【基金標(biāo)書】2010CB529700-炎癥過程中細(xì)胞間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其應(yīng)用研究

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項(xiàng)目名稱： 炎癥過程中細(xì)胞間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其應(yīng)用研究首席科學(xué)家： 耿建國 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 中國科學(xué)院 上海市科委一、研究內(nèi)容本項(xiàng)目將針對(duì)炎癥過程中細(xì)胞的識(shí)別、黏附、極性形成、遷移和效應(yīng)等細(xì)胞間相互作用的不同步驟，分 別有側(cè)重的展開深入研究，發(fā)現(xiàn)新的信號(hào)調(diào)控分子和揭示新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并 進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的整個(gè)過程進(jìn)行綜合分析和整體把握，加深我們對(duì) 炎癥反應(yīng)過程本質(zhì)的系統(tǒng)認(rèn)知。主要研究內(nèi)容包括以下幾方面：1．揭示調(diào)控炎癥細(xì)胞識(shí)別炎癥信號(hào)與其它細(xì)胞或胞外基質(zhì)發(fā)生黏附，形成極性并響應(yīng)炎癥信號(hào)發(fā)生遷移，以及最終發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制：從分子生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等角度，利用基因 轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、生物化學(xué)分析和細(xì)胞活性檢測(cè)等方面的現(xiàn)代生物學(xué)研究手段，深入探討TLR 等膜受體、整合素等細(xì)胞黏附分子、 Par 復(fù)合物等 細(xì)胞極性分子、Src 激酶等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)分子、NF- ?B 等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等表觀遺傳調(diào)控蛋白、IL-1?等細(xì)胞因子、MMP 等基質(zhì)蛋白酶類以及 SAP 等細(xì)胞分泌蛋白等，對(duì)炎癥過程中細(xì)胞的識(shí)別、黏附、極性形成、遷移和效應(yīng)等細(xì)胞間相互作用進(jìn)行精確調(diào)控的分子機(jī)制和關(guān)鍵因子。2. 解析炎癥過程中細(xì)胞間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在炎癥相關(guān)重大疾病發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能：利用基因工程小鼠技術(shù)和小動(dòng)物炎癥模型，建立與發(fā)展基于炎癥中細(xì)胞間相互作用的重大疾病研究模型與系統(tǒng)，深入研究上述發(fā)現(xiàn)的新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、調(diào)節(jié)分子和信號(hào)途徑間的交互作用與惡性腫瘤、心腦血管疾病、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和全身炎癥反應(yīng)綜合征等重大疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及可能存在的致病機(jī)理。結(jié)合本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)中來自醫(yī)科大學(xué)的成員所擁有的臨床資源，在病人樣品和實(shí)例中確認(rèn)所發(fā)現(xiàn)的炎癥調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，對(duì)若干重大疾病的機(jī)理提出重要見解，并提供潛在的診治靶點(diǎn)。3. 發(fā)現(xiàn)新的抗炎藥物作用靶點(diǎn)，利用相應(yīng)的藥靶篩選系統(tǒng)進(jìn)行主要基于小分子化合物規(guī)?；Y選的抗炎藥物研發(fā)：爭(zhēng)取發(fā)現(xiàn)針對(duì)炎癥相關(guān)重大疾病的新的抗炎藥物作用靶點(diǎn)，并建立有效的篩選系統(tǒng)，利用商 業(yè)化合物庫和已建立的小分子化合物庫，進(jìn)行針對(duì)候選靶點(diǎn)的小分子化合物活性篩選。根據(jù)活性化合物的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)多樣性的合成，通過數(shù)輪的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和全面的構(gòu)效關(guān)系分析，獲得先導(dǎo)化合物。根據(jù)構(gòu)效關(guān)系， 對(duì)活性化合物 進(jìn)行選擇性的分子標(biāo)記（如生物素標(biāo)記和熒光標(biāo)記等），用作生物學(xué)研究的工具分子。同時(shí)積極開展活性先導(dǎo)化合物的體內(nèi)抗炎活性評(píng)價(jià)。4. 建立和完善炎癥研究領(lǐng)域的技術(shù)和生物學(xué)分析體系：在以上系統(tǒng)深入的研究過程中，依靠科技進(jìn)步和技術(shù)創(chuàng)新，不斷完善炎癥中細(xì)胞間相互作用的研究技術(shù)和策略，建立更高效更合理的炎癥領(lǐng)域研究系統(tǒng)和分析體系。二、預(yù)期目標(biāo)（一）總體目標(biāo)本項(xiàng)目將圍繞炎癥及其相關(guān)重大疾病中細(xì)胞的識(shí)別、黏附、極性形成、遷移和效應(yīng)等方面，系統(tǒng)研究炎癥 過程中的細(xì)胞間相互作用，闡釋炎癥細(xì)胞及其所處環(huán)境間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和調(diào)控規(guī)律，探討炎癥細(xì)胞參與重大疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)，鑒定一系列調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，為炎癥相關(guān)疾病的診治提供具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的策略和手段。通過本項(xiàng)目的實(shí)施，獲得一系列國際領(lǐng)先的研究成果，打造一支達(dá)到國際先進(jìn)水平的炎癥研究隊(duì)伍，使我國的炎癥相關(guān)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究躋身于國際先進(jìn)行列。（二）五年預(yù)期目標(biāo)1. 在基礎(chǔ)理論研究方面：（1（ 從分子、細(xì)胞到動(dòng)物整體水平，發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)多種調(diào)控炎癥過程中細(xì)胞間相互作用的新的關(guān)鍵調(diào)控因子和信號(hào)途徑，闡明這些新的分子調(diào)控機(jī)理在炎癥細(xì)胞的識(shí)別、黏附、極性形成、遷移和效應(yīng)等過程中的生理功能。（2（ 解析上述調(diào)控炎癥過程中細(xì)胞間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在惡性腫瘤、心腦血管疾病、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和全身炎癥反應(yīng)綜合征等重大疾病發(fā)生發(fā)展中的分子病理學(xué)機(jī)制。（3（ 建立和完善炎癥研究領(lǐng)域的技術(shù)和生物學(xué)分析體系，形成 1－2 種新技術(shù)方法和本領(lǐng)域的前沿性研究體系。2. 在應(yīng)用基礎(chǔ)研究方面：通過發(fā)現(xiàn)和揭示與重大疾病相關(guān)的調(diào)控炎癥細(xì)胞間相互作用的新分子、新功能和新機(jī)制，確定有效的抗炎新通路或新靶標(biāo)，建立快速可靠的活性化合物篩選模型。通過通量篩選、合理藥物設(shè)計(jì)、多 樣性合成、和結(jié)構(gòu)優(yōu)化，獲得 10 個(gè)以上有效的抗炎活性先導(dǎo)化合物，完成較全面的構(gòu)效關(guān)系研究，并期望獲得 2 個(gè)以上具有顯著抗炎效果的藥物候選化合物。3. 成果考核指標(biāo)：努力在國際相關(guān)研究領(lǐng)域做出具有重要影響的工作，在國際一流雜志（IF>10）發(fā)表 10 篇以上論文，在有影響力的雜志（IF>5）上發(fā)表 50 篇以上論文，申請(qǐng) 10 項(xiàng)以上相關(guān)專利。4. 人才培養(yǎng)：培養(yǎng)博士研究生 50－80 人，國家杰出青年等高級(jí)人才 1－3 名。三、研究方案（一）總體研究思路炎癥反應(yīng)的發(fā)生從本質(zhì)上講就是各種炎癥細(xì)胞在致炎/抗炎因子等作用下，通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制發(fā)生相互作用的過程，包括了從炎癥細(xì)胞識(shí)別炎癥信號(hào)與其它細(xì)胞或胞外基質(zhì)發(fā)生黏附，到炎癥細(xì)胞形成極性并響應(yīng)炎癥信號(hào)發(fā)生遷移，以及最終炎癥細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的整個(gè)過程，既有明確的階段和步驟，又是相互間在時(shí)空上密切聯(lián)系、有機(jī)統(tǒng)一的完整過程。整個(gè)過程可分為細(xì)胞的識(shí)別、黏附、極性形成、遷移和效應(yīng)等不同步驟，而其中每一步驟都受到精細(xì)的信號(hào)調(diào)控，各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。本項(xiàng)目將針對(duì)上述炎癥過程中細(xì)胞間相互作用的每一步驟分設(shè)課題，分別展開深入的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究，以期能在整個(gè)項(xiàng)目層面上對(duì)整個(gè)炎癥反應(yīng)過程有一個(gè)系統(tǒng)綜合的認(rèn)知。只有在對(duì)炎癥過程中調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行充分認(rèn)知的基礎(chǔ)上，才能深入了解細(xì)胞生命活動(dòng)在炎癥相關(guān)重大疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，有效確定治療炎癥的藥物作用靶點(diǎn)，并 進(jìn)行相應(yīng)的藥物篩選和開發(fā)，為炎癥及其相關(guān)重大疾病的診療提供新的策略和手段，提高人民群眾健康生活質(zhì)量。