《學(xué)生-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)》PPT課件.ppt

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第二十六章毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),第一節(jié)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求第二節(jié)實(shí)驗(yàn)動物的染毒和處置第三節(jié)優(yōu)良實(shí)驗(yàn)室規(guī)范,2,第一節(jié)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求,目的和意義毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容確定實(shí)驗(yàn)動物及數(shù)量確定劑量或濃度重復(fù)原則隨機(jī)分組原則對照原則倫理原則,3,一、確定實(shí)驗(yàn)動物（一）實(shí)驗(yàn)動物物種的選擇,對實(shí)驗(yàn)動物物種選擇的基本原則是：選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種；經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。,4,（二）實(shí)驗(yàn)動物品系的選擇,品系(strain)是指用計(jì)劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。即具有相似外貌特征，獨(dú)特的生物學(xué)特性以及穩(wěn)定的遺傳性能，共同遺傳來源和一定遺傳結(jié)構(gòu)的動物群體。例如，C57BL/6是近交系動物中的一個(gè)品系，屬低癌組、高補(bǔ)體活性的動物。,5,作為一個(gè)品系應(yīng)具備以下條件：,相似的外貌特征獨(dú)特的生物學(xué)特性穩(wěn)定的遺傳性能具有共同遺傳來源和一定的遺傳結(jié)構(gòu),6,1、實(shí)驗(yàn)動物按遺傳學(xué)控制分類,近交系動物遠(yuǎn)交系動物實(shí)驗(yàn)動物突變系動物雜交群動物,,7,（1）近交系動物(inbredstrain),近交系(inbredstrain)：指至少經(jīng)連續(xù)20代以上全同胞交配或親子交配培育而成，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于20代或以后代數(shù)的一對共同祖先，近交個(gè)體的基因純合程度可達(dá)98.6％以上的遺傳群體。,8,近交系的特征,基因純合性(homozygosity)遺傳穩(wěn)定性(stability)遺傳同源性(isogenicity)表型一致性(uniformity)個(gè)體性(individuality)可分辨性(identification)分布的廣泛性,9,近交系動物的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)組和對照組都只需少量的動物。在某些涉及組織、細(xì)胞或腫瘤移植的實(shí)驗(yàn)中，近交系動物成為必不可少的實(shí)驗(yàn)材料。,10,可能成為生理、胎胚發(fā)育和醫(yī)學(xué)研究的模型。多個(gè)近交系同時(shí)使用，可使不同研究者分析不同遺傳組成對某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的影響，或者觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有普遍意義。,11,（2）突變系動物(mutantstrain),突變系動物是具有特殊突變基因、并伴有各種遺傳缺陷的品系動物。,12,特點(diǎn),突變系動物可以作為人類疾病的動物模型而在生物醫(yī)學(xué)的研究中應(yīng)用。眾多的突變系動物的出現(xiàn)給生物醫(yī)學(xué)研究提供了重要的工具-疾病模型，有不少突變品系動物的疾病與人類疾病極為相似。多為病態(tài)，生活能力較差，對飼養(yǎng)管理要求更為嚴(yán)格，繁殖保種較為困難。,13,（3）封閉群動物（closedcolony）,封閉群動物又稱遠(yuǎn)交系，是指一個(gè)動物種群，在5年以上未從外部引進(jìn)其他任何新血緣品系，是由同一血緣品系進(jìn)行隨機(jī)交配，并在固定場所保存繁殖的動物群。