《生物芯片分析》PPT課件.ppt

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生物芯片(Biochip),武漢大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系趙旻,本章提綱,生物芯片簡(jiǎn)介與沿革生物芯片的分類(lèi)基因芯片基本原理、流程與應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片及應(yīng)用其它芯片技術(shù),第一節(jié)生物芯片簡(jiǎn)介與沿革,什么是生物芯片?生物芯片(Biochip)主要指通過(guò)平面微細(xì)加工技術(shù)，在固體芯片表面等載體上的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。,,芯片上每平方厘米可密集排列成千上萬(wàn)個(gè)生物分子(Microarray)，能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分，并獲取樣品中的有關(guān)信息，其效率是傳統(tǒng)檢測(cè)方法的成百上千倍。,生物芯片分析基本流程,,建立,1996年美國(guó)Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)用的生物芯片，并制作出相應(yīng)的芯片系統(tǒng)。此外，美國(guó)的Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、Incyte公司等也在積極開(kāi)展DNA芯片研究工作。近二年，摩托羅拉、惠普、IBM等跨國(guó)公司也相繼投以巨資加入生物芯片的研究開(kāi)發(fā)。,,中國(guó)在生物芯片領(lǐng)域起步較晚，我國(guó)是從一九九七年才開(kāi)始對(duì)生物芯片研究，而國(guó)外從八十年代起就開(kāi)始研制生物芯片。中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物芯片分會(huì)——國(guó)際生物芯片領(lǐng)域的第一個(gè)行業(yè)性組織2006在北京成立。中國(guó)在北京、上海、陜西、天津、南京建立了五大生物芯片研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化基地。我國(guó)生物芯片產(chǎn)業(yè)尚未形成統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，不規(guī)范。在產(chǎn)品認(rèn)證認(rèn)可方面也存在與國(guó)際慣例不接軌的情況。,第二節(jié)生物芯片的分類(lèi),一般分類(lèi),,,根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類(lèi)：信息生物芯片和功能生物芯片,第三節(jié)基因芯片——基本原理、流程與應(yīng)用,本節(jié)內(nèi)容提要,1.簡(jiǎn)介2.圖像處理與數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化3.基因芯片的數(shù)據(jù)分析4.芯片工具&數(shù)據(jù)庫(kù),簡(jiǎn)介,基因芯片(Genechip)技術(shù)是指通過(guò)微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過(guò)高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及檢測(cè)等研究的技術(shù)。,基因芯片發(fā)展歷史,,Southern&NorthernBlot,,,DotBlot,Macroarray,Microarray,,,,,,基因芯片,1.根據(jù)免疫測(cè)定的(immunoassay)的方法予以改進(jìn)2.高通量、點(diǎn)陣以及Northern雜交3.同時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)情況4.芯片的體積非常小：微量樣品的檢測(cè)5.基因表達(dá)情況的定量分析,基因芯片的原理,依據(jù)雙螺旋原理，核酸分子雜交技術(shù)，在靶標(biāo)樣品與探針之間進(jìn)行選擇性反應(yīng)，將反應(yīng)一方(探針)固定在芯片上，另一方(熒光標(biāo)記,即制備好的cDNA，分別標(biāo)記綠色的Cy3和紅色的Cy5)通過(guò)流路或加至芯片上。,核酸雜交,RNA,DNA1,DNA2,Probe,Southernhybridization,Northernhybridization,,,,,,,JuangRH(2004)BCbasics,基因芯片的密度：100-1millionDNA探針/1cm2,將樣品中的DNA/RNA表上熒光標(biāo)記，則可以定量檢驗(yàn)基因的表達(dá)水平,堿基互補(bǔ),基因芯片流程,樣品制備,芯片制備,,,雜交,雜交信號(hào)檢測(cè),數(shù)據(jù)分析,,,,,實(shí)驗(yàn)流程,,,,,基因表達(dá)情況的定量測(cè)定,1.