本科生畢業(yè)論文（設(shè)計） 文獻綜述 題目：王漿主蛋白mrjps提取工藝及

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1、 本 科 生 畢 業(yè) 論 文（設(shè)計） 文獻綜述 題目：王漿主蛋白MRJPs提取工藝及對果蠅的抗衰老 作用研究 姓名與學號：克德爾阿依3080100043 指導(dǎo)教師：沈立榮 專業(yè)班級：食品0802 所在學院：生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 蜂王漿蛋白及其生物學功能的研究進展 摘要：蜂王漿是目前為止所發(fā)現(xiàn)的世上最原始的、最好的天然滋補品之一，而蛋白質(zhì)和肽類很可能是蜂王漿神奇作用的關(guān)鍵物質(zhì)。本文就先介紹了蜂王漿蛋白及其提取和貯存，重點的講述了蜂王漿的生物學功能，

2、蜂王漿蛋白具有清除自由基、抗氧化、延緩衰老、延長壽命抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、促進細胞增殖、抗腫瘤、抗疲勞、降血壓等眾多功能，將被應(yīng)用到生物醫(yī)藥、細胞培養(yǎng)、組織工程等更多的研究領(lǐng)域。 關(guān)鍵詞：蜂王漿蛋白 提取工藝 生物學功能 蜂王漿是5～15 日齡工蜂咽下腺、上顎腺和腦后腺等腺體所分泌的乳白色或淡黃色乳狀液體 ，是1～3 齡工蜂幼蟲、雄蜂幼蟲及蜂王的終生食料[1]。類似于哺乳動物的乳汁，又稱王漿或蜂乳。具有多種生物活性。蜂王漿化學成分復(fù)雜，其成分的含量隨蜜蜂的品種、蜜源種類、生產(chǎn)季節(jié)、氣候條件、蜂群的生存狀態(tài)、哺育蜂的年齡及數(shù)量等多種因素的不同而略有差異[2]。臨床

3、實驗證明[3],蜂王漿具有增強機體免疫力、延緩衰老、防癌抗癌、降血糖、降血壓、抗疲勞等保健功能和療效。蜂王漿也因此在保健品市場中占據(jù)了重要的位置。 蜂王漿的許多功能由其所含的蛋白組分產(chǎn)生，但因為成分復(fù)雜，分離中可能會被損壞，所以還是蜂王漿整體水平上的研究較多。蜂王漿中的蛋白質(zhì)約占干物質(zhì)的50%，2/3為清蛋白，1/3為球蛋白，兩者比例與人體血液中的清蛋白、球蛋白比例大致相似，這種搭配合理、易于吸收。蜂王漿中的蛋白質(zhì)是完全性蛋白質(zhì)，與肉類中的完全性蛋白質(zhì)不同的是，不含中性脂肪，而且不僅含有10中必須氨基酸，還含有12中非必需氨基酸。王漿中的氨基酸與動，植物中的氨基酸相比在質(zhì)方面就明顯差

4、別，王漿幾乎含有中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)形成兩大類神經(jīng)介質(zhì)所需的全部氨基酸[4]。 研究者們根據(jù)蜂王漿蛋白質(zhì)的生物活性及其對保健功能的作用把王漿中所含的蛋白質(zhì)分為水溶性(46%～89%，為王漿蛋白的主要部分，簡稱王漿主蛋白)和水不溶性蛋白質(zhì)，目前已經(jīng)鑒定出9個蜂王漿主要蛋白，簡稱為MRJPs(Major Royal Jelly Proteins)，分子量49~87kDa[3,4]。近年來，在蜂王漿蛋白中含量最豐富的、分子量為56～57kDa的MRJP1(下稱AmMRJPP1)，被認為是與王漿酸同樣重要的王漿質(zhì)量指標和功效成分。 1.蜂王漿蛋白的提取及貯存 1.1 蜂王漿蛋白