（二）技術(shù)路線本項(xiàng)目將針對(duì)炎癥過程中細(xì)胞的識(shí)別、黏附、極性形成、遷移和效應(yīng)等細(xì)胞間相互作用的不同步驟，分 別有側(cè)重的展開集中深入的研究，設(shè)置了相應(yīng)的六個(gè)研究課題，包括：1、炎癥過程中細(xì)胞識(shí)別的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 機(jī)制；2、炎癥 過程中細(xì)胞黏附的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；3、炎癥 過程中細(xì)胞極性形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；4、炎癥過程中細(xì)胞遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；5、炎癥過程中細(xì)胞效應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；6、抗炎活性化合物篩選及優(yōu)化。以下根據(jù)各個(gè)課題的具體情況分別進(jìn)行介紹：總體技術(shù)途徑示意圖（三）可行性1. 本研究項(xiàng)目的總體研究方案切實(shí)可行從學(xué)術(shù)思路上看，本項(xiàng)目以炎癥中細(xì)胞間相互作用為主線，以細(xì)胞間發(fā)生相互作用基本過程中調(diào)控各個(gè)步驟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制為對(duì)象，并在前述基礎(chǔ)研究的引導(dǎo)下進(jìn)行抗炎藥物的研發(fā)。 六個(gè)研究方向彼此間時(shí)空有序、相互補(bǔ)充、有機(jī) 結(jié)合，綜合研究了炎癥過程中 細(xì)胞間相互作用的各個(gè)層面，密切合作、互 為指導(dǎo)，避免了單獨(dú)某個(gè)方向或?qū)用嫜芯康木窒扌?，為?shí)質(zhì)性推進(jìn)炎癥及其相關(guān)重大疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。從技術(shù)途徑上看，本項(xiàng)目是在已有工作基礎(chǔ)上的拓展和深入，研究內(nèi)容是在各參與研究組工作基礎(chǔ)上提出的具有原創(chuàng)性的內(nèi)容，前期的工作都已取得了國際水平的進(jìn)展，具有扎實(shí) 的工作基礎(chǔ)。相關(guān)的 實(shí)驗(yàn) 方案合理可行， 實(shí)驗(yàn)方法成熟，必需的實(shí)驗(yàn)技術(shù)也已掌握，在技術(shù)上是完全可行的。各學(xué)術(shù)骨干均有獨(dú)特的技術(shù)專長，涵蓋生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、藥學(xué)、有機(jī)化學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等學(xué)科，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ) ，便于 聯(lián)合攻關(guān)。六個(gè)具體研究課題的技術(shù)途徑和路線清晰明確，切實(shí)可行。2. 本研究項(xiàng)目凝聚了優(yōu)秀的研究團(tuán)隊(duì)本項(xiàng)目有高級(jí)職稱人員 26 名，其他研究技術(shù)人員 41 名，平均年齡約為 35歲。研究 隊(duì)伍包括“國家杰出青年基金”獲得者 5 名、中科院“百人計(jì)劃” 入選者 8名。本項(xiàng) 目凝聚的優(yōu)秀研究 團(tuán)隊(duì)，確保了本 項(xiàng)目切實(shí) 可行。研究團(tuán)隊(duì)成員已經(jīng)承擔(dān)過多項(xiàng)本研究項(xiàng)目相關(guān)項(xiàng)目，其中包括國家重大科學(xué)研究計(jì)劃（首席科學(xué)家 2 名）、科技部“973”項(xiàng)目（首席科學(xué)家 1 名、課題負(fù)責(zé)人3 名）、科技部“863”項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、國家杰出青年基金等，具有相關(guān)國家級(jí)重大/重點(diǎn)項(xiàng)目順利實(shí)施的豐富經(jīng)驗(yàn)。3. 扎實(shí)的工作基礎(chǔ)確保了本研究項(xiàng)目順利實(shí)施本研究團(tuán)隊(duì)在炎癥領(lǐng)域基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面有非常扎實(shí)的研究基礎(chǔ)，近 5 年來， 項(xiàng)目組成員已經(jīng) 作為通訊作者/第一作者 在《Cell》、 《Nature》和《Science》及其子刊上發(fā)表 論文 7 篇，影響因子大于 10 分的共有 14 篇，影響因子大于 5 分的共有 49 篇。此外 還有大量藥物化學(xué)和應(yīng)用研究方面的成果。4. 良好的工作條件和環(huán)境為本研究項(xiàng)目順利完成提供了保障本項(xiàng)目依托、承擔(dān)和參加研究單位（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、南方醫(yī)科大學(xué)、中國人民解放軍 第二軍醫(yī)大學(xué)、中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)等）都屬于國內(nèi)一流的科研院校，有很強(qiáng)的綜合科研實(shí)力。并且大部分科研骨干都依托于多個(gè)國家級(jí)和省部級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，包括醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生命有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院分子細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院再生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院營養(yǎng)與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和重大疾病的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。這些國內(nèi)一流的科研院校及所依托的國家級(jí)和省部級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為本項(xiàng)目大開展提供了良好的工作環(huán)境和條件。本項(xiàng)目依托、承擔(dān)和參加研究單位裝備了開展生物化學(xué)、分子生物學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、 藥學(xué)、有機(jī)化學(xué)、免疫學(xué)、基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科方面研究的儀器設(shè)備，如共聚焦顯微鏡、 實(shí)時(shí)熒 光定量 PCR 儀、HPLC 儀器、ProteomoX 質(zhì)譜、核磁共振 儀、 紅外光譜儀、元素分析儀、X－衍射儀、旋光儀、氣相色譜儀、毛細(xì)管電泳儀、計(jì)算機(jī)工作站、流式 細(xì)胞分析和分 選儀、BIAcore、透射電子顯微鏡、活細(xì)胞工作站、Affymetrix 基因芯片平臺(tái)、原子力顯微鏡、共聚焦顯微鏡、 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀、HPLC 儀器、4800 MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜、SPR陣列檢測(cè)儀、透射電子顯微 鏡、活 細(xì)胞工作站等先進(jìn) 的大型專業(yè)儀器設(shè)備。建立了成熟的實(shí)驗(yàn)方法，包括免疫 熒光組織化學(xué)技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡術(shù)、包埋前 /后免疫電鏡技術(shù)、活細(xì)胞成像技術(shù)、流式 細(xì)胞分析技 術(shù)、分子原位 雜交技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀技 術(shù)、 動(dòng)物模型制備、蛋白 質(zhì)肽譜分析、全基因組掃描和連鎖分析、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制 備和基因敲除技術(shù)、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)等。 這些條件都確保了本項(xiàng)目在儀器設(shè)備和技術(shù)方法的需求方面切實(shí)可行。（四）創(chuàng)新點(diǎn)與特色本項(xiàng)目是在項(xiàng)目組成員已取得的扎實(shí)的炎癥領(lǐng)域科研成果基礎(chǔ)上，以炎癥中細(xì)胞間相互作用為主線，以 細(xì)胞間發(fā)生相互作用基本過程中調(diào)控各個(gè)步驟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制為對(duì)象，并在前述基礎(chǔ)研究的引導(dǎo)下進(jìn)行抗炎藥物的研發(fā)，彼此間相互補(bǔ)充、有機(jī)結(jié)合，對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)展展開集中深入的研究。六個(gè)研究方向有機(jī)整合，綜合研究了炎癥過 程中細(xì)胞間相互作用的各個(gè)層面，無疑將極大地加深我們對(duì)炎癥及其相關(guān)重大疾病發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制的了解，從而有力推動(dòng)相應(yīng)的藥物研發(fā)和臨床診療。 選取炎癥反應(yīng)中最基本的細(xì)胞間相互作用這一特征，對(duì)炎癥及其相關(guān)重大疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行重點(diǎn)突出、集中深入的研究，并且基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究緊密結(jié)合、相互促進(jìn)， 這在學(xué)術(shù)思路上具有良好創(chuàng)新性和重要科學(xué)價(jià)值。