發(fā)現(xiàn)在特定生長(zhǎng)時(shí)期，或者隨著環(huán)境變化，那些基因的表達(dá)收到誘導(dǎo)或者抑制2.在相同條件下，上調(diào)或者下調(diào)變化規(guī)律相似的基因，可能具有功能上的關(guān)聯(lián)3.可以從共表達(dá)的基因中尋找調(diào)控模體4.基因表達(dá)的模式可以用來(lái)表征異常的細(xì)胞調(diào)控，例如，癌癥的診斷,基因芯片分類(lèi),按芯片制備方法分類(lèi)原位合成芯片（syntheticgenechip）DNA微陣列芯片（DNAmicroarray）按探針?lè)诸?lèi)寡核苷酸陣列（芯片）DNA陣列基因芯片cDNA芯片RNA芯片,,ComparisonofDNAChipTechnologies,SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise),Oligo-ChipcDNA-ChipGenomicChip8nor20n50,000n,sequencing,expression,expression,genomicanalysis,,基因芯片技術(shù)的類(lèi)型,按技術(shù)手段、探針類(lèi)型分類(lèi)1.Shortoligonucleotidearrays(Affymetrix)2.cDNAarrays(Brown/Botstein)3.Longoligoarrays(Agilent)4.Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)按實(shí)驗(yàn)要求分類(lèi)1.單通道(SingleChannel):一次檢驗(yàn)一種狀態(tài)2.雙通道(DualChannel):差異表達(dá)基因的篩選,,1片上原位合成寡核苷酸點(diǎn)陣芯片（ONA）2微量點(diǎn)樣技術(shù)制作的CDNA點(diǎn)陣芯片（CDA）ONA特點(diǎn)：（1）易尋址，利用組合化學(xué)的原理安排各寡核苷酸的位點(diǎn)，芯片反應(yīng)后易尋址；（2）點(diǎn)位牢固，用表面化學(xué)方法處理基片(玻璃、硅片、尼龍片)，使核苷酸固定在基片上；（3）定點(diǎn)合成，光導(dǎo)向平板印刷技術(shù)，芯片表面可用屏蔽物屏蔽，光照選擇性脫保護(hù)，有利于定點(diǎn)合成寡核苷酸中的各個(gè)堿基；目前技術(shù)：1.6cm2；40萬(wàn)個(gè)點(diǎn)；20個(gè)核苷酸；,兩類(lèi)主流的DNA芯片,1.cDNAmicroarrays:將500~5,000bp的cDNA固載到介質(zhì)上(例如玻璃)，Stanford開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)，通常為雙通道2.DNAchips:將寡核苷酸探針(20~80-mer)合成到芯片上，Affymetrix開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)，通常為單通道,(1)cDNAmicroarrays,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,cDNAclones,,,Robotspotter,普通的蓋玻片,cDNAmicroarrays的制備,差異表達(dá)基因的篩選,Treatment/controlNormal/tumortissueBrain/liver…,,點(diǎn)樣后的cDNAMicroarrays,,Genes,mRNAsamples,GeneexpressionlevelofgeneiinmRNAsamplej,,=,Log(Redintensity/Greenintensity),Log(Avg.PM-Avg.MM),sample1sample2sample3sample4sample5…10.460.300.801.510.90...2-0.100.490.240.060.46...30.150.740.040.100.20...4-0.45-1.03-0.79-0.56-0.32...5-0.061.061.351.09-1.09...,,,,,,基因表達(dá)的數(shù)據(jù),,(1)DNAchips,DNAchips的制備：Affymetrixphotolitography,探針長(zhǎng)度：25bp每個(gè)基因：22-40個(gè)探針PerfectMatch(PM)vs.MisMatch(MM)probes,點(diǎn)樣后的Genechip,總結(jié),,,,,,基因芯片的實(shí)驗(yàn)流程,2.圖像處理與數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,單通道基因芯片white(veryhigh)red(high)Yellow(alittlehigh)green(medium)blue(low)black(no),,圖像處理,植根區(qū)域生長(zhǎng)法(SRG),FixedCircle,柵格化：確定點(diǎn)的位置圖象分割(Segmentation)：將點(diǎn)從背景中分離出來(lái)。