5、的提取工藝 蛋白質(zhì)的提取方法很多，如有機溶劑提取法、堿提酸沉法、鹽提酸沉法、 超聲波法、膜分離法、泡沫分離法、雙極膜法等[5]，但目前較低的蛋白質(zhì)提取利用率仍然是增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量的一個制約因素。至今，研究提取蜂王漿蛋白的效果，而且已提供理論依據(jù)的并不多。2008年藍瑞陽[6]等人研究堿提酸沉法和鹽提酸沉法提取蜂王漿蛋白的效果，初步得出，保證蛋白質(zhì)質(zhì)量的前提下，兩種方法均為最佳條件時，采用鹽提酸沉法提取的蛋白質(zhì)產(chǎn)量比堿提酸沉法提取的高，但純度卻低于堿提酸沉法的結(jié)論。 1.2 貯存條件對蜂王漿水溶性蛋白的影響 不同溫度和時間處理的蜂王漿水溶性蛋白含量隨處理溫度升高和處理

6、時間的延長不斷下降。與相比-22℃貯存蜂王漿的水溶性蛋白含量相比較，4℃貯存蜂王漿的水溶性蛋白含量分別降低12.7%（5d），16.9%（10d），20.2%（15d），35℃貯存蜂王漿的水溶性蛋白含量分別降低38.7%（5d），42.3%（10d），57.8%（15d）[7]，充分證明，相同貯存時間內(nèi)，蜂王漿水溶性蛋白含量隨貯存溫度升高而降低；相同溫度條件下，隨貯存時間的延長其含量亦逐漸降低。 蜂王漿水溶性蛋白由分子質(zhì)量為18.4-45.0 kDa等6種常量蛋白組成[8]?，F(xiàn)在劉紅云[7]等人研究又發(fā)現(xiàn)數(shù)量眾多的分子質(zhì)量小于18.4kDa的微量水溶性蛋白，也指出這些蛋白同常量蛋白

7、在4～35℃貯存時都會降解，并隨貯存溫度的升高和貯存時間的延長降解程度增大。但在在其中，低分子質(zhì)量的微量水溶性蛋白對貯存溫度和時間不敏感，這些蛋白質(zhì)對蜂王漿的功效有何貢獻，45.0kDa的蛋白質(zhì)的降解是否為影響蜂王漿功效的主要因素，都值得進一步研究。蛋白質(zhì)和肽類很可能是蜂王漿神奇作用的關(guān)鍵物質(zhì)。由于蜂王漿中的蛋白質(zhì)在干物質(zhì)中占有較大的比重，蜂王漿中的MRJPs被認為是從幼蟲到蜂王的發(fā)育過程及蜂王發(fā)揮特殊生理功能的關(guān)鍵因素，另外，蜂王漿在體外也具有廣泛的生物學活性。世界各國科學家通過直接的方法從蜂王漿中分離獲得一系列的蛋白質(zhì)和肽類，并闡述了相關(guān)的生物學功能。 3. 蜂王漿蛋白主要生物學功能

8、 蛋白質(zhì)和肽類很可能是蜂王漿神奇作用的關(guān)鍵物質(zhì)。蜂王漿中的主蛋白MRJPs被認為是從幼蟲到蜂王的發(fā)育過程及蜂王發(fā)揮特殊生理功能的關(guān)鍵因素，另外，蜂王漿在體外也具有廣泛的生物學活性，。世界各國科學家從蜂王漿中分離獲得一系列的蛋白質(zhì)和肽類，并開始研究相關(guān)的生物學功能。 3.1 清除自由基，抗氧化，延緩衰老 衰老有自由基學說、代謝失調(diào)學說、免疫功能衰退學說、基因錯誤表達學說等，這些學說從不同方面解釋了產(chǎn)生衰老的原因。其中自由基學說比較得到認可。現(xiàn)代研究表明，生物體內(nèi)會生成如超氧陰離子自由基、羥基自由基等活性氧(ROS)，同時也存在一套完整的抗氧化保護系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(S

9、OD)、過氧化氫酶、谷胱甘肽酶(GPX)等，它們能夠隨時清除體內(nèi)多余的ROS，防止過氧化損害。但是，隨著年齡的增長、機體的防護能力會下降，它們不能夠及時的清除體內(nèi)多余的ROS，過剩的自由基會使ROS濃度升高，對蛋白質(zhì)、脂類和DNA等造成隨機損傷，導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)變異、脂質(zhì)過氧化、DNA損傷等，從而引起細胞損傷、細胞活力下降甚至死亡，加速衰老[9]。 王漿蛋白有很好的自由基清除及抗氧化的作用。Takeshi Nagai等[10]發(fā)現(xiàn)蜂王漿的水溶性蛋白和堿溶性蛋白也具有很強的抗氧化及清除氧自由基的能力。通過脂質(zhì)過氧化模型研究蜂蜜、蜂王漿、蜂膠的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)蜂王漿對超氧化物的清除作用介于