同時(shí)，我們將從分子水平、 細(xì)胞水平到 動(dòng)物模型等多個(gè)層面揭示各種信號(hào)分子在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用，在理論上和技術(shù)上均有突出的創(chuàng)新性和特色。理論創(chuàng)新：對(duì)國際前沿科學(xué)問題的把握和提煉保證了本項(xiàng)目的創(chuàng)新性，我們將針對(duì)炎癥細(xì)胞及其所處環(huán)境間相互作用的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控規(guī)律展開研究。我 們將從炎癥因子與 I 型干擾素的差異性調(diào)節(jié)這一特殊的視角研究 TLR介導(dǎo)的細(xì)胞識(shí)別的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，提出“炎癥和 I 型干 擾素反應(yīng)失衡促進(jìn)炎癥損傷”的理論觀 點(diǎn)，為炎癥性疾病的治療提供新思路。我們創(chuàng)新性地提出 FPR2 在識(shí)別 A?、激活小膠質(zhì)細(xì)胞及 AD 病理變化中的作用，為 AD 的病理機(jī)制提供新的內(nèi)容，為 AD 預(yù)防和治療的研究提供新的思路和靶標(biāo)。選凝素活化整合素的信號(hào)通路是我們?cè)瓌?chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，將 對(duì)其展開深入揭示。我們擬開展的急性期蛋白對(duì)選凝素黏附活性的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制更是從未見報(bào)道。我們將從系統(tǒng)生物學(xué)的角度研究炎癥過程中細(xì)胞遷移的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。從調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、miRNA 的關(guān) 鍵信號(hào)通路和方式等角度揭示炎癥復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物等生物大分子網(wǎng)絡(luò)在炎癥狀態(tài)下對(duì)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的貢獻(xiàn)及規(guī)律。我們也將創(chuàng)新性地開展組蛋白去甲基化酶與炎癥效應(yīng)的關(guān)系、miRNA 對(duì)炎癥因子基因表達(dá)和炎癥復(fù)合體在炎癥因子釋放中的作用方面的研究。技術(shù)創(chuàng)新：多種新的技術(shù)手段綜合運(yùn)用是本項(xiàng)目的一大特色。將結(jié)構(gòu)基因組的模式運(yùn)用于少數(shù)重要的核心蛋白質(zhì)及其復(fù)合物，進(jìn)行集中式高通量的目標(biāo)片斷優(yōu)化設(shè)計(jì)，從而高效快速的 獲取靶蛋白及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息，以高分辨率結(jié)構(gòu)信息為切入點(diǎn)，從分子水平上闡釋炎癥反應(yīng)過程中細(xì)胞識(shí)別的內(nèi)部機(jī)理。建立了從基因蛋白水平、組織細(xì) 胞水平以及動(dòng)物模型水平的多層次多手段的炎癥相關(guān)細(xì)胞黏附行為研究系統(tǒng)， 為相關(guān)研究的系統(tǒng)深入的開展打下了基礎(chǔ)。將傳統(tǒng)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、 結(jié)構(gòu)生物學(xué)與 單分子納米技術(shù)相結(jié)合，研究炎癥反應(yīng)中的細(xì)胞極性這一重大生物學(xué)問題。本研究涉及組蛋白甲基化對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響、細(xì)胞內(nèi)炎癥復(fù)合體形成等研究，因此將充分利用分子細(xì)胞內(nèi)活體示蹤、熒光偏振能量轉(zhuǎn)移等方法，爭(zhēng)取在蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)-DNA 等大分子復(fù)合物研究技術(shù)上有所創(chuàng)新。同時(shí)，我 們已擁有相當(dāng)規(guī)模的小分子化合物庫，對(duì)活性小分子的化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)改造也已有多年的研究經(jīng)驗(yàn)積累，有望開發(fā)出新的合成技術(shù)和獲得新穎分子結(jié)構(gòu)。（五）課題設(shè)置：課題一 炎癥過程中細(xì)胞識(shí)別的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制：研究目標(biāo)：揭示雙特異性蛋白磷酸酶、Ets 家族轉(zhuǎn)錄 因子以及自主發(fā)現(xiàn)的 DPK 等分子對(duì) TLR 介導(dǎo)的細(xì)胞識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制，解析相關(guān)重要蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)。明確 FPR2 在識(shí)別A?、介導(dǎo) A?所致 AD 腦部炎癥反 應(yīng)中的作用及其分子機(jī)制，闡明去甲腎上腺素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞識(shí)別、吞噬和清除 A?的影響及分子機(jī)制。研究內(nèi)容：TLR 介導(dǎo)的細(xì)胞識(shí)別導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子、I 型干擾素、趨化因子的產(chǎn)生，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生起關(guān)鍵作用。本課題將研究雙特異性蛋白磷酸酶 DUSP、Ets 家族轉(zhuǎn)錄因子以及 DPK 等分子對(duì) TLR 介導(dǎo)的細(xì)胞識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。觀察 DUSP、Ets、DPK 等分子表達(dá)缺失在體內(nèi)外對(duì) TLR 活化介導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子、I 型干擾素、 趨化因子表達(dá)以及炎癥 細(xì)胞趨化效應(yīng)的影響，研究 DUSP、Ets、DPK 等分子 對(duì)已知 TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 分子活化的調(diào)節(jié)作用及其分子間的相互作用，解析重要蛋白質(zhì)分子及其復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，闡明其分子間的相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在阿爾茨海默氏?。ˋD），?淀粉樣蛋白（A? ）通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡、突觸功能障礙。小膠質(zhì)細(xì)胞 則可吞噬、降解 A?。另外，藍(lán)斑神經(jīng)元變性導(dǎo)致其投射區(qū)域去甲腎上腺素（NE）水平的降低加重 AD 的病理變化。本課題擬利用 RNA 干擾技術(shù)和基因敲除技術(shù)在離體和整體水平進(jìn)一步研究小膠質(zhì)細(xì)胞 A?受體 FPR2 在識(shí)別 A?、介 導(dǎo) A?所致 AD 腦部炎癥反應(yīng)及病理變化中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；以及去甲腎上腺素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞識(shí)別、吞噬和清除 A?的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。為 AD 病理機(jī)制及治 療研究提供新的內(nèi)容和靶標(biāo)。承擔(dān)單位：中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 安華章，教授，中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)主要學(xué)術(shù)骨干：周兆才，研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院樂穎影，研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院經(jīng)費(fèi)比例： 16％課題二 炎癥過程中細(xì)胞黏附的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制：研究目標(biāo)：進(jìn)一步揭示選凝素活化整合素的信號(hào)調(diào)控機(jī)制，確認(rèn)此信號(hào)通路中Jak 激酶、Src 激酶、 RhoA 等關(guān)鍵分子的活性 調(diào)節(jié)方式。闡明選凝素與急性期蛋白 SAP 和 CRP 的相互作用機(jī)理，加深對(duì)細(xì) 胞黏附分子通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞黏附行為的認(rèn)識(shí)。研究內(nèi)容：本課題將研究 P-選凝素活化整合素通路中整合素活性 調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及此信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制，并研究急性期蛋白通過調(diào)節(jié)選凝素活性影響白細(xì)胞黏附的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。利用我們建立的涉及分子、細(xì)胞和動(dòng)物模型等多層次的炎癥相關(guān)細(xì)胞黏附行為研究系統(tǒng)，研究 P-選凝素動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)整合素活化構(gòu)像的變化以及與其配基的結(jié)合；研究 RhoA 對(duì) P-選凝素活化整合素信號(hào)通路的調(diào)控，對(duì)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用的影響；利用 PSGL-1 的胞內(nèi)區(qū)融合肽段研究對(duì) P-選凝素調(diào)控整合素的抑制效果；在 P-選凝素引起的整合素介導(dǎo) 的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，以及 P-選凝素和整合素發(fā)揮關(guān)鍵作用的急性腹膜炎等動(dòng)物模型中，確認(rèn)此整合素活性調(diào)節(jié)機(jī)制的生理作用。