抽提亮度：各個(gè)像素亮度的平均值(mean)或中位數(shù)(median)背景校正：局部或全局,基因表達(dá)量的定量,對(duì)于每個(gè)點(diǎn)，我們可以計(jì)算Redintensity=Rfg-Rbgfg=foreground,bg=background,andGreenintensity=Gfg-Gbgandcombinetheminthelog(base2)ratioLog2(Redintensity/Greenintensity)Greenintensity(medium):~1,,Microarray:誤差的來(lái)源,系統(tǒng)的隨機(jī)的,,,logsignalintensity,logRNAabundance,,Microarray:誤差的來(lái)源,1.圖像分析2.掃描3.DNA雜交過(guò)程，溫度、時(shí)間、混合均勻程度等4.探針的標(biāo)記5.RNA的抽提6.加樣7.其他,,,Red/green比值存在亮度的傾向,,,,,,,M=log2R/G=log2R-log2G,=(log2R+log2G)/2,Valuesshouldscatteraboutzero.,,數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,before,after,3.基因芯片的數(shù)據(jù)分析,(1)差異表達(dá)基因的分析(2)基因共表達(dá)分析(3)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類(lèi)(4)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分類(lèi)(5)MaptoGO(6)Generegulatorynetwork,(1)差異表達(dá)基因的分析,1.差異表達(dá)基因的分析:尋找處理前后表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)的基因2.Arethetreatmentsdifferent?3.使用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)(t-testorf-test)，發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)顯著性差異表達(dá)的基因，4.如果處理本身并不顯著，則結(jié)果無(wú)意義,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,1.Foldchange,一般2-foldincreaseordecrease(平行實(shí)驗(yàn)的樣本較少)2.p-value(平行實(shí)驗(yàn)的樣本較多),P-value:學(xué)生分布,1.T-test:學(xué)生分布2.Excel函數(shù)：TTEST(array1,array2,tails,type)Array1為第一個(gè)數(shù)據(jù)集Array2為第二個(gè)數(shù)據(jù)集Tails指示分布曲線的尾數(shù)。如果tails=1，函數(shù)TTEST使用單尾分布。如果tails=2，函數(shù)TTEST使用雙尾分布Type為t檢驗(yàn)的類(lèi)型1成對(duì)2等方差雙樣本檢驗(yàn)3異方差雙樣本檢驗(yàn),P-value:學(xué)生分布,1.一般選擇雙尾分布2.異方差雙樣本檢驗(yàn)3.Excel函數(shù)：=TTEST(B2:D2,E2:G2,2,3)4.C：對(duì)照組；T：實(shí)驗(yàn)組,MultipleComparisons,1.在基因芯片的實(shí)驗(yàn)中，每一個(gè)基因/探針，都是一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)2.基因芯片：高通量，>1,000個(gè)基因/探針3.因此，無(wú)論怎么比較，總會(huì)有一些基因會(huì)是統(tǒng)計(jì)顯著性差異表的——可能是隨機(jī)產(chǎn)生的4.如何評(píng)估表達(dá)差異基因預(yù)測(cè)的有效性？5.例：1,000個(gè)探針的雙通道芯片，以p-value<0.01為域值，發(fā)現(xiàn)7個(gè)上調(diào)基因，5個(gè)下調(diào)基因，分析結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義？,FalseDiscoveryRate(FDR),1.Falsepositiveprediction:“Type1error"or"FalseDiscovery"2.FalseDiscoveyRate(FDR)=p-value*No.ofGenes上例：FDR=0.01*1,000=10(隨機(jī))7個(gè)上調(diào)基因，5個(gè)下調(diào)基因<10因此上例計(jì)算的結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3.FDR必須遠(yuǎn)小于發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因數(shù)目實(shí)驗(yàn)的有效性p-value的選擇,(2)基因共表達(dá)分析,1.