常見者如：NIH小鼠、Wistar大鼠、KM小鼠、青紫藍(lán)兔、新西蘭兔和豚鼠等，均屬這類動物。,14,特點(diǎn)：,一定的雜合性：不引入新的基因，又不使群體內(nèi)基因丟失。相對的穩(wěn)定性：群體在一定范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定的遺傳特征。個(gè)體差異取決于祖代動物。較強(qiáng)的繁殖力、抗病力。群體易保存有模型價(jià)值的突變基因。,15,（4）雜交群動物(hybridstock),雜交群動物又稱異系雜交或系統(tǒng)雜交動物，是兩個(gè)近交品系動物間有計(jì)劃進(jìn)行交配獲得的第一代動物，亦稱雜交一代，簡稱F1代動物。,16,特點(diǎn)：,雜交優(yōu)勢，克服了近交引起的近交衰退遺傳與表型上的均質(zhì)性分布廣泛。不具有育種功能,17,,1、無菌動物（germfreeanimal，GF）：指用現(xiàn)有檢測技術(shù)在動物體內(nèi)外的任何部位均檢不出任何活的微生物和寄生蟲的動物。來源于剖腹產(chǎn)或無菌卵孵化，飼養(yǎng)于隔離系統(tǒng)中。,（三）實(shí)驗(yàn)動物等級的選擇等級是指實(shí)驗(yàn)動物的微生物標(biāo)準(zhǔn)化程度。,18,無菌動物的特點(diǎn),形態(tài)學(xué)改變：消化系統(tǒng):盲腸膨大，腸壁菲薄，易發(fā)生盲腸扭轉(zhuǎn)，導(dǎo)致破裂。循環(huán)系統(tǒng)：心臟變小。免疫系統(tǒng)：胸腺上皮細(xì)胞變大，胞漿泡狀結(jié)構(gòu)和溶酶體變小。,19,生理學(xué)改變,免疫功能：免疫應(yīng)答慢，過敏反應(yīng)、對異體移植物的排斥反應(yīng)以及自身免疫現(xiàn)象消失或減弱。生長率：豚鼠、兔生長率降低，大、小鼠改變不大。代謝：水分代謝周期延長，腸管對水的吸收率低。營養(yǎng)：體內(nèi)不能合成VitB、VitK?？馆椛淠芰Γ涸鰪?qiáng)。壽命：長于普通動物。,20,2、悉生動物(gnotobioticanimalGN),悉生動物：或稱已知菌動物，廣義上把無菌動物、已知菌動物、無特定病原體動物統(tǒng)稱悉生動物；狹義上指已知菌動物。,21,悉生動物的特點(diǎn),GN動物是動物與微生物的共生復(fù)合體。腸道存在能合成維生素和氨基酸的細(xì)菌，不會出現(xiàn)維生素缺乏癥。生活力、抵抗力明顯增強(qiáng)，易于飼養(yǎng)。,22,3、無特定病原體動物(SPF):,指動物體內(nèi)無特定的微生物、寄生蟲存在，但帶有非特定的微生物、寄生蟲的動物。主要指不攜帶潛在感染、條件致病和對實(shí)驗(yàn)干擾大的病原。來源于剖腹產(chǎn)動物。小鼠病原菌應(yīng)排除16種，病毒11種；大鼠病原菌應(yīng)排除16種，病毒7種。,23,4、清潔動物(Cleananimal),除普通動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶對動物危害大和對科學(xué)研究干擾大的病原。來源于SPF動物或剖腹產(chǎn)動物。血清病毒抗體檢測可檢測出一定滴度的抗體，病理切片應(yīng)無病變。小鼠病原菌應(yīng)排除10種，病毒5種；大鼠病原菌應(yīng)排除10種，病毒2種。,24,5、普通動物(conventionalanimalCV),定義：不攜帶人獸共患病病原和動物烈性傳染病病原的實(shí)驗(yàn)動物。特點(diǎn)：微生物控制要求最低。生理學(xué)特性：健康的外貌，正常的飲食，眼角、鼻腔無分泌物附著，尸檢無眼觀病灶。,25,,（四）個(gè)體的選擇年齡和體重性別生理狀態(tài)和健康狀況,26,（五）確定實(shí)驗(yàn)動物的數(shù)量,實(shí)驗(yàn)動物還需要有一定的數(shù)量，例數(shù)不能太少，也不宜過多。大樣本的代表性優(yōu)于小樣本，但樣本過大會加大工作量，而且成本也相應(yīng)提高。長期實(shí)驗(yàn)還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)動物因疾病或操作不當(dāng)?shù)仍蛞鸬膭游飻?shù)量減少，應(yīng)適當(dāng)增加每組的動物數(shù)。一般來講，每組小鼠和大鼠數(shù)一般不少于10只，犬一般不少于6只。