實(shí)驗(yàn)4、植物組織中過(guò)氧化氫酶的活力測(cè)定.ppt

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實(shí)驗(yàn)七 植物組織中過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定 高錳酸鉀滴定法 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 掌握酶活力測(cè)定的方法2 了解過(guò)氧化氫酶在生物體中的作用原理 二 實(shí)驗(yàn)原理 過(guò)氧化氫酶 CAT 屬于血紅蛋白酶 含有鐵 它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧 在此過(guò)程中起傳遞電子的作用 過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑 R Fe2 H2O2 R Fe3 OH R Fe3 OH 2 H2O2 R Fe2 2 2H2O O2 據(jù)此 可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小 在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量 反應(yīng)過(guò)量 的H2O2溶液 經(jīng)酶促反應(yīng)后 用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液 在酸性條件下 滴定多余的H2O2 即可求出消耗的H2O2的量 5H2O2 2KMnO4 4H2SO4 5O2 2KHSO4 8H2O 2MnSO4 三 材料 試劑與器具 1 材料 小麥葉片2 試劑 1 10 H2SO4 2 0 2mol L磷酸緩沖液pH7 8 3 0 02mol L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液 稱取KMnO4 AR 3 1605g 用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml 用0 1mol L草酸溶液標(biāo)定 4 0 1mol LH2O2 市售30 H2O2大約等于17 6mol L 取30 H2O2溶液5 68ml 稀釋至1000ml 用標(biāo)準(zhǔn)0 1mol KMnO4溶液 在酸性條件下 進(jìn)行標(biāo)定 5 0 1mol L草酸 稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O4 2H2O12 607g 用蒸餾水溶解后 定容至1L 3 器具 1 恒溫水浴 2 研缽 三角瓶50ml 4 酸式滴定管 10ml 容量瓶25ml 1等 四 實(shí)驗(yàn)步驟 1 酶液提取取小麥葉片2 5g加入pH7 8的磷酸緩沖溶液少量 研磨成勻漿 轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中 用該緩沖液沖洗研缽 并將緩沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中 用同一緩沖液定容 4000rpm離心15min 上清液即為過(guò)氧化氫酶的粗提液 2 反應(yīng)取50ml三角瓶4個(gè) 兩個(gè)測(cè)定兩個(gè)對(duì)照 測(cè)定瓶中加入酶液2 5ml 對(duì)照瓶中加入煮死酶液2 5ml 再加入2 5ml0 1mol LH2O2 同時(shí)計(jì)時(shí) 于30 恒溫水浴中保溫10min 立即加入10 H2SO42 5ml 3 滴定用0 02mol LKMn 4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2 至出現(xiàn)粉紅色 在30S內(nèi)不消失 為終點(diǎn) 五 計(jì)算 酶活力用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示酶活 mgH2O2 g min 式中 A 對(duì)照KMnO4滴定毫升數(shù) B 酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù) VT 酶液總量 ml V1 反應(yīng)所用酶液量 ml FW 樣品鮮重 g 1 7 1ml0 1mol L的KMnO4相當(dāng)于1 7mgH2O2 六 研討題 1 影響過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定的因素有哪些 2 過(guò)氧化氫酶與哪些生化過(guò)程有關(guān) 3 過(guò)氧化氫酶的活力測(cè)定還有另外一種方法 即紫外吸收法 原理是H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收 過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫 使反應(yīng)溶液吸光度 A240 隨反應(yīng)時(shí)間而降低 根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活力 請(qǐng)你查閱資料設(shè)計(jì)一個(gè)應(yīng)用該方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活力的實(shí)驗(yàn)