細胞培養(yǎng)基本方法(復蘇、換液、傳代、凍存).ppt

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1 細胞培養(yǎng) 2 一原代培養(yǎng) 略 3 二 傳代培養(yǎng) 準備及注意事項換液傳代凍存復蘇MTT 4 準備事項 紫外燈照射細胞室30分鐘 風機運行10分鐘后方可進入實驗室 穿專用的口罩 帽子 拖鞋 工作衣等 帶手套 并用酒精擦拭之 準備好實驗必需用品 超凈工作臺內(nèi)操作前用酒精棉球擦拭臺面 超凈工作臺內(nèi)操作完成后 要用酒精棉球擦拭臺面 除了酒精燈 鑷子 試管架等物品外 其他都要拿出工作臺外 紫外燈照射30分鐘 5 換液 把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出 擰緊蓋子 觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色 是否渾濁等 放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況 放入超凈工作臺內(nèi) 點燃酒精燈 拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上 至少三秒 取下蓋子 燒瓶口 倒掉培養(yǎng)基 燒瓶口 拿出PBS液瓶子 燒瓶口和鑷子 用鑷子將塞子取出 燒瓶口 至少10圈 6 6 用吸管吸取3ml的PBS 打入培養(yǎng)瓶內(nèi) 燒培養(yǎng)瓶口 來回晃動PBS100次后到掉PBS 重復此操作一次 7 拿出培養(yǎng)基瓶子 燒瓶口和鑷子 用鑷子將塞子取出 燒瓶口 至少10圈 8 用吸管吸取5ml 8ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內(nèi) 燒瓶口 鑷子和蓋子 9 蓋上蓋子 倒置顯微鏡下觀察 之后標明名稱和日期 酒精棉球擦瓶口和瓶身 放入培養(yǎng)箱內(nèi)即可 注意 1 打開培養(yǎng)箱時盡量不要說話 2 步驟9中培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時 應把蓋子擰開少許 7 傳代 1 把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出 擰緊蓋子 2 觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色 是否渾濁等 放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況 3 放入超凈工作臺內(nèi) 點燃酒精燈 拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上 至少三秒 4 取下蓋子 燒瓶口 倒掉培養(yǎng)基 燒瓶口 5 拿出PBS瓶子 燒瓶口和鑷子 用鑷子將塞子取出 燒瓶口 至少10圈 8 6 用吸管吸取3ml的PBS 打入培養(yǎng)瓶內(nèi) 燒培養(yǎng)瓶口 來回晃動PBS100次后到掉PBS 重復此操作一次 7 拿出胰酶瓶子 燒瓶口和鑷子 用鑷子將塞子取出 燒瓶口 至少10圈 8 用吸管吸取1ml的胰酶 打入培養(yǎng)瓶內(nèi) 燒培養(yǎng)瓶口和蓋子 蓋上蓋子 9 拿出工作臺外 在倒置顯微鏡下觀察細胞 然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身 放入培養(yǎng)箱內(nèi) 5分鐘后取出 9 10 在倒置顯微鏡下觀察細胞的消化情況 若細胞變成單個圓形 則可進行傳代 11 拿到工作臺內(nèi) 燒瓶口 取下蓋子 燒瓶口 用吸管吸出胰酶 燒瓶口 12 拿出培養(yǎng)基瓶子 燒瓶口和鑷子 用鑷子將塞子取出 燒瓶口 至少10圈 13 用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內(nèi) 用吸管吹打成單個細胞懸液 計數(shù) 分裝即可 10 凍存 1 把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出 擰緊蓋子 2 觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色 