,27,二、確定劑量或濃度,不同實(shí)驗(yàn)方法、不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、不同動物?shí)驗(yàn)所需化學(xué)物劑量不同。毒理學(xué)研究所應(yīng)用的劑量應(yīng)產(chǎn)生下列作用：至少有一個(gè)劑量產(chǎn)生明顯的毒作用甚至可能發(fā)生死亡；至少有另一劑量產(chǎn)生輕度的毒性而不發(fā)生死亡；至少還有一個(gè)劑量不產(chǎn)生可觀察到的毒作用。對照組的動物可做相同的處理，但不給受試物。應(yīng)盡量確定不良反應(yīng)的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系（如不良反應(yīng)的發(fā)生和持續(xù)時(shí)間）.至少應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組。低劑量應(yīng)相當(dāng)于主要毒效學(xué)的有效劑量，高劑量以不產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)為限。,28,三、重復(fù)（replication）原則任何毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)必須用多于一個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)單位，如實(shí)驗(yàn)單位可為一個(gè)動物、一窩子代等。由于實(shí)驗(yàn)單位存在一定變異，可引起實(shí)驗(yàn)效應(yīng)的誤差，因此只有達(dá)到或滿足一定數(shù)量的實(shí)驗(yàn)單位才可提供更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)效應(yīng)。,29,四、隨機(jī)化（randomization）原則分組隨機(jī)化是指用隨機(jī)數(shù)字或其他隨機(jī)化的電腦程序?qū)⑦x定的實(shí)驗(yàn)單位進(jìn)行隨機(jī)分組或隨機(jī)抽樣。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的隨機(jī)化就是將實(shí)驗(yàn)單位進(jìn)行隨機(jī)分組。例如，將一批受試者按等概率分為A和B兩組，可以用隨機(jī)數(shù)字的奇偶決定每個(gè)受試者的組別。,30,,隨機(jī)化的目的是：使各處理組的實(shí)驗(yàn)單位具有相同的特征，避免實(shí)驗(yàn)者因主觀和客觀因素產(chǎn)生的偏移對分組結(jié)果的影響，減少系統(tǒng)誤差。隨機(jī)化是保證組間實(shí)驗(yàn)對象具有可比性，避免數(shù)據(jù)結(jié)果的偏性的有效手段。,31,五、對照（control）原則有比較才有鑒別，設(shè)置對照的目的就是在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，驗(yàn)證新的處理效應(yīng)與已知或公認(rèn)的結(jié)果有無差異?；蛘哒f設(shè)立對照可以使處理因素和非處理因素的差別有一個(gè)科學(xué)的對比，從而消除非處理因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，把處理因素的效應(yīng)充分顯示出來。設(shè)立對照是抵消各種非處理因素造成誤差的基本措施。,32,毒理學(xué)中常用的對照形式1.空白對照指不給予任何干預(yù)因素的對照組，即對照組的處理因素為“空白”。2.陽性對照采用已知陽性物質(zhì)做對照。作為陽性對照的物質(zhì)的效應(yīng)必須是肯定或?qū)W術(shù)界公認(rèn)的。受試化合物與陽性對照比較應(yīng)在相同條件下進(jìn)行，如溶劑劑量、給藥方法和采樣時(shí)間等。設(shè)置陽性對照組的主要目的是檢測實(shí)驗(yàn)體系的有效性。,33,3.陰性對照不給要研究的處理因素,但給以其他的實(shí)驗(yàn)因素,以排除這些實(shí)驗(yàn)因素的影響。常用的陰性對照是溶劑/賦形劑對照,以此作為與染毒組比較的基礎(chǔ)。陰性對照除了要研究的因素外,其他處理應(yīng)和實(shí)驗(yàn)組完全相同。,34,4.自身對照同一研究對象自身處理前后互為對照。采用這種對照時(shí),要求研究因素處理前后的實(shí)驗(yàn)條件必須一致,觀察指標(biāo)應(yīng)是穩(wěn)定的。5.