵合相) l 與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，化學(xué)穩(wěn)定性好l 對試樣有適宜的溶解度。使k在1 10范圍內(nèi)l 與檢測器相適應(yīng)。如用紫外檢測器，應(yīng)選用截止波長小于檢測波長的溶劑l 純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇乙腈等可以降低柱壓，提高柱效中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute o

45、f Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University三、高效液相色譜類型三、高效液相色譜類型鍵合相色譜法鍵合相色譜法流動相的極性流動相的極性l 正相色譜：溶劑極性參數(shù)P越大，溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng) l 反相色譜：強(qiáng)度因子S越小，洗脫能力越弱流動相的選擇性流動相的選擇性l 不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同 l 必要時可選擇混合溶劑（二元或多元流動相）l 低粘度，流速不宜過快中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 I

46、nstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University三、高效液相色譜類型三、高效液相色譜類型鍵合相色譜法鍵合相色譜法流動相的洗脫流動相的洗脫l等度洗脫：在1個分析周期，流動相的組成不變l梯度

47、洗脫：在1個分析周期，流動相的組成按一定時間程序連續(xù)或階段改變，改變?nèi)軇O性、離子強(qiáng)度、PH值等，使相應(yīng)成分獲得最佳分離中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat

48、-sen University正相鍵合相色譜法 固定相：固定相：極性鍵合相，如氰基（CN）、氨基（NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠） 流動相：流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑，如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑） 適用范圍：適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物，如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì) 機(jī)制：機(jī)制：分配（把有機(jī)鍵合層作為一個液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解），吸附（溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用） 分離選擇性：分離選擇性：極性強(qiáng)的組分k大，后洗脫出柱。流動相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k減小，tR減小。中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所

49、Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 固定相：固定相：非極性鍵合相，如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠 流動相：流動相

50、：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)節(jié)劑。常用甲醇水、乙腈水等。加入0.1% 1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用 應(yīng)用：應(yīng)用：最廣，包括非極性至中等極性的組分（有機(jī)酸、堿及鹽等） 機(jī)制：機(jī)制：溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力。中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen Univers

51、ityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 保留行為（色譜峰）的影響因素保留行為（色譜峰）的影響因素l 溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）：溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）：極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大；引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。l 固定相：固定相：鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質(zhì)的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)

52、的k越大。中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 保留行為的影響因素保留行為的影響因素l 流動相

53、：流動相：極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大溶劑比例溶劑比例：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑；水的比例增加，使k增大加入中性鹽加入中性鹽：中性溶質(zhì)的k增大pHpH：影響弱酸、弱減的離解，流動相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小 離子抑制劑：離子抑制劑：用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動相的pH，抑制有機(jī)弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用，使k變大。適用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱堿 離子對：離子對：把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（counter ion）生成中性離子對，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。 中山大學(xué)臨床藥理

54、研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University反相離子對色譜法反相離子對色譜法離子對機(jī)制離子對機(jī)制33+()+3s3(+固定相固定相+()+B)+B +

55、 H+BHRSO NaRSO + Na+BH RSORSO)BH離子對離子對mB+AB AmA(smBAmmmsmsBAAABABBABEK流動相流動相通式通式中性離子對與非極性固定相作用較強(qiáng)，保留增強(qiáng)，改善分離效果中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen Unive

56、rsityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University離子對的影響因素離子對的影響因素n離子對試劑的種類和濃度：離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的k增大 n流動相的流動相的pHpH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的k值最大。即使試樣組分與離子對試劑全部離子化n固定相：固定相：盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強(qiáng)的非極性鍵合相，同一般RP-HPLCn流動相：流動相：性質(zhì)（有機(jī)溶劑及其濃度）同一般RP-HPLC 反相離子對色譜法反相離子對色譜法中山大學(xué)臨床藥

57、理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University離子對的應(yīng)用與選擇離子對的應(yīng)用與選擇n適用范圍：適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物

58、。n分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：選用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等。n分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：選用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）。反相離子對色譜法反相離子對色譜法離子對試劑所帶的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反離子對試劑所帶的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharm

59、acology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University四、高效液相色譜的應(yīng)用四、高效液相色譜的應(yīng)用環(huán)境污染物分析環(huán)境污染物分析食品分析：食品分析：有毒物質(zhì)、營養(yǎng)成分等有毒物質(zhì)、營養(yǎng)成分等生化分析：生化分析：氨基酸、蛋白質(zhì)等氨基酸、蛋白質(zhì)等醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)：內(nèi)源性物質(zhì)、藥物濃度等內(nèi)源性物質(zhì)、藥物濃度等藥品分析：藥品分析：藥物成分、中藥有效單體等藥物成分、中藥

60、有效單體等新藥研發(fā)：新藥研發(fā)：藥物分離、純化、鑒定、濃度等藥物分離、純化、鑒定、濃度等中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University四、

61、高效液相色譜的應(yīng)用四、高效液相色譜的應(yīng)用定性分析定性分析定量分析定量分析內(nèi)標(biāo)物選擇色譜柱選擇流動相選擇方法學(xué)確證未知樣本的測定 目標(biāo)物質(zhì)目標(biāo)物質(zhì)(結(jié)構(gòu)、分子量、溶解結(jié)構(gòu)、分子量、溶解性、性、pKa、波長、碎片、波長、碎片) 樣本來源樣本來源 濃度水平濃度水平 技術(shù)選擇技術(shù)選擇中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical P

62、harmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University五、高效液相色譜的發(fā)展五、高效液相色譜的發(fā)展HPLC-MS/MSUHPLC-MS/MSUPLC-MS/MSHPLC-Q-TOF 高效液相高效液相在線放射性檢測器系統(tǒng)在線放射性檢測器系統(tǒng) 。中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacolo

63、gy, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University五、高效液相色譜的發(fā)展五、高效液相色譜的發(fā)展 超高效液相色譜技術(shù)超高效液相色譜技術(shù)（ultra performance liquid chromatography，簡稱UPLC） 是一種綜合了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積(死體積)及快速檢測手段等全新的檢測技術(shù)。在全面提升HPLC的速度、靈敏度及分離度的同時，保留其原

64、有的實(shí)用性及原理。 中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityHPLCHPLC的優(yōu)缺點(diǎn)的優(yōu)缺點(diǎn)影響反相鍵合相色譜法分離行為的因素影響

65、反相鍵合相色譜法分離行為的因素思考思考中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)N：定量反映色譜柱的分離效率：定

66、量反映色譜柱的分離效率術(shù)語術(shù)語中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University拖尾因子拖尾因子TT=0.951.05，前延峰，前延峰T 1.05術(shù)語術(shù)語中山大學(xué)臨床藥理研究所中山大學(xué)臨床藥理研究所 Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen UniversityInstitute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen Univer