是否渾濁等 放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況 3 放入超凈工作臺內(nèi) 點燃酒精燈 拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上 至少三秒 4 取下蓋子 燒瓶口 倒掉培養(yǎng)基 燒瓶口 5 拿出PBS瓶子 燒瓶口和鑷子 用鑷子將塞子取出 燒瓶口 至少10圈 11 6 用吸管吸取3ml的PBS 打入培養(yǎng)瓶內(nèi) 燒培養(yǎng)瓶口 來回晃動PBS100次后到掉PBS 重復此操作一次 7 拿出胰酶瓶子 燒瓶口和鑷子 用鑷子將塞子取出 燒瓶口 至少10圈 8 用吸管吸取1ml的胰酶 打入培養(yǎng)瓶內(nèi) 燒培養(yǎng)瓶口和蓋子 蓋上蓋子 9 拿出工作臺外 在倒置顯微鏡下觀察細胞 然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身 放入培養(yǎng)箱內(nèi) 5分鐘后取出 10 在倒置顯微鏡下觀察細胞的消化情況 若細胞變成單個圓形 則可進行傳代 12 11 拿到工作臺內(nèi) 燒瓶口 取下蓋子 燒瓶口 用吸管吸出胰酶 燒瓶口 12 拿出培養(yǎng)基瓶子 燒瓶口和鑷子 用鑷子將塞子取出 燒瓶口 至少10圈 13 用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內(nèi) 用吸管吹打成單個細胞懸液 14 用吸管將細胞懸液移至5ml離心管中 蓋上蓋子 在離心機內(nèi)離心 1500轉 分鐘 時間為15分鐘 15 離心結束后 拿至工作臺內(nèi) 燒離心管口 去掉塞子 燒管口 13 16 棄上清液 加凍存液2ml吹打 使細胞均勻混在凍存液中 再加3ml凍存液 用吸管吸出打入多個凍存管中 每管1 5ml 17 蓋上蓋子 用封口膜封好 標上細胞名稱和日期 18 凍存方式 4 30分鐘 20 15分鐘 80 60分鐘 最后轉移到液氮罐內(nèi) 注意 凍存管移動時要夾在冰塊中間 14 復蘇 1 取一敞口瓶 內(nèi)裝蒸餾水 放入電熱恒溫水槽中 溫度設置為39 0 2 等達到39 0 30分鐘后 用鑷子將欲復蘇的細胞從液氮管中取出 快速放入敞口瓶內(nèi) 晃動 使凍存管內(nèi)完全液化 3 用酒精擦拭凍存管 放入工作臺內(nèi) 4 用鑷子將封口膜夾掉 輕燒管口 5 用吸管吸出凍存管內(nèi)的細胞懸液 打入已裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi) 15 6 燒瓶口 鑷子和蓋子 蓋上蓋子 在倒置顯微鏡下觀察 7 用酒精棉球擦瓶口及瓶身 放入培養(yǎng)箱內(nèi) 注意 步驟2中 蒸餾水不要沒過凍存管口所有步驟結束過24小時后一定要換液 16 MTT法 1 實驗開始前 96孔板應在超凈臺紫外燈下照射2個小時以上 2 從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)瓶 觀察 加PBS 加胰酶消化 加培養(yǎng)基 計數(shù) 方法及步驟同傳代1 13步 3 加培養(yǎng)基 調(diào)整細胞濃度為10000個 200 l 4 加到96孔板內(nèi) 每板6行8列共48孔 每孔200 l 5 蓋上96孔板的蓋子 拿出工作臺 倒置顯微鏡下觀察 標明名稱 序號和日期 17 6 用酒精棉球擦板 放入培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)24小時 7 從培養(yǎng)箱中取出 鏡下觀察 拿到工作臺內(nèi) 用200 l的槍將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出 8 加入不同濃度的藥物的無血清培養(yǎng)基 每孔200 l 9 蓋上96孔板的蓋子 拿出工作臺 倒置顯微鏡下觀察 用酒精棉球擦板 放入培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)24小時 10 從培養(yǎng)箱中取出 鏡下觀察 拿到工作臺內(nèi) 每孔加MTT液20 l 18 11 蓋上96孔板的蓋子 拿出工作臺 倒置顯微鏡下觀察 用酒精棉球擦板 