歷史對照同一實(shí)驗(yàn)室過去多次實(shí)驗(yàn)的對照組數(shù)據(jù)組成的歷史對照可用于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的控制和保證。過去的研究資料可用于研究結(jié)果的比較,但需注意資料的可比性。,35,（一）動物福利法的起源1822年，人道的迪克馬丁提出的禁止虐待動物的議案——“馬丁法令”獲得了通過。這是首次以法律條文的形式規(guī)定了動物的利益，保護(hù)動物免受虐待，是動物保護(hù)史上的一座里程碑。人們對待動物的態(tài)度從此開始了微妙的變化。,六、動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的倫理原則,36,現(xiàn)在，動物福利制度已在世界范圍內(nèi)迅速發(fā)展起來。英國現(xiàn)行的動物保護(hù)法是1911年通過的，目前英國正在修改這部法律。除了1911年通過的動物保護(hù)法之外，英國還陸續(xù)出臺了很多專項(xiàng)法律，比如野生動物保護(hù)法、動物園動物保護(hù)法、實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)法、狗的繁殖法案、家畜運(yùn)輸法案等。自1980年以來，歐盟及美國、加拿大、澳大利亞等國先后都進(jìn)行了動物福利方面的立法。動物福利組織也在世界范圍內(nèi)蓬勃發(fā)展起來，WTO的規(guī)則中也寫入了動物福利條款。,37,根據(jù)各國現(xiàn)有的動物福利法的歷史及淵源的考察，滿足動物的需求是動物福利法的首要原則。動物的需求主要表現(xiàn)在以下三個(gè)方面：維持生命需要，維持健康需要及維持舒適需要。,（二）動物福利的立法宗旨和福利標(biāo)準(zhǔn),38,解除動物痛苦，讓動物在任何條件下享有如下五大自由是動物福利法的基本原則：1.享有不受饑渴的自由；2.享有生活舒適的自由；3.享有不受痛苦傷害和疾病的自由；4.享有生活無恐懼和悲傷感的自由；5.享有表達(dá)天性的自由。這也是目前國際動物福利一致認(rèn)同的五大標(biāo)準(zhǔn)。只有當(dāng)上述動物需求得到滿足時(shí)，動物才能身心愉悅，享受大自然賦予的生命的樂趣。,39,（三）我國實(shí)驗(yàn)動物福利立法的有關(guān)問題,我國現(xiàn)行的有關(guān)動物保護(hù)的法律為數(shù)不多，動物保護(hù)的范圍也過于狹隘，欠缺了哪一方面都不算完整的動物保護(hù)。除《野生動物保護(hù)法》、《動物檢疫法》等幾部單行法外，余者只散見于《森林法》、《漁業(yè)法》、《海洋環(huán)境保護(hù)法》等若干零散條文中，沒有一部專門的、完整的動物保護(hù)的總括性法律。因而，人們對于如何保護(hù)動物，以及保護(hù)動物的意義都缺乏整體的清晰印象。對實(shí)驗(yàn)動物來說，明確其法律地位是解決福利問題先決條件。,40,關(guān)于發(fā)布《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的通知國科發(fā)財(cái)字〔2006〕398號為了適應(yīng)科技發(fā)展的需要，貫徹落實(shí)《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》（中華人民共和國國家科學(xué)技術(shù)委員會令第2號，1988），進(jìn)一步加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動物管理工作，我們在深入研究和廣泛征求意見的基礎(chǔ)上，制定了《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》，現(xiàn)予印發(fā)，請認(rèn)真貫徹落實(shí)。科學(xué)技術(shù)部二ＯＯ六年九月三十日,41,（四）動物實(shí)驗(yàn)的“3R”原則動物實(shí)驗(yàn)替代方法的研究是在科學(xué)研究領(lǐng)域，采用科學(xué)的方法研究動物福利，在符合科學(xué)目的前提下通過采用更為合理的手段，充分體現(xiàn)動物福利的科學(xué)實(shí)踐活動。而3R研究的最終目的則是為生命科學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的研究提供有效的研究手段，使科學(xué)研究方法更加科學(xué)化，試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。