同時(shí)我們還將研究在 P-選凝素引起白細(xì)胞整合素活化過程中，c-Cbl 被酪氨酸磷酸化的情況，及其隨 時(shí)間進(jìn)程的 變化，探討 c-Cbl 活性如何受 Src 的調(diào)節(jié)，包括白 細(xì)胞中哪個(gè) Src 激酶分子主導(dǎo)這一過程，c-Cbl 哪個(gè)關(guān)鍵酪氨酸殘基在這一過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用；研究在 P-選凝素信號(hào)刺激下 c-Cbl對(duì) Src 的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制， c-Cbl 對(duì) Src 激酶泛素化過程以及蛋白降解過程的調(diào)節(jié)；利用 siRNA 或 c-Cbl 無活性突變體抑制 c-Cbl 的活性，研究 Src 和 c-Cbl 的相互調(diào)節(jié)對(duì)此信號(hào)通路所起到的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用；在 P-選凝素引起的整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，以及 P-選凝素和整合素發(fā)揮關(guān)鍵作用的急性腹膜炎等動(dòng)物模型中，確認(rèn)此負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的生理作用。我們還將研究選凝素與急性期蛋白 SAP 和 CRP 的相互作用特異性，利用缺失突變和位點(diǎn)特異性突變等試驗(yàn)來尋找 SAP 和 CRP 結(jié)合 P-選凝素的關(guān)鍵氨基酸，用表面等離子共振技術(shù)檢測(cè) SAP 和 CRP 與 P-選凝素結(jié)合的親合力和動(dòng)力學(xué)，利用晶體結(jié)構(gòu)分析研究 SAP 與 P-選凝素的關(guān)鍵結(jié) 合位點(diǎn)；用 SAP 轉(zhuǎn)基因小鼠和SAP 基因敲除小鼠研究 SAP 對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，并利用 SAP 純蛋白在選凝素介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中以及選凝素發(fā)揮關(guān)鍵作用的炎癥等動(dòng)物模型中，確認(rèn)急性期蛋白通過調(diào)節(jié)選凝素活性影響炎癥細(xì)胞黏附活性的生理作用。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院課題負(fù)責(zé)人： 耿建國，研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院主要學(xué)術(shù)骨干：楊雪松，教授，暨南大學(xué)陳銘，副研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院經(jīng)費(fèi)比例：25％課題三 炎癥過程中細(xì)胞極性形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制：研究目標(biāo)：揭示炎癥相關(guān)整合素及其配體在細(xì)胞極性形成中的作用及其對(duì)白細(xì)胞的黏附和遷移的影響；闡明整合素功能調(diào)控及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制；揭示細(xì)胞極性蛋白復(fù)合物 Par 復(fù)合物（Par3/Par6/aPKC）及其結(jié)合蛋白Lgl、Cdc42 在淋巴細(xì)胞激活、遷移和炎癥 發(fā)生、發(fā)展中的功能及其信號(hào)調(diào)控機(jī)制。研究內(nèi)容：本課題將研究細(xì)胞極性在淋巴細(xì)胞激活、遷移和炎癥發(fā)生發(fā)展中的功能及其信號(hào)調(diào)控機(jī)制，闡明黏附分子及其配體、重要 細(xì)胞極性蛋白復(fù)合物及其結(jié)合蛋白的生物學(xué)功能和分子機(jī)理。白細(xì)胞的滾動(dòng)和穩(wěn)定黏附與其在內(nèi)皮細(xì)胞小靜脈的定位、捕獲和遷移有關(guān)。?4 整合素既可以介導(dǎo)白細(xì) 胞在其配體表面滾動(dòng)，也可以介導(dǎo)白細(xì)胞的穩(wěn)定黏附，這一特性是通過對(duì)其親和性的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。而且，整合素對(duì)配體的親和性與細(xì)胞的極性，遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。因此，研究? 4 整合素親和性動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對(duì)于我們了解細(xì)胞極性與白細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的關(guān)系是非常重要的。我們將研究：整合素親和性動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的機(jī)制和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；整合素親和性動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞極性與細(xì)胞遷移的影響；整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過研究細(xì)胞極性蛋白復(fù)合物 PAR 復(fù)合物及其相關(guān)功能蛋白，探討細(xì)胞極性建立和維持與 T/B 淋巴細(xì)胞激活、遷移和炎癥發(fā)生之間的相互關(guān)系，希望闡明 PAR 復(fù)合物及其相關(guān)蛋白在這些生命活動(dòng)中的作用機(jī)理，推動(dòng)對(duì)復(fù)雜系統(tǒng)中不同的細(xì)胞活動(dòng)間相互關(guān)系的認(rèn)識(shí)，了解細(xì)胞極性如何影響淋巴細(xì)胞功能及其在炎癥中變化規(guī)律。具體內(nèi)容包括：細(xì)胞極性蛋白 Par 復(fù)合物及其結(jié)合蛋白在淋巴細(xì)胞極性形成機(jī)理研究； Par 復(fù)合物及其結(jié)合蛋白 對(duì)淋巴細(xì)胞功能的影響和信號(hào)調(diào)控機(jī)制；Par 復(fù)合物及其結(jié)合蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞遷移的影響和信號(hào)調(diào)控機(jī)制；Par 復(fù)合物及其結(jié)合蛋白在炎癥中的作用和機(jī)制研究。我們將利用單分子力譜法，在納米級(jí)空間尺度上標(biāo)定黏附分子在白細(xì)胞表面的分布以及活性。采用目前國際上常用的 K562 白細(xì)胞株作為樣品，K562 細(xì)胞將被轉(zhuǎn)入? 4 整合素，以及不同的趨化因子受體。利用原子力顯微鏡配合熒光顯微鏡成像的方法，我們將研究： K562 胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引 發(fā)的胞外整合素介導(dǎo)的黏附力變化并測(cè)量變化的動(dòng)力學(xué)過程；K562 細(xì)胞與人血管內(nèi)皮 細(xì)胞的黏附力以及在模擬炎癥條件下的相互作用變化過程；K562 細(xì)胞在受 趨化信號(hào)吸引下做定向遷移時(shí)，其 細(xì)胞前端和后緣的 納米級(jí)分辨率的形貌，黏附蛋白的分布以及活性。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院課題負(fù)責(zé)人： 陳劍峰，研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院主要學(xué)術(shù)骨干：陳正軍，研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院張曉暉，研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院經(jīng)費(fèi)比例： 16％課題四 炎癥過程中細(xì)胞遷移的信號(hào)調(diào)控及其分子基礎(chǔ)：研究目標(biāo)：建立和完善研究細(xì)胞定向遷移的技術(shù)平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)一系列調(diào)控細(xì)胞遷移的新的信號(hào)分子，并系統(tǒng)地研究 這些分子對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)控機(jī)制；結(jié)合原有研究基礎(chǔ)，建立從胞外、胞膜到胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞遷移的關(guān)鍵信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)調(diào) 控炎癥細(xì)胞定向遷移的新的信號(hào)途徑，并鑒定若干新的抗炎藥物作用靶位。研究內(nèi)容：本課題將系統(tǒng)地研究炎癥發(fā)生過程中調(diào)控細(xì)胞遷移的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制。擬以參與炎癥發(fā)生過程中的各種白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，結(jié)合已有研究基礎(chǔ)，發(fā) 展研究細(xì)胞遷移的新技術(shù)，建立高效、系統(tǒng) 的細(xì)胞遷移研究技術(shù)平臺(tái)；系統(tǒng)地研究細(xì)胞外信號(hào)分子、 細(xì)胞膜表面受體群及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)對(duì)細(xì)胞遷移方向的決擇及遷移速度的調(diào)控；基于多種篩選技術(shù)，尋找并鑒定正向或負(fù)向調(diào)控細(xì)胞遷移的細(xì)胞因子及化合物；以蛋白質(zhì)組學(xué)為手段，鑒定白細(xì)胞遷移過程中的蛋白質(zhì)修飾的調(diào)控機(jī)制，并 鑒定調(diào)控細(xì)胞定向遷移關(guān)鍵信號(hào)蛋白復(fù)合體，研究調(diào)控白細(xì)胞遷移的各種信號(hào)通路間的新的對(duì)話機(jī)制；并結(jié)合功能基因組學(xué)，運(yùn)用大規(guī)模 siRNA 篩選，尋找并 鑒定調(diào)控白細(xì)胞定向遷移的新的 調(diào)控分子及調(diào)控機(jī)制；結(jié)合細(xì)胞及模式動(dòng)物技術(shù)，進(jìn)一步研究這些新的調(diào)控分子對(duì)于炎癥及相關(guān)疾病的影響。