在N個(gè)不同的條件下(時(shí)間序列的芯片數(shù)據(jù))，考察基因X和Y的表達(dá)是否相似2.Gene1#是否與Gene2#、Gene3#和Gene4#共表達(dá)？3.共表達(dá)：正相關(guān)：相似的表達(dá)譜，可能存在正關(guān)聯(lián)負(fù)相關(guān)：相反的表達(dá)譜，可能存在負(fù)調(diào)控,EisenMB,etal.,(1998)PNAS95:14863-14868,沒(méi)有相關(guān)性？,基因相關(guān)性分析,1.Spearmanrankcorrelation2.Kendallstau3.Euclideandistance4.Pearsoncorrelationcoefficient:-1~1Excel函數(shù)：=PEARSON(array1,array2),EisenMB,etal.,(1998)PNAS95:14863-14868,Pearson相關(guān)系數(shù),1.r~[-1,1]r~1，正相關(guān)r~-1，負(fù)相關(guān),結(jié)論：Gene1#與Gene2#表達(dá)正相關(guān)，與Gene3#表達(dá)負(fù)相關(guān)，與Gene4#無(wú)關(guān)聯(lián),(3)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類(lèi),1.將表達(dá)譜相似的基因聚類(lèi)在一起2.無(wú)督導(dǎo)學(xué)習(xí)(unsupervisedlearning)3.Patternfinding:發(fā)現(xiàn)新的模式4.聚類(lèi)方法：A.HierarchicalclusteringB.K-meansclustering,HierarchicalClustering,Hierarchicalclustering,1.用樹(shù)狀結(jié)構(gòu)來(lái)表征基因表達(dá)之間的相似性/相關(guān)性2.優(yōu)點(diǎn)：不需要指定結(jié)果有多少類(lèi),,Distancematrix,,K-meansclustering,1.對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)2.必須給定結(jié)果分成多少類(lèi)！3.假設(shè)，該例中，指定為聚成5類(lèi),K-meansclustering,1.隨便選取5個(gè)點(diǎn)，作為每一個(gè)類(lèi)的中心點(diǎn),K-meansclustering,2.計(jì)算其他點(diǎn)與這5個(gè)中心點(diǎn)的距離距離：歐氏距離馬氏距離皮爾孫相關(guān)系數(shù)…點(diǎn)的歸類(lèi)：離哪個(gè)中心點(diǎn)近，歸哪個(gè)類(lèi),K-meansclustering,3.針對(duì)每一類(lèi)中的每一個(gè)點(diǎn)，計(jì)算其與其他點(diǎn)的距離，加和，除以該類(lèi)點(diǎn)的數(shù)目；找到新的中心點(diǎn)，即改點(diǎn)到該類(lèi)中其他點(diǎn)的平均值最小；確定新的5個(gè)中心點(diǎn)！,K-meansclustering,4.重復(fù)2,3，直到結(jié)果收斂實(shí)際操作時(shí)，因結(jié)果完全收斂時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一般指定迭代的次數(shù)，如1,000次,K-meansclustering,5.最終結(jié)果：所有基因芯片數(shù)據(jù)被聚成5類(lèi)軟件：Cluster3.0,MichaelEissen,Stanford,(4)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分類(lèi),1.根據(jù)基因表達(dá)的數(shù)據(jù)將樣本分成兩類(lèi)或多類(lèi)；2.督導(dǎo)學(xué)習(xí)(supervisedlearning)：根據(jù)發(fā)現(xiàn)的pattern進(jìn)行預(yù)測(cè)3.應(yīng)用：癌癥vs.正常組織癌癥的亞型、不同階段(良性的vs.惡性的)對(duì)藥物的敏感性(tamoxifenforbreastcancer),DiffuselargeB-celllymphoma(DLBCL),1.通過(guò)聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)各種亞型之間的關(guān)系2.根據(jù)基因表達(dá)模式，能夠預(yù)測(cè)新的基因表達(dá)樣本,(5)MaptoGO,1.通過(guò)基因芯片，找到了一批“interesting”的基因2.