,42,3R的概念及內(nèi)涵,3R是Reduction、Replacement和Refinement的簡稱。（1）Reduction（減少）是指在科學(xué)研究中，使用較少量的動物獲取同樣多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)或使用一定數(shù)量的動物能獲得更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的科學(xué)方法。對一個(gè)實(shí)驗(yàn)來講，用動物越多，則成本就會隨之提高。因此，動物的使用量應(yīng)是能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡淖钚∮昧?。絕不能以節(jié)省時(shí)間或?yàn)榱巳藛T的方便以及其他不科學(xué)的原因?yàn)槔碛?，使用超過能獲取有意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所需要的最少動物數(shù)量。,43,(2)Replacement（替代）是指使用其它方法而不用動物所進(jìn)行的試驗(yàn)或其他研究課題，達(dá)到某一試驗(yàn)?zāi)康?。或者說是使用沒有知覺的試驗(yàn)材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎動物進(jìn)行試驗(yàn)的一種科學(xué)方法。,44,替代有不同的分類方法：,①根據(jù)是否使用動物或動物組織，替代方法可分為相對性替代和絕對性替代兩個(gè)方面，前者是指采用人道的方法處死動物或使用細(xì)胞、組織及器官進(jìn)行體外試驗(yàn)研究，或利用低等動物替代高等動物的實(shí)驗(yàn)方法；后者則是在實(shí)驗(yàn)中完全不用動物；②按照替代物的不同，可分為直接替代（如志愿者或人類的組織等）和間接替代；③根據(jù)替代的程度，又可分為部分替代（利用其他替代實(shí)驗(yàn)手段來代替動物實(shí)驗(yàn)中的一部分或某一步驟）和全部替代（用新的替代方法取代原有的動物實(shí)驗(yàn)方法）。,45,指在符合科學(xué)原則的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)條件，善待動物，提高動物福利；或完善實(shí)驗(yàn)程序和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，避免或減輕給動物造成的與實(shí)驗(yàn)?zāi)康臒o關(guān)的疼痛和緊張不安的科學(xué)方法。優(yōu)化包括諸多內(nèi)容，總體說來是一個(gè)科學(xué)化、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的過程，包括實(shí)驗(yàn)動物和動物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面。研究內(nèi)容涉及到試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、仁慈終點(diǎn)、人員的培訓(xùn)、飼養(yǎng)環(huán)境及設(shè)施、動物運(yùn)輸、動物自然習(xí)性等方面，其中動物實(shí)驗(yàn)程序的優(yōu)化是一項(xiàng)主要內(nèi)容。,(3)Refinement（優(yōu)化）,46,3R研究的意義（1）作為提升突破技術(shù)壁壘能力的載體和具體體現(xiàn)“標(biāo)尺”，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國際貿(mào)易中發(fā)揮不可替代的重要作用。,47,（2）為科學(xué)發(fā)展提供了新思路和新方法縱觀3R概念的提出和發(fā)展，可以說它一方面是為了適應(yīng)動物保護(hù)主義運(yùn)動、緩和動物保護(hù)與動物試驗(yàn)之間日益尖銳的矛盾沖突的一種需要。另一方面，從3R研究成果的應(yīng)用來看，確實(shí)對科學(xué)的發(fā)展起到了很大的推動作用。因此說，3R研究也是科學(xué)發(fā)展的需要。,48,（3）開展“3R”研究，從保護(hù)動物，或是關(guān)注動物福利，這也是時(shí)代發(fā)展、社會進(jìn)步在科學(xué)技術(shù)上的一種體現(xiàn)。,