10、蜂蜜和蜂膠之間。隨后，通過對蜂王漿進行水提取和堿提取，發(fā)現(xiàn)兩種方法提取的蛋白產(chǎn)物均具有很高的抗氧化活性， 能清除超氧陰離子自由基等活性氧。100mg/mL的蛋白提取物的抗氧化活性與5ml的維生素C相當。后續(xù)實驗中，選用胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解蜂王漿的研究結(jié)果顯示，相比較水提和堿提所得的產(chǎn)物，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性以及清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力更高。 蜂王漿被認為是一種具有延年益壽功能的天然保健品。陳朝陽等[11]等研究表明，蜂王漿能延長果蠅的平均壽命，且呈劑量效應(yīng)，其中高劑量組雄、雌果蠅的平均壽命比對照組長24.7%和26.9%。同時對果蠅超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫

11、酶 (CAT)活力測定結(jié)果表明，蜂王漿能夠提高果蠅的SOD和CAT活性說明蜂王漿具有增強清除自由基的能力，從而達到一定的延緩衰老的效果。而Takeshi Nagai[9]等發(fā)現(xiàn)，除SOD外，蜂王漿的水溶性蛋白和堿溶性蛋白也具有很強的抗氧化及清除氧自由基的能力。此外，日本科學家鐮倉昌樹第一次在除蜜蜂之外的動物模型——果蠅上發(fā)現(xiàn)蜂王漿具有類似于蜜蜂的，同時延長壽命和提高繁殖力雙功能作用。他用含有Royalactin（MRJP1）的飼料飼養(yǎng)果蠅，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Royalactin能增加果蠅個體大小、細胞大小和繁殖能力，延長壽命并縮短發(fā)育時間，這一結(jié)果表明蜂王漿的作用是跨物種的。同時研究出Royalacti

12、n對果蠅壽命延長作用是通過Egfr信號通路發(fā)揮作用，但是具體的發(fā)揮作用的途徑還有待進一步研究[12]。 3.2 促細胞生長功能 蜂群中的工蜂和蜂王都是雌性且基因相同，但蜂王的體長約是工蜂的1.5倍。有研究表明，能成長為蜂王的蜜蜂幼蟲的食物是蜂王漿，而其他幼蟲的食物只是花粉和蜂蜜。但是，蜂王漿中的何種成分促使幼蟲變身蜂王的是個迷，之后日本富山縣立大學講師鐮倉昌樹進一步研究發(fā)現(xiàn)，新鮮蜂王漿中一種叫做"royalactin"的蛋白質(zhì)能促進生長激素的分泌量，使幼蟲出現(xiàn)體格變大、卵巢發(fā)達等蜂王的特征。Kamakura等又進一步研究發(fā)現(xiàn)，royalactin作為蜂王漿中的一種特殊功能因子，

13、是通過Egfr調(diào)節(jié)信號通路，促使蜜蜂幼蟲發(fā)育成為蜂王。Kamakura 等研究了王漿57kDa蛋白的生理學作用, 他們通過對大鼠原代肝實質(zhì)細胞的培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)57kDa蛋白能顯著地促進肝細胞的DNA 合成, 而常用的牛血清卻無此作用。此外, 57kDa蛋白還能增加清蛋白(亦叫白蛋白)的合成, 促進細胞增殖, 提示57kDa蛋白可能起到細胞分裂素的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)MRJPs具有促進細胞生長的功能，Salazar-Olivo等從王漿中提取的粗蛋白(RJCP)能刺激昆蟲Tn-5B1-4細胞生長，每毫克蛋白添加劑能使細胞數(shù)量比對照組多6.5倍，而通常用的胎牛血清卻只有2.55倍。這些粗蛋白與用硫化