探索從胞外信號(hào)與膜蛋白 GPCR 結(jié)合啟 動(dòng)的信號(hào)傳遞過程，通 過研究磷脂代謝家族、小 G 蛋白家族到核 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)，系統(tǒng)深入的探索其與細(xì)胞遷移及炎癥的關(guān)系。選擇 關(guān)鍵的分子靶位， 篩選正向或負(fù)向調(diào)控細(xì)胞遷移的蛋白、短肽 、寡糖或化合物， 為控制炎癥細(xì)胞遷移提供新的技 術(shù)途徑。承擔(dān)單位：南方醫(yī)科大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 姜勇，教授，南方醫(yī)科大學(xué)主要學(xué)術(shù)骨干：王平，教授，華東師范大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例： 16％課題五 炎癥過程中細(xì)胞效應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制：研究目標(biāo)：系統(tǒng)研究在炎癥過程中產(chǎn)生炎癥放大和組織損傷效應(yīng)的炎癥細(xì)胞及其作用的靶細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)規(guī)律，闡明這些細(xì)胞合成和釋放炎癥因子等效應(yīng)分子的調(diào)控方式，認(rèn)識(shí)細(xì) 胞在炎癥環(huán)境下參與控制表達(dá)效應(yīng)分子的新的信號(hào)分子及作用機(jī)制，從炎癥復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物等角度建立炎癥狀態(tài)下生物大分子相互作用的網(wǎng)絡(luò)的理論模型，力爭(zhēng)發(fā)現(xiàn)新的控制炎癥的藥物靶位。研究內(nèi)容：本課題擬研究的主要炎癥細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，炎癥效應(yīng)的靶組織則主要利用關(guān)節(jié)炎中的滑膜成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象。在這些細(xì)胞探討在基因轉(zhuǎn)錄水平控制巨噬細(xì)胞 IL-1?、TNF-?等促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物成熟及釋放的信號(hào)分子及其轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；在成纖維細(xì)胞則重點(diǎn)觀察 MMPs 等細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的基因表達(dá)控制信號(hào)通路以及影響這些分子翻譯后加工及釋放的信號(hào)機(jī)制。在基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的研究中，將特別關(guān)注調(diào)控這些效應(yīng)因子釋放的組蛋白修飾編碼、擴(kuò)展對(duì) NF-?B 等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子作用的 認(rèn)識(shí)、系 統(tǒng)認(rèn)識(shí)調(diào)節(jié)炎癥因子釋放的 miRNA 表達(dá)譜及其作用。具體內(nèi)容包括：（1）發(fā)現(xiàn)和鑒定炎癥效應(yīng)相關(guān)的組蛋白去甲基化酶（如 H3K9me2 組蛋白去甲基化酶），闡明它們?cè)谡{(diào)控炎癥效應(yīng)因子（IL-1?、TNF-? 、MMPs）表達(dá)中的作用，利用 組蛋白去甲基化酶基因剔除小鼠研究組蛋白修飾與炎癥效應(yīng)的關(guān)系；（2）觀察炎癥細(xì)胞及其他效應(yīng)細(xì)胞在炎癥應(yīng)激信號(hào)作用下的轉(zhuǎn)錄因子含量及活性變化、miRNA 種類和含量變化，分析這些變化對(duì)于炎癥效應(yīng)信號(hào)（IL-1?、TNF-?、MMPs）的影響；（3）研究炎癥細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞在炎癥環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)信號(hào)與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，闡明細(xì)胞外基質(zhì)成分（膠原、纖連蛋白、整合素等）在炎癥環(huán)境下的變化及其對(duì)細(xì)胞炎癥效應(yīng)的影響。在炎癥效應(yīng)因子的翻譯后調(diào)控信號(hào)方面則重點(diǎn)研究在促炎細(xì)胞因子或MMPs 等的分泌調(diào)控中的重要蛋白 質(zhì)復(fù)合體，如炎癥復(fù)合體的形成及作用。系統(tǒng)而深入地研究炎癥復(fù)合體在病原侵入和應(yīng)激刺激中形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)異常引起各種疾病的分子機(jī)理。擬通過規(guī)模性地蛋白質(zhì)相互作用篩選手段，尋找各種炎癥復(fù)合體介 導(dǎo)信號(hào)通路中新的蛋白分子，并研究其在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的功能和分子作用機(jī)制；同時(shí)研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子 ASC 的復(fù)合體的形成，動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并闡明蛋白翻 譯后修飾在此過程中的作用及對(duì) NLRs 發(fā)揮功能的影響，為重大疾病的診治提供新策略和新靶點(diǎn)。承擔(dān)單位：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 藥立波，教授，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)主要學(xué)術(shù)骨干：陳德桂，研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院錢友存，研究員，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院經(jīng)費(fèi)比例： 16％課題六 抗炎活性化合物篩選及優(yōu)化：研究目標(biāo)：針對(duì)本項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)的與炎癥相關(guān)的新通路或靶標(biāo)，建立快速可靠的活性化合物篩選模型，通 過通量 篩選、合理 藥物設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化相結(jié)合的方法獲得高活性的化合物，并完成較全面的構(gòu)效關(guān)系研究，獲得具有顯著抗炎效果的候選藥物化合物。并為進(jìn)一步研究相關(guān)靶標(biāo)在炎癥過程中的作用提供小分子化合物研究工具和探針。研究內(nèi)容：本課題將開展大量抗炎活性化合物的篩選及優(yōu)化研究工作。針對(duì)本項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)的有效的抗炎新通路或靶標(biāo)，利用分子和細(xì)胞生物學(xué)等方法建立快速可靠的篩選模型，并進(jìn)行通量篩選 ，尋找相應(yīng)靶標(biāo)的小分子抑制劑。 對(duì)所獲得的活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，提高化合物對(duì)靶標(biāo)的活性和選擇性，同時(shí)改善化合物的理化性質(zhì)等其它性質(zhì)。我們還將利用 Western Blot、RT-PCR、Co-IP、EMSA 等生化技術(shù)，以及免疫熒光分析、流式細(xì)胞儀分析等手段進(jìn)一步 驗(yàn)證化合物對(duì)靶標(biāo)的生物學(xué)作用和選擇性等。此外，在了解藥物靶標(biāo)的三維結(jié) 構(gòu)的基礎(chǔ)上，我 們還將利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等技術(shù)合理設(shè)計(jì)和合成對(duì)應(yīng)相關(guān)生物靶標(biāo)的小分子調(diào)節(jié)劑。在獲得針對(duì)生物靶標(biāo)具有較好活性和選擇性的化合物后，我們一方面將利用動(dòng)物模型研究這些化合物對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用，評(píng)價(jià)并改善其藥代動(dòng)力學(xué)特性并提高化合物的安全性，以期以此為基礎(chǔ)開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗炎藥物。另一方面，我們也將根據(jù)科學(xué)研究的需要， 對(duì)化合物進(jìn)行生物素或熒光標(biāo)記，為進(jìn) 一步研究相關(guān)靶 標(biāo)及其信號(hào)通路提供有力的小分子研究工具和探針。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所課題負(fù)責(zé)人： 俞飚，研究員，中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所主要學(xué)術(shù)骨干：丁克，研究員，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院經(jīng)費(fèi)比例：11％（六）課題設(shè)置思路：本項(xiàng)目擬從炎癥細(xì)胞及其所處環(huán)境間相互作用的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控規(guī)律這一關(guān)鍵科學(xué)問題出發(fā)，主要以炎癥中細(xì)胞間相互作用為主線，以炎癥細(xì)胞間發(fā)生相互作用基本過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制為對(duì)象，并在前述基礎(chǔ)研究的引導(dǎo)下進(jìn)行抗炎藥物的研發(fā)，彼此 間相互補(bǔ)充、有機(jī) 結(jié)合， 對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)展展開集中深入的研究?；诖罅康奈墨I(xiàn)回顧、 長期的工作基 礎(chǔ)和儲(chǔ)備的人才隊(duì)伍，本 項(xiàng)目擬設(shè)立六個(gè)課題：課題一，炎癥過程中細(xì)胞識(shí)別的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；課題二，炎癥過程中細(xì)胞黏附的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；課題三，炎癥過程中細(xì)胞極性形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；課題四，炎癥過程中 細(xì)胞遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；課題五，炎癥過程中細(xì)胞效應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；課題六，抗炎活性化合物篩選及優(yōu)化。