放入培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)4小時 12 取出96孔板 倒掉孔內(nèi)的液體 每孔加DMSO150 l 放入酶標儀內(nèi) 振蕩600秒 讀數(shù)即可 注意 本實驗以CHL細胞為例 加DMSO時 帶口罩和手套 放入酶標儀內(nèi)時 96孔板勿蓋蓋子 多重復幾次 19 溶液的配制 PBSRPMI1640培養(yǎng)基消化液凍存液清潔液MTT其它溶液 20 PBS配制 之后 加1000ml三蒸水 調(diào)節(jié)PH值在7 2 7 4之間 高壓121 30分鐘 4 備用 21 RPMI1640培養(yǎng)基的配制 取一小袋1640培養(yǎng)粉 加高壓過的三蒸水800ml 在1000ml的燒杯中用玻璃棒攪拌溶解 加碳酸氫鈉2 0g 再加三蒸水定容至1000ml 加青霉素 100U ml 鏈霉素 100 g ml 在超凈工作臺內(nèi)過濾除菌 分裝成180ml 20 備用 注意燒杯要泡過酸 并在紫外線下照射至少30分鐘 22 消化液的配制 稱取胰蛋白酶粉0 5克 溶入PBS緩沖液200ml 混勻 調(diào)整PH值到7 2 過濾除菌 用1 5ml的EP管分裝 20 凍存 取少許放入已培養(yǎng)的無污染的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 23 凍存液的配制 高壓過的二甲基亞砜DMSO 胎牛血清和無血清培養(yǎng)基按1 3 6的比例配制 例如配制10ml的凍存液 高壓的小瓶中加3ml過濾的胎牛血清 再加6ml培養(yǎng)基 最后加1ml的DMSO 混勻即可 24 清潔液的配制 25 一般常用次強液 新配制的清潔液為棕紅色 多次使用后 成綠色時就不能再用 需重新配制 注意 保護自己 先將重鉻酸鉀完全溶解于水中 必要時可加熱幫助溶解 然后緩慢加入濃硫酸 以免產(chǎn)生熱量太多 使容器破裂 26 噻唑藍MTT液配制 方法稱取25mgMTT 加入5mlPBS液 混勻 即成5mg ml的MTT液 用0 22 m的微孔濾器除菌 避光 4 保存一周內(nèi)使用 原理活細胞的線粒體的乳酸脫氫酶可使MTT 黃綠色 分解 產(chǎn)生蘭紫色結晶狀甲贊顆粒 積淤細胞內(nèi)和細胞周圍 其量與細胞數(shù)成正比 也與細胞活力成正比 注意MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力 不能測定細胞絕對數(shù) 27 其它溶液的配制 95 到75 的酒精的配制比例為4 1 例如 配制100ml75 的酒精 80ml95 酒精加20ml三蒸水即可 36 38 的濃HCL到5 的稀HCL的配制比例為3 17 例如 配制1000ml的5 的稀鹽酸 150ml的濃HCL加850ml的蒸餾水即可 28 細胞計數(shù) 方法吸出細胞懸液少許 滴加在蓋片邊緣 使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間 靜置三分鐘鏡下觀察 計數(shù)板四大格細胞總數(shù) 公式為 細胞數(shù) ml 四大格細胞總數(shù) 4 104個注意鏡下見有兩個以上細胞組成的細胞團 應按單個細胞計算 若細胞團數(shù)量占10 以上 重新制備細胞懸液 計數(shù)時 計左側和上方的壓線細胞 右側和下方的壓線細胞不應該計在本方格之內(nèi) 29 血清滅活 把血清置于56 的水浴鍋里待完全溶解后開始計時 30分鐘后分裝成20ml的小瓶 放 20 備用 30 實驗用品的洗滌 橡膠 塑料用品玻璃器皿 31 橡膠 塑料用品 用自來水沖洗后放入專用燒杯內(nèi) 加入蒸餾水 使之淹沒物品稍許 放在電爐上加熱 等水開時開始記時 三十分鐘后取下 倒掉燒杯內(nèi)的水 自來水沖洗3遍 蒸餾水沖洗2遍 放烤箱下層中烘干 烘干后浸泡在 鹽酸中 至少30分鐘 將鹽酸倒掉 用自來水沖洗十遍 蒸餾水沖洗三遍 放入烤箱上層烘干 烘干后放入飯盒內(nèi)高壓 之后放烤箱上層再次烘干即可使用 32 玻璃器皿 用自來水沖洗三遍 用蒸餾水洗三遍 放入烤箱下層烘干 放入清洗缸即酸缸內(nèi) 讓整個器皿沒入清洗液中 時間為過夜或者至少8個小時以上 取出器皿 用自來水沖洗十遍 再用蒸餾水沖洗三遍后 放入烤箱上層烘干 取出器皿 高壓后 放烤箱上層 再次烘干即可使用