14、胺從王漿中沉淀的RJP30和RJP60效果一樣，都能影響細胞的形狀，刺激細胞的粘附。RJP30能夠刺激鼠科動物的3T32F442A 前脂肪細胞轉(zhuǎn)化為成熟脂肪細胞，其效果比胰島素好2倍，粗蛋白和RJP60也有類似效果。RJP30還能對海拉人類子宮癌細胞產(chǎn)生生長抑制作用，用RJP30處理7天后，細胞數(shù)目減少215倍[13]。實驗結(jié)果充分表明了王漿蛋白對于細胞生長作用的多樣性。 3.3 免疫調(diào)節(jié)作用 人們比較早就研究發(fā)現(xiàn)，在清除自由基，抑制過氧化反應(yīng)和免疫調(diào)控的同時，蜂王漿還具有免疫調(diào)節(jié)作用，但不知道到底是哪種組分發(fā)揮了作用，在之后的研究中也發(fā)現(xiàn)MRJP3 的抗過敏作用。Okamoto[14

15、]等從王漿中篩選抗過敏因子，采用一系列柱色譜分析，分離純化了一個70kDa的糖蛋白，即MRJP3。體外實驗表，明MRJP3不僅可抑制T 細胞分泌IL24，而且可抑制T細胞分泌IL22 和IFN2γ，同時抑制T細胞增殖。MRJP3還可抑制卵清蛋白P明礬免疫小鼠的淋巴結(jié)細胞在受到卵清蛋白和抗原提呈細胞刺激后分泌IL24的能力。給卵清蛋白P明礬免疫小鼠腹腔注射MRJP3，雖然它是一種外源性抗原,卻可抑制小鼠血漿IgE 和IgG1的水平。另外，經(jīng)過加熱處理后的MRJP3，抗原性減低了，但在體內(nèi)體外實驗中仍顯示出抑制抗體應(yīng)答的作用。還有，蜂王漿中的MRJP1能誘導(dǎo)巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子，對免疫系統(tǒng)進行

16、調(diào)控[12]。 3.4 抗菌勞作用 Fujiwara 等發(fā)現(xiàn)來源于Apismellifera L蜜蜂的RJ 內(nèi)含一種具有強大抗菌作用的蛋白質(zhì)，命名為Royalisin，并首次通過酸萃取、凝膠過濾和反相高壓液相色譜法將之純化。研究發(fā)現(xiàn)Royalisin在低濃度時即對革蘭陽性細菌具有強大的抗菌活性，但對革蘭陰性細菌無效[15]?？梢酝茰y出Royalisin可能與蜜蜂體內(nèi)防護細菌入侵的機制有關(guān)。Fontana[16]等從蜂王漿中分離了4種抗菌肽，這些抗菌肽屬于同一個蛋白質(zhì)家族Jelleines，并分別命名為Jelleine-I、Jelleine-II、Jelleine-III、Je11ein

17、e-IV。他們通過生物學實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Jelleine-I—II1對酵母、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌有特異性抗菌作用，而Je11eine-IV在所有的試驗中均表現(xiàn)抗菌性。這些抗菌肽與蜜蜂體內(nèi)的其它抗菌肽沒有任何相似之處，它們由工蜂產(chǎn)生并分泌到王漿中，研究還發(fā)現(xiàn)，Jelleine-II C-末端9個氨基酸序列與王漿中MRJP1 C一末端9個氨基酸序列完全一致，猜測Jelleine可能是MRJP1經(jīng)胰蛋白酶作用后的產(chǎn)物。Bachanova 等報道了王漿中一種新的抗菌多肽Royalisin，并發(fā)現(xiàn)Royalisin 對蜜蜂美洲幼蟲腐臭病病原( Paenibacillus larvae larvae)

18、 及其他受試革蘭氏陽性菌有抑制作用[17]。 3.5 抗疲勞作用 蜂王漿具有抗疲勞作用，趙光等[18 ] 發(fā)現(xiàn)灌胃RJ (每100g體重5 mL) 的大鼠與對照組大鼠相比，體重增加20g( P < 0. 01)，跑步運動至力竭的時間延長26. 14min( P < 0. 01) ，力竭運動后，線粒體丙二醛(MDA) 降低明顯，超氧化物歧化酶(SOD) 活性顯著增高，肝臟線粒體ATP合成能力和血漿pH值相應(yīng)提高，血乳酸和血清總鈣較低,肝、肌糖原顯著增多。后來Kamakura[12]等又通過老鼠實驗證明其功能與蜂王漿中的MRJP1有關(guān)。在游泳實驗前分別喂服新鮮蜂王漿、40℃貯存了7天的蜂王