各課題間的有機(jī)聯(lián)系以及與項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)的關(guān)系：炎癥反應(yīng)的發(fā)生從本質(zhì)上講就是各種炎癥細(xì)胞在致炎/抗炎因子等作用下，通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制發(fā)生相互作用的過程，包括了從炎癥細(xì)胞識(shí)別（課題一）炎癥信號(hào)與其它細(xì)胞或胞外基質(zhì)發(fā)生黏附（課題二），到炎癥細(xì)胞形成極性（課題三）并響應(yīng)炎癥信號(hào)發(fā)生遷移（課題四），以及最終炎癥細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)（課題五）的整個(gè)過程，既有明確的階段和步驟，又是相互間密切聯(lián)系和時(shí)空有序的完整事件。治療炎癥性疾病是炎癥領(lǐng)域基礎(chǔ)研究的目的，通過對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行細(xì)致的分子調(diào)控機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)新的抗炎藥物作用靶點(diǎn)，無疑將有力促進(jìn)抗炎藥物研發(fā)（課題六）。本項(xiàng) 目包含的六個(gè)課題的設(shè)置相互間緊密相關(guān)，圍繞著揭示炎癥及其相關(guān)重大疾病中細(xì)胞間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、促進(jìn)抗炎藥物研發(fā)等應(yīng)用研究的項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)，展開系統(tǒng)深入的研究，課題間相互關(guān)聯(lián)、逐 漸延續(xù)、密切合作、互為指導(dǎo)， 組成一個(gè)完整的研究體系。課題間有機(jī)聯(lián)系示意圖四、年度計(jì)劃年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)第一年1. 研究包括DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 在內(nèi)的靶分子基因轉(zhuǎn)染對(duì)原代培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞/樹突狀細(xì)胞 TLR 反應(yīng)的影響。2. 在 mRNA、蛋白質(zhì)及功能水平探討FPR2 在 A?激活腦小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用。3. 利用分子和細(xì)胞水平的炎癥細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，研究選凝素與急性期蛋白 SAP之間的相互作用機(jī)理；研究 P-選凝素與PSGL-1 的結(jié)合如何引起 Src 激酶和 c-Cbl 之間 的相互 調(diào)節(jié)；研究不同白 細(xì)胞間對(duì)同一活化信號(hào)的不同響應(yīng)機(jī)制。4. 研究炎癥相關(guān)黏附分子在雞胚早期發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)模式，以此建立利用胚胎作為模式動(dòng)物研究黏附分子的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?. 研究整合素? 4?7 的親和性動(dòng)態(tài)調(diào)控的機(jī)制。6. 完善和系統(tǒng)化原子力顯微和單細(xì)胞力譜技術(shù)，使之適用于探測(cè)遷移中的活體炎癥細(xì)胞。7. 建立血液 細(xì)胞（T/B 細(xì)胞）蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)方法：SILAC, iTRAQ；對(duì)Par3、Par6、aPKC 和 Lgl 等極性蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行研究分析。8. 以參與炎癥發(fā)生過程中的各種白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，結(jié)合已有研究基 礎(chǔ)，發(fā)展研究細(xì)胞遷移的新技術(shù)，建立高效、系統(tǒng)的細(xì)胞遷移研究技術(shù)平臺(tái)。并建立相應(yīng)的篩選技術(shù)包括功能基因組、shRNA篩選、蛋白質(zhì)組篩選。同時(shí)在此基礎(chǔ)之上，建立小分子化合物的篩選平臺(tái)。9. 用 TNF-?和 IL-8 等刺激和活化中性粒細(xì)胞，建立體外中性粒細(xì)胞黏附和遷移模型，結(jié)合抑制劑、基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)，分析c-Abl 激 酶、? 2 整合素等蛋白的細(xì)胞分布、動(dòng)態(tài)變化及對(duì)中性粒細(xì)胞黏附和遷移的影響。10. 探討 MAPK 通路信號(hào)分子，尤其是PRAK 在 細(xì)胞骨架調(diào)整中的作用及其機(jī)制。1. 發(fā)現(xiàn)新的對(duì) TLR 反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用的DUSP 及 Ets 家族蛋白分子。2. 明確 DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等基因表達(dá)在體外對(duì) TLR 介導(dǎo)的炎癥及固有免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用。3. 獲得足夠量的高純度目標(biāo)蛋白質(zhì)以用于體外生化實(shí)驗(yàn)以及結(jié)構(gòu)分析。4. 獲得有效表達(dá) FPR2 shRNA 的慢病毒載體；在細(xì)胞水平明確 FPR2 是介導(dǎo) A? 所致腦部炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子。5. 揭示選凝素通過與 SAP 的相互作用調(diào)控炎癥細(xì)胞的黏附行為的分子機(jī)制，揭示Src 激酶與 c-Cbl 相互調(diào)控在炎癥細(xì)胞黏附活性調(diào)節(jié)中的作用，揭示不同白 細(xì)胞間對(duì)同一活化信號(hào)的不同響應(yīng)機(jī)制。6. 采用原位雜交和免疫組化技術(shù)進(jìn)一步完善黏附分子 E-Cadherin 和 N-Cadherin等在胚胎早期的表達(dá)，而后探討其它黏附分子。7. 揭示整合素親和性動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)白細(xì)胞在炎癥過程中的極性形成和運(yùn)動(dòng)的影響。8. 開發(fā)出測(cè)量單個(gè)活體細(xì)胞表面分子分布和活性的納米生物學(xué)方法。9. 從分子水平上，確定極性蛋白 Par 復(fù)合物在血液細(xì)胞的結(jié)合蛋白及其相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；鑒定重要的功能性結(jié)合蛋白、確定其細(xì)胞定位和與 T/B 細(xì)胞功能的相關(guān)性。10. 建立多 樣化的、系統(tǒng)研究白 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等定向遷移技術(shù)平臺(tái)。11. 建立并完善相應(yīng)的篩選技術(shù)平臺(tái)：包括相關(guān)功能基因家族的克隆、相關(guān) shRNA收集及構(gòu)建、鑒定及相關(guān)表達(dá)系 統(tǒng)的建立如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等系統(tǒng) 、以及相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的建立。12. 建立中性粒細(xì)胞鋪片培養(yǎng)，實(shí)時(shí)觀測(cè)并記錄細(xì)胞的黏附和延展實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，體外 Transwell 中性粒細(xì)胞遷移及侵襲模型。明確 c-Abl 激酶等與細(xì)胞骨架相關(guān)動(dòng)態(tài)變化等相關(guān)蛋白在中性粒細(xì)胞黏附和遷移中的作用。年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)11. 觀察炎癥細(xì)胞及其他效應(yīng)細(xì)胞在炎癥應(yīng)激信號(hào)作用下的轉(zhuǎn)錄因子含量及活性變化、miRNA 種類和含量變 化，分析 這些變化對(duì)于炎癥效應(yīng)信號(hào)的影響。12. 構(gòu)建核蛋白質(zhì)基因克隆庫, 用免疫組化方法高通量篩選新的組蛋白去甲基化酶, 并用高表達(dá) Knockdown 目標(biāo)基因在細(xì)胞內(nèi)鑒定組蛋白去甲基化酶的活性。13. 研究 TLR4 和 RIG-I 激活前體白介素－1 加工成熟通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；14. 通過 酵母雙 雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀和GST－Pulldown 等手段篩選炎癥復(fù)合體中新的信號(hào)分子；15. 針對(duì)目前已被驗(yàn)證過的抗炎藥物新靶標(biāo)（主要針對(duì)尚無藥物上市的靶標(biāo)）開發(fā)原創(chuàng)性的小分子調(diào)節(jié)劑作為新藥候選物。如針對(duì)與機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)的 JAK-STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、與關(guān)節(jié) 炎（OA）密切相關(guān)的 ADAMTs 開發(fā)選擇性小分子調(diào)節(jié)劑劑等。建設(shè)小分子化合物 庫。13. 獲得研究需要的部分小鼠品系。14. 發(fā)現(xiàn)一些新的 MAPK 通路信號(hào)分子與細(xì)胞骨架的功能聯(lián)系。15. 