生物學(xué)功能上是否存在關(guān)聯(lián)？某種功能是否顯著？3.GeneOntology+超幾何分布,GOToolBox,(6)Generegulatorynetwork,1.早期觀點(diǎn)：表達(dá)譜相似的基因可能存在功能上的關(guān)聯(lián)，可能相互作用…(直接作用)2.當(dāng)前的觀點(diǎn)：表達(dá)譜相似的基因可能具有共同的調(diào)控元件(基因UTR區(qū)域存在共同的Promotor),能夠被同一個(gè)上游因子所調(diào)控,相關(guān)系數(shù)：基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),ERL2,SKP1,Unknown,ChS1,Wild-type,Mutant,1.與光合效率和氣孔發(fā)育相關(guān)的基因：ERL2A.在Wild-type中與之顯著相關(guān)，但在Mutant中顯著不相關(guān)的基因,相關(guān)系數(shù)：基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),4.Microarray:工具&數(shù)據(jù)庫(kù),GEO-NCBI,ArrayExpress-EMBL,SMD-Stanford,芯片技術(shù)的應(yīng)用,1基因表達(dá)分析：分析基因表達(dá)時(shí)空特征檢測(cè)基因差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)新基因大規(guī)模測(cè)序,,DNA序列測(cè)定：雜交測(cè)序：sequencingbyhybridization,SBH建立在特定序列的DNA與特定長(zhǎng)度的寡核苷酸集合的雜交的基礎(chǔ)之上。未知DNA序列可以通過(guò)鑒定與靶DNA序列形成完整的雙鏈體寡核苷酸的重疊區(qū)域來(lái)確定；65536個(gè)八核苷酸點(diǎn)陣可測(cè)定約200個(gè)核苷酸的序列；一百萬(wàn)個(gè)十二核苷酸點(diǎn)陣可測(cè)定約1000個(gè)堿基對(duì)。,,2基因型、基因突變和多態(tài)性分析分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系3疾病的診斷與治療遺傳病相關(guān)基因的定位:產(chǎn)前篩查與診斷腫瘤診斷感染性疾病的診斷基因突變檢測(cè)與遺傳病和腫瘤診斷大量平行測(cè)定。,,4.藥物研究中的應(yīng)用新藥開(kāi)發(fā)發(fā)現(xiàn)藥物的新功能調(diào)查藥物處理細(xì)胞后基因的表達(dá)情況對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)，毒性對(duì)基因的影響。,,其它：病原體的檢出腫瘤相關(guān)基因表達(dá)譜位點(diǎn)突變耐藥基因檢測(cè)疾病的分子分型HLA分型,,細(xì)胞凋亡PCR芯片細(xì)胞周期PCR芯片血管生成PCR芯片腫瘤轉(zhuǎn)移PCR芯片癌通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片DNA損傷信號(hào)通路PCR芯片氧化應(yīng)激與抗氧化PCR芯片應(yīng)激和毒性通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片腫瘤藥物耐受和代謝PCR芯片細(xì)胞因子PCR芯片,乳腺癌和雌激素受體信號(hào)通路PCR芯片藥物代謝PCR芯片內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能研PCR芯片骨再生PCR芯片干細(xì)胞PCR芯片動(dòng)脈粥樣硬化PCR芯片糖尿病PCR芯片趨化因子與受體PCR芯片,,生長(zhǎng)因子PCR芯片炎癥細(xì)胞因子與受體PCR芯片干擾素及其受體PCR芯片Th1-Th2-Th3PCR芯片Toll樣蛋白受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)PCR芯片細(xì)胞外基質(zhì)與粘連分子PCR芯片神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素與受體PCR芯片低氧信號(hào)通路PCR芯片,,胰島素信號(hào)通路PCR芯片JAK/STAT信號(hào)通路PCR芯片MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PCR芯片NF-kB信號(hào)通路PCR芯片一氧化氮PCR芯片Notch信號(hào)通路PCR芯片信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片TGFb/BMP信號(hào)通路PCR芯片TNF配體及受體PCR芯片Wnt信號(hào)通路PCR芯片管家PCR芯片,第四節(jié)蛋白質(zhì)芯片,,蛋白質(zhì)芯片：又稱(chēng)為蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列（proteinmicroarray）蛋白質(zhì)芯片是指在固相支持物上有序排列的各自獨(dú)立的多肽、蛋白或相應(yīng)配體，利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與RNA，或與其它配體間的相互作用，同時(shí)平行分析大量蛋白質(zhì)的生物化學(xué)性質(zhì)，在蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)研究以及臨床診斷、藥物研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品衛(wèi)生等方面有廣闊的應(yīng)用前景。