19、漿以及含酪蛋白、玉米淀粉和大豆油的對照溶液，然后比較三組的游泳耐力。結(jié)果顯示，喂服新鮮蜂王漿的小鼠組游泳耐力顯著提高、血清中乳酸和氨含量、肌糖原損耗均顯著降低。再對蜂王漿中的組分進行定量分析，發(fā)現(xiàn)40℃貯存了7天的蜂王漿中MRJP1被降解，而維生素、王漿酸和其他脂肪酸含量均未發(fā)生改變。因此推測，發(fā)揮抗疲勞作用的可能是蜂王漿中的MRJP1。 3.6 抗腫瘤，抗癌作用 蜂王漿對腫瘤細胞的抑制作用早有報道，張敬[19]等（2001）用蜂王漿喂服小鼠30天，再接種小鼠肉瘤180（S180）和艾氏腹水癌（EAC）兩個瘤種，結(jié)果顯示：喂服蜂王漿的小鼠瘤重顯著低于對照組（P<0.05），瘤最

20、高抑制率可達34%。但對蜂王漿中抑制腫瘤細胞的成分未知。也有研究者在2005年發(fā)現(xiàn)王漿能阻礙因腫瘤細胞生長而導(dǎo)致的骨髓抑制，但成分仍然未知，Majtan[20]等（2006）將MRJP1基因重組到大腸桿菌中，表達產(chǎn)物蛋白對小鼠腫瘤細胞的生長有明顯的抑制作用。因此推測MRJP1與抑制腫瘤細胞生長有關(guān)。 Salazar-Olivo等研究發(fā)現(xiàn)，在HeLa癌細胞中加入從蜂王漿中提取出的蛋白RJP培養(yǎng)7d后，細胞數(shù)目比起始細胞數(shù)減少了2.5倍，提示RJP寸人類HeLa癌細胞具有細胞毒性作用[13]。 3.7 降血壓，降血糖 曾經(jīng)也有報道過蜂王漿蛋白具有降血壓的功能，Matsu

21、i[21]等報道，完全蜂王漿和它的分離蛋白根本不會阻礙血管緊縮素I一轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性，然而，蜂王漿經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后，其產(chǎn)物具有抑制血管緊素的作用，從而起到降血壓的作用。采用液相色譜法對王漿水解產(chǎn)物進行分離，獲得二肽、三肽片斷，并發(fā)現(xiàn)了11個ACE的抑制肽，其中有8個肽是首次從自然資源中鑒定出來的。因此，王漿蛋白被認為是一種可通過胃腸酶水解獲取ACE抑制肽的好資源。 經(jīng)放射性免疫分析和體外細胞實驗證明，蜂王漿降血糖的機理是因為其中含有幾種類似胰島素樣的多肽，調(diào)節(jié)胰島素的作用，因此，它們可能是使血糖降低 的有效成分 。另外，蜂王漿蛋白具有修復(fù)受損細胞、促使受

22、損組織再生的功能，能使胰腺細胞代謝恢復(fù)正常，促進胰島素的分泌，而發(fā)揮正常的糖代謝作用[21]。 總之，蜂王漿整體水平功能研究的全面鋪開已有幾十年的歷史，隨著現(xiàn)代化學技術(shù)的應(yīng)用，王漿的營養(yǎng)成分通過化學分析得到認識，世界各國的科學家對蜂王漿活性蛋白和肽的研究在各個領(lǐng)域深入開展，其營養(yǎng)保健功能也經(jīng)過動物和臨床醫(yī)學實驗得到驗證，因此逐漸發(fā)展成為一類全球應(yīng)用的功能食品、營養(yǎng)補充劑、醫(yī)藥或化妝品原料。但如何大量分離、制備蜂王漿活性蛋白和肽仍是一個挑戰(zhàn)性的課題，將蜂王漿活性蛋白和肽用于幫助人類克服疾病的臨床應(yīng)用方面更有很長的路要走。 參考文獻 [1]丁美會，張偉光，金鳳，

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