發(fā)現(xiàn)炎癥信號(hào)作用下某些特定轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 的變化；發(fā)現(xiàn)新的組蛋白去甲基化酶候選基因；在闡明 TLR 激活白介素－1 成熟加工的分子機(jī)制方面篩選出炎癥復(fù)合體中新的信號(hào)分子。16. 完成 STAT3，ADAMTs 的篩選模型建立，并進(jìn)行活性評(píng)價(jià)和篩選。初步獲得針對(duì) STAT3，ADAMTs 的先導(dǎo)化合物。17. 定向合成 200 個(gè)左右小分子化合物，充實(shí)小分子化合物庫。18. 在國際高水平學(xué)術(shù)雜志（IF>5）上發(fā)表10 篇以上論文，申請(qǐng) 2 項(xiàng)以上相關(guān) 專利，培養(yǎng)博士研究生 10 人以上。第二年1. 合成并篩選DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等分子特異性干擾 RNA，研究內(nèi)源性 DPK 分子基因敲減對(duì)原代培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞、 樹突狀細(xì)胞中 TLR 介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子及 I型干擾素反應(yīng)的影響。2. 鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物關(guān)鍵組分的生化特征。對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)及體外重構(gòu)的復(fù)合物并進(jìn)行單晶培養(yǎng)。3. 通過 RNA 干涉技術(shù)， 在急性 AD 小鼠模型探討 FPR2 在 A?42 所誘導(dǎo)腦部膠質(zhì)細(xì)胞侵潤和炎性細(xì)胞因子生成中的作用。4. 利用生化實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型系 統(tǒng)，研究機(jī)體調(diào)控選凝素與 SAP 相互結(jié)合的分子機(jī)理；研究 P-選凝素與 PSGL-1 的結(jié)合如何引起 Jak2 激酶活化并進(jìn)而活化 Src 激酶。5. 利用哮喘等模型，研究不同白 細(xì)胞對(duì)同一活化信號(hào)有不同響應(yīng)的生理意義。6. 開發(fā)已知的常見黏附分子的基因干擾（over-expression and siRNA）的同 時(shí)，探 討1. 明確內(nèi)源性DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等分子在體外對(duì) TLR 介導(dǎo)的炎癥及固有免疫反應(yīng)中的作用。2. 獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的翻譯后修飾特征。通過體外分析，建立目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)。 獲得初步晶體生長條件。3. 在急性 AD 動(dòng)物模型明確 FPR2 在 A?所致腦部炎癥反應(yīng)中的作用。4. 揭示機(jī)體通過調(diào)控選凝素與 SAP 相互作用，影響炎癥細(xì)胞的黏附行 為的分子機(jī)制；揭示 Jak2 激酶在選凝素活化整合素信號(hào)通路中的重要作用；揭示噬酸性粒細(xì)胞在哮喘中的行為調(diào)控機(jī)制。5. 在明確目標(biāo) 黏附分子基因的基 礎(chǔ)上，建立穩(wěn)定的基因干擾的條件，為 后續(xù)工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。6. 闡明整合素相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與白細(xì)胞極性形成以及運(yùn)動(dòng)的關(guān)系。7. 揭示整合素的在白細(xì)胞遷移過程中的納米級(jí)空間分布、極性化過程及活性的 調(diào)年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)其它黏附分子干涉的相應(yīng)條件， 設(shè)計(jì)構(gòu)建 dominant negative 表達(dá)質(zhì)粒等。7. 研究整合素介導(dǎo)細(xì)胞雙向跨膜信號(hào)的機(jī)制及其生物學(xué)功能。8. 利用整合素配體修飾的探 針，用于探測(cè)上整合素的在白細(xì)胞遷移時(shí)的分布與活性。9. 從 細(xì)胞水平，建立單分子和高分辨率的免疫熒光技術(shù)，以及原子力 顯微鏡等先進(jìn)的成像技術(shù)。利用上述技術(shù) 研究Par3/Par6 復(fù)合物及其結(jié)合蛋白在細(xì)胞水平的定位與細(xì)胞功能的變化相關(guān)性。10. 利用 RNAi 技術(shù)研究 Par 蛋白復(fù)合物的缺失對(duì) T/B 細(xì)胞的功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能不對(duì)稱性分布的影響。11. 從動(dòng)物水平，開始著手制備 Par3 和/或 Par6 的組織特異性條件性基因敲除小鼠模型各種質(zhì)粒，或引進(jìn)相應(yīng) 的小鼠模型。12. 以蛋白 質(zhì)組 學(xué)為手段，鑒定白細(xì)胞遷移過程中的關(guān)鍵蛋白家族如 GPCR、小 G蛋白、磷脂代謝相關(guān)蛋白修飾 的調(diào)控機(jī)制。13. 結(jié)合功能基因組學(xué)，siRNA 等篩選技術(shù)，尋找并鑒定調(diào)控白細(xì)胞定向遷移的新的調(diào)控分子。14. 結(jié) 合酵母雙 雜交、蛋白質(zhì)免疫共沉淀和質(zhì)普分析技術(shù)，分析和鑒定在中性粒 細(xì)胞黏附和遷移過程中與 c-Abl 激酶和? 2 整合素相互作用的蛋白質(zhì)，及相互作用的 時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。15. 構(gòu)建 CD18 的 CD4+T 細(xì)胞條件性基因剔除自身免疫性疾病的小鼠模型。16. 以 細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 為靶 標(biāo)，使用蛋白質(zhì)免疫共沉淀、非變性凝膠 電泳、 GST-pulldown、DIGE 和質(zhì)普分析等多種技術(shù)鑒定相關(guān)信號(hào)蛋白復(fù)合體。17. 繼續(xù)觀察炎癥細(xì)胞及其他效應(yīng)細(xì)胞在炎癥應(yīng)激信號(hào)作用下的轉(zhuǎn)錄因子含量及活性變化、miRNA 種類和含量 變化， 進(jìn)一步分析這些變化對(duì)于炎癥效應(yīng)信號(hào)的影響?？貦C(jī)制。8. 在分子水平，進(jìn)一步確定重要的功能性結(jié)合蛋白，及其細(xì)胞定位和與 T/B 細(xì)胞功能的相關(guān)性。9. 在細(xì)胞水平，確定極性蛋白 Par 復(fù)合物及結(jié)合蛋白細(xì)胞定位變化與細(xì)胞功能相關(guān)性。10. 預(yù)期將鑒定并發(fā)現(xiàn) 2-3 種調(diào)控在細(xì)胞定向遷移過程中起關(guān)鍵作用的信號(hào)分子的新機(jī)制包括新的修飾機(jī)制磷酸化、泛素化等、新的調(diào)控蛋白。11. 通過 siRNA 篩選，得到 2-3 種直接參與細(xì)胞定向遷移的蛋白。12. 在明確 c-Abl 激酶和 β2整合素在中性粒細(xì)胞黏附和遷移中作用的基礎(chǔ)上，通 過對(duì)相關(guān)復(fù)合物組分的動(dòng)態(tài)分析， 鑒定出與上述兩種蛋白相互作用的蛋白及可能相互作用的環(huán)節(jié)，預(yù)期發(fā)現(xiàn) 1-2 種新的相互作用蛋白。13. 獲得 CD18 條件性基因剔除自發(fā)性自身免疫性疾病的小鼠模型。14. 鑒定出一些新的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白復(fù)合體，發(fā)現(xiàn)一些新的蛋白質(zhì)作用關(guān)系。15. 初步證實(shí)所發(fā)現(xiàn)的某些特定轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 在炎癥相關(guān)細(xì)胞效應(yīng) 中的作用；證實(shí)所發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶候選基因的活性；發(fā)現(xiàn)篩到新分子的部分功能；進(jìn)一步闡明 NLR 激活白介素－1 成熟加工的分子機(jī)制。16. 利用不同模型完成對(duì)初篩到的STAT3，ADAMTs 的小分子先導(dǎo)化合物的驗(yàn)證；針對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化；定向合成 200 個(gè)左右小分子化合物，充 實(shí)小分子化合物庫。17. 在國際高水平學(xué)術(shù)雜志（IF>5）上發(fā)表10 篇以上論文，申請(qǐng) 2 項(xiàng)以上相關(guān) 專利，培養(yǎng)博士研究生 10 人以上。年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)18. 表達(dá)和純化組蛋白去甲基化酶候選基因, 用質(zhì)譜和 Western blot 的方法在體外鑒定組蛋白去甲基化酶的活性, 并鑒定組蛋白去甲基化酶的催化機(jī)理。19. 研究 NLR 激活前體白介素－1 加工成熟通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并與 TLR 介導(dǎo)白介素－1 加工機(jī)制比較。20. 通過 siRNA 等手段研究篩到的炎癥復(fù)合體中新分子的功能。21. 獲得 應(yīng)激反應(yīng)基因 NDRG2 的基因剔除小鼠，鑒定其一般表型變化。22. 對(duì)與機(jī)體免疫反 應(yīng)密切相關(guān)的 JAK-STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、與關(guān)節(jié) 炎（OA）密切相關(guān)的 ADAMTs 開發(fā)選擇性小分子調(diào)節(jié)劑劑等。建設(shè)小分子化合物 庫。第三年1. 觀察 DUSP、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等分子表達(dá)對(duì) TLR 反應(yīng)中 MAPK、NF-?B、IRF3、STAT1 等信號(hào)分子活化的影響，研究 DUSP、Ets、DPK 等分子與已知TLR 信號(hào)傳導(dǎo)分子間的相互作用。2. 通 過高通量 優(yōu)化篩選，結(jié)合蛋白質(zhì)工程的方法，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的 單晶進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行衍射測(cè)試 。3. 