,,是指以蛋白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來(lái)分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。,,根據(jù)其固定生物分子的不同，可以分為受體配體檢測(cè)芯片，抗原芯片，抗體芯片等。根據(jù)芯片載體的不同，分為普通玻璃載玻片，多孔凝膠覆蓋芯片和微孔芯片3種主要形式。應(yīng)用最普遍的是玻璃片，另外PVDF膜，聚丙烯酰氨凝膠，硝化纖維素膜，聚苯乙烯微珠，磁性微珠等對(duì)最普遍應(yīng)用的玻璃片而言，用于制備蛋白質(zhì)芯片的方法主要有戊二醛修飾法、聚賴(lài)氨酸修飾法、巰基修飾法和多糖修飾法等。,InteractionArrays——ProteinsonChip-LabelledSampleCaputureArrays——AntibodyonChip-LabelledSampleμELISAonArray——MiniaturisedSandwichAssaysReversedPhasedArrays——MultitudeofarrayedSamples,InteractionArrays,-Cloningandexpressionof6600yeastprotein-Complexarraysforprotein-proteininteractionstudiesZhuetal.(2001)Science.293,2101,CaptureArrays,SAMPLEARRAYSReversePhaseScreen,ANTIBODYARRAYSSampleLabellingApproaches,ANTIBODYARRAYSMutiplexedSandwichELISAs,,,,,,,,,SandwichImmunoassays,highlyparallelhighsensitivityexpensiveequipmentlabourintenseautomationdifficult,,,,,,,ReversePhaseProteinMicroarrays,YYYYYY,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ForwardPhaseDetectionAntigen,ReversePhaseDetection,CaptureMolecules,ImmobilizedAntigen,CaptureMolecules,,,,YYYY,,,,蛋白質(zhì)芯片的核心技術(shù)是蛋白芯片的制備和反應(yīng)信號(hào)的檢測(cè)分析。因此蛋白質(zhì)的純度；蛋白質(zhì)的固定是蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。由于蛋白質(zhì)分子的活性依賴(lài)于不同的折疊方式，因此對(duì)芯片的表面修飾至關(guān)重要，要保證被點(diǎn)在芯片上的蛋白質(zhì)不失活而又能牢固的固定在芯片上。,蛋白質(zhì)芯片的原理,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)主要包括四個(gè)基本要點(diǎn):芯片陣列的構(gòu)建樣品的制備芯片生化反應(yīng)信號(hào)檢測(cè)及分析,,首先將蛋白按設(shè)計(jì)的陣列方式點(diǎn)印在介質(zhì)上，樣品蛋白質(zhì)與芯片反應(yīng)，然后用經(jīng)過(guò)標(biāo)記的（可以是酶、熒光、同位素、生物素等）蛋白質(zhì)與芯片-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡和CCD照相機(jī)對(duì)標(biāo)記信號(hào)進(jìn)行掃描分析。聯(lián)合應(yīng)用雙向凝膠電泳，表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）或串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）還可以對(duì)蛋白分子進(jìn)行定量分析。,,,提出生物學(xué)問(wèn)題（實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?