將 FPR2 基因敲除小鼠與 APP 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，觀察子代小鼠腦部病理 變化和學(xué)習(xí)記憶能力的改變。4. 利用 X-射線晶體衍射等技 術(shù)，研究 P-選凝素與 SAP 相互結(jié)合的精細(xì)位點(diǎn)；研究選凝素活化整合素信號(hào)通路中其它關(guān)鍵蛋白間的相互結(jié)合位點(diǎn)。5. 利用生化 實(shí)驗(yàn) 和動(dòng)物模型系 統(tǒng)，研究P-選凝素與 PSGL-1 的結(jié)合如何通過 Rho A 等小 GTP 酶引起整合素活化。6. 在黏附分子基因干擾的前提下，實(shí)時(shí)在體觀察細(xì)胞的生物學(xué)改變，如 細(xì)胞分裂、遷移和分化，以及所導(dǎo)致的形 態(tài)發(fā)生的變異，同時(shí)以基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)作 為基因功能1. 明確 DUSP、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等分子對(duì) TLR 信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用， 闡明DUSP、Ets、DPK 等分子參與 TLR 信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制。2. 采集用于結(jié)構(gòu)解析的 X 射 線衍射數(shù)據(jù)。獲得初步晶體學(xué)分析結(jié)果以用于制定相應(yīng)的結(jié)構(gòu)解析方案。3. 闡明 FPR2 在 AD 發(fā)生發(fā)展中的作用。4. 揭示 P-選凝素與 SAP 相互結(jié)合的精細(xì)位點(diǎn)，揭示選凝素活化整合素信號(hào)通路中其它關(guān)鍵蛋白間的相互結(jié)合位點(diǎn)， 為尋找其結(jié)合特異抑制劑奠定基礎(chǔ)。揭示 Rho A等小 GTP 酶在炎癥細(xì)胞黏附活性調(diào)控中的重要作用。5. 明確相關(guān)黏附分子基因在胚胎發(fā)育中的功能，可能的情況下在小鼠胚胎加以驗(yàn)證。6. 揭示整合素在炎癥細(xì)胞極性化和遷移過程中的構(gòu)象變化機(jī)制。7. 在細(xì)胞水平，進(jìn)一步確定極性蛋白 Par復(fù)合物及結(jié)合蛋白細(xì)胞定位變化與細(xì)胞功能相關(guān)性。年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)學(xué)研究的支撐。7. 研究整合素親和性調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。8. 整合素抗體修飾的探針，通過不同表位的表達(dá)情況來分析整合素在膜上的構(gòu)象。9. 利用 RNAi 和 Rescue 等技術(shù)確定 Par蛋白復(fù)合物對(duì) T/B 細(xì)胞的功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能不對(duì)稱性分布的影響的專一性。10. 在動(dòng)物水平，完成 Par3 和/或 Par6 的組織特異性條件性基因敲除小鼠模型，或引進(jìn)相應(yīng)的小鼠模型并建立小鼠品系。初步分析小鼠的特定基因缺失的表形變化。11. 進(jìn)一步研究新的調(diào)控分子及調(diào)控機(jī)制對(duì)于炎癥及相關(guān)疾病的影響。探索這些新靶點(diǎn)對(duì)在細(xì)胞過程中對(duì)胞外信號(hào)與膜蛋白 GPCR 結(jié)合啟動(dòng)的信號(hào)傳遞、磷脂代 謝家族、小 G 蛋白家族到核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響，系統(tǒng)深入的探索 這些新分子及調(diào)控機(jī)制對(duì)細(xì)胞遷移的影響。12. 通過 GST-pulldown、far-western 等實(shí)驗(yàn)，具體分析 c-Abl 激酶和? 2 整合素與復(fù)合體中相互作用蛋白的作用機(jī)制。包括是組成性結(jié)合，還是活化依賴的；是直接 結(jié)合和間接結(jié)合，以及對(duì)直接結(jié) 合的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。 13. 評(píng)估 CD18 條件性基因剔除小鼠模型自身免疫性疾病的表型、白細(xì) 胞的活化和多種炎癥因子的表達(dá)。14. 使用蛋白質(zhì)組學(xué)、CHIP 和 DNA-pulldown 技術(shù)，研究 IP-10 等 趨化因子的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。15. 在應(yīng) 激反應(yīng)基因 NDRG2 的基因剔除小鼠觀察其炎癥環(huán)境下的細(xì)胞效應(yīng)改變。16. 用 RT-PCR, Western blot analysis 鑒定組蛋白去甲基化酶、上述發(fā)現(xiàn) 的重要轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 在炎癥效應(yīng)產(chǎn)生中的表達(dá)變化, 并用 Knockdown 和過表達(dá)鑒定它們調(diào)控炎癥效應(yīng)因子的作用。啟 動(dòng)相應(yīng)的基因剔除小鼠模型建立工作。17. 繼續(xù)研究 TLR 和 NLR 激活白介素8. 在動(dòng)物水平，初步確定 Par 復(fù)合物及結(jié)合蛋白對(duì)炎癥細(xì)胞功能的影響。9. 預(yù)期明確所鑒定的新分子及調(diào)控方式對(duì)細(xì)胞遷移的影響，并在此基 礎(chǔ)之上，確定這些信號(hào)分子對(duì)細(xì)胞遷移信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響，明確他們調(diào)控細(xì)胞信號(hào)遷移的具體機(jī)制。10. 闡明在中性粒細(xì)胞黏附和遷移過程中c-Abl 激 酶和 β2 整合素與相關(guān)蛋白作用的機(jī)制及其對(duì)功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。11. 獲得 CD18 條件性基因剔除自身免疫性疾病小鼠模型的表型、白細(xì) 胞的活化和多種炎癥因子的表達(dá)詳細(xì)數(shù)據(jù)。12. 發(fā)現(xiàn)一些新的 IP-10 等趨化因子基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制。13. 確 認(rèn) NDRG2 的基因剔除小鼠的炎癥調(diào)節(jié)變化及其意義。14. 建立 組蛋白去甲基化 酶 、上述 發(fā)現(xiàn)的重要轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 與炎癥的相關(guān)性, 證明其 causal effect, 構(gòu)建基因打靶質(zhì)粒和 ES 細(xì)胞。15. 比較說明 TLR 和 NLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在白介素－1 成熟加工中的分子機(jī)制的異同；建立所發(fā)現(xiàn)的新分子的基因剔除小鼠模型。16. 對(duì)已發(fā)現(xiàn)的先導(dǎo)化合物進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化并確認(rèn)其體內(nèi)、外藥效。定向合成200 個(gè)左右小分子化合物，充 實(shí)小分子化合物庫。完成新靶標(biāo)篩選模型的建立并 進(jìn)行篩選。17. 在國際高水平學(xué)術(shù)雜志（IF>5）上發(fā)表10 篇以上論文，申請(qǐng) 2 項(xiàng)以上相關(guān) 專利，培養(yǎng)博士研究生 10 人以上。年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)－1 成熟加工的分子機(jī)制。根據(jù) 細(xì)胞水平的功能研究結(jié)果，篩選重要新分子 進(jìn)行基因剔除小鼠模型的構(gòu)建。18. 與機(jī)體免疫反 應(yīng)密切相關(guān)的 JAK-STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、與關(guān)節(jié) 炎（OA）密切相關(guān)的 ADAMTs 開發(fā)選擇性小分子調(diào)節(jié)劑等。建設(shè)小分子化合物庫 。19. 在本項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)的有效新靶標(biāo)及建立有效篩選模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行活性篩選。第四年1. 建立 DUSP、Ets、DPK 等分子基因缺陷小鼠模型，觀察 DUSP、Ets、DPK 等基因缺陷對(duì)小鼠模型中 TLR 反應(yīng)的影響，其對(duì)內(nèi)毒素休克、EAE 、CIA 等炎癥或炎癥性自身免疫病的影響。2. 對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)單體以及復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)合其他生物物理手段研究目 標(biāo)復(fù)合物的構(gòu)象與裝配特征，初步建立分子機(jī)制模型并設(shè)計(jì)突變研究。3. 探討去甲腎上腺素對(duì)腦小膠質(zhì)細(xì)胞攝取和降解 A?42 的影響。4. 利用 ELISA 等實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，篩選能特異阻斷選凝素/SAP 蛋白復(fù)合物形成的小分子；篩選可特異阻斷選凝素活化整合素細(xì)胞通路的小分子；篩選可特異阻斷噬酸性粒細(xì)胞黏附遷移調(diào)控信號(hào)的小分子。5. 研究相關(guān)黏附分子的細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路，如鈣離子信號(hào)是否參與調(diào)控、 Slug 等轉(zhuǎn)錄因子的作用等。6. 構(gòu)建低活性整合素? 4?7 knock-in 小鼠模型。7. 利用活細(xì)胞修飾的探針測(cè)量附著在探針上的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。8. 結(jié) 合分子水平和 細(xì)胞水平研究 結(jié)果，進(jìn)一步深入探討 Par 蛋白復(fù)合物參與炎癥細(xì)胞生物學(xué)功能的分子機(jī)理。9. 以細(xì)胞遷移過程中已有的及新鑒定的關(guān)鍵分子為靶位，篩選正向或 負(fù)向調(diào)控細(xì)1. 明確 DUSP、Ets、DPK 等分子在體內(nèi)對(duì) TLR 反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用；明確DUSP、E