樣品預(yù)處理（重組蛋白，制備一、二級(jí)抗體，熒光標(biāo)記）,生化反應(yīng)化學(xué)偶合，加底物，反應(yīng)溫度和時(shí)間，沖洗條件,檢測(cè)（熒光和比色掃描或拍照，參數(shù)設(shè)置）,數(shù)據(jù)分析和建模圖象量化，標(biāo)準(zhǔn)化建立模型）,1,2,3,4,5,蛋白質(zhì)芯片制備,6,蛋白質(zhì)芯片的分類(lèi),,蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片,蛋白質(zhì)功能芯片,與基因芯片的比較：,蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物,接近生命活動(dòng)的物質(zhì)層面；探針蛋白特異性高、親和力強(qiáng),可簡(jiǎn)化樣品前處理，甚至可直接利用生物材料(血樣、尿樣、細(xì)胞及組織等)進(jìn)行檢測(cè)；適合高通量篩選與靶蛋白作用的化合物；有助于了解藥物或毒物與其效應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。,Proteinchip的應(yīng)用（理論上）,Diagnosticimmunoassaysimultaneoushigh-throughputanalysisofknownauto-antigens.Protein-ProteinInteraction.DNA-ProteinInteraction,Proteinchip的應(yīng)用(具體的),微生物感染－病原體抗原、抗體的檢測(cè)自身抗體的檢測(cè)特定蛋白的檢測(cè)HLA分型過(guò)敏原檢測(cè)腫瘤標(biāo)志的檢出,第五節(jié)組織芯片技術(shù),組織芯片的優(yōu)點(diǎn),高通量——短時(shí)（一次即獲大量信息）、高效（成百成千倍地提高效率）,僅2CM2,含數(shù)十甚至數(shù)百例組織樣本，一次操作即可完成普通實(shí)驗(yàn)所需的數(shù)十甚至數(shù)百次操作。,有助于減少實(shí)驗(yàn)誤差——實(shí)驗(yàn)條件保持一致,便于設(shè)置各種實(shí)驗(yàn)對(duì)照,費(fèi)用僅1/10-1/100,六個(gè)月——一年,一周,幾萬(wàn)——幾十萬(wàn),一次一張玻片,上百個(gè)單位的珍貴試劑,一個(gè)單位的試劑,幾十次——上百?gòu)埐Ｆ?只需1/10︱1/100,組織芯片（意義）,對(duì)人類(lèi)基因組學(xué)、后基因組學(xué)的深入研究與發(fā)展特別表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：研究特定基因及其所表達(dá)的蛋白質(zhì)與疾病之間的相互關(guān)系疾病的分子診斷預(yù)后指標(biāo)的確定治療靶點(diǎn)的定位治療過(guò)程的追蹤與預(yù)測(cè)抗體和新藥物的開(kāi)發(fā)和篩選基因治療的研發(fā)等方面,廣闊的應(yīng)用前景,組織芯片（國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀）,國(guó)外起步階段組織獲取難產(chǎn)品數(shù)量少價(jià)格高、品種單一尚缺通行的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)種族差異實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無(wú)法共享該技術(shù)的廣泛應(yīng)用受阻礙,中國(guó)剛剛起步進(jìn)展迅速組織學(xué)、遺傳學(xué)資源極其豐富國(guó)家重視科技部將組織芯片技術(shù)列為“十五”國(guó)家863技術(shù)攻關(guān)開(kāi)發(fā)重大項(xiàng)目,組織芯片庫(kù)的構(gòu)建,IHC流程圖,組織芯片,脫蠟水化,抗原修復(fù),內(nèi)酶封閉,位點(diǎn)封閉,加入一抗,加入二抗,,,,,,,,DAB顯色,二甲苯、酒精,,高壓、微波、煮沸、酶消化,,內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,,非特異性位點(diǎn),,內(nèi)源性生物素,,洗滌,,,洗滌,復(fù)染、脫水、透明、封片、閱片,,IHC,ISH流程圖,組織芯片,脫蠟水化,微波處理,胃酶消化,加預(yù)雜交液,進(jìn)行雜交,封閉,,,,,,,,顯色,二甲苯、酒精,,非特異性位點(diǎn),洗滌,,,洗滌,脫水、透明、封片、閱片,,,,insituhybridization,FISH流程圖,組織芯片,脫蠟水化,蛋白酶K消化,變性,D標(biāo)探針雜交,FITC抗地高辛,,,,,,,顯色,二甲苯、酒精,,洗滌,,,洗滌,封片、閱片,,,洗滌,IS-PCR流程圖,組織芯片,脫蠟水化,蛋白酶K消化,RNase處理,原位擴(kuò)增,原位雜交,,,,,,,,NBT-BCIP顯色,二甲苯、酒精,,洗滌,,,洗滌,脫水、透明、封片、閱片,,Primer底物DNA聚合酶,,堿磷酶標(biāo)抗D,,洗滌,insituPCRonslides,藥物篩選流程,theend,,