禽源沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)技術(shù)

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ICS?65.020.30 B 41 ????? DB37 山東省地方標(biāo)準(zhǔn) DB37/T XXXXX—XXXX ????? 禽源沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)技術(shù) Rapid detection method for avian Salmonella XXXX - XX - XX發(fā)布 XXXX - XX - XX實(shí)施 山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局???發(fā)布 DB37/T XXXXX—XXXX 前??言 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。 本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。 本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、濟(jì)南百準(zhǔn)生物檢驗(yàn)有限公司、泰安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：孫淑紅、朱琦、郭龍宗、唐德宏、王方昆、唐輝、張富友、鞠孜敬、崔治中。 引??言 沙門(mén)氏菌病是由沙門(mén)氏菌所引起的急性或慢性疾病的總稱(chēng)。由雞白痢沙門(mén)氏菌所引起的稱(chēng)為雞白痢，由雞傷寒沙門(mén)氏菌引起的稱(chēng)為禽傷寒，由其他有鞭毛能運(yùn)動(dòng)的沙門(mén)氏菌所引起的禽類(lèi)疾病則統(tǒng)稱(chēng)為禽副傷寒。禽沙門(mén)氏菌病在世界各地普遍存在，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害性很大。該病同樣嚴(yán)重危害我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)?？纱怪眰鞑ズ退絺鞑ィ斐煞N蛋孵化率、雛雞成活率和雞群生產(chǎn)性能下降等問(wèn)題。當(dāng)前，我國(guó)種雞場(chǎng)主要流行的沙門(mén)氏菌血清型是B群和D群沙門(mén)氏菌。 種禽的凈化是防控該病最為有效的方法，國(guó)家為此制定了相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，頒布了GB 4789.4—2016沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)方法，但該標(biāo)準(zhǔn)缺少簡(jiǎn)便、快速的病原學(xué)PCR檢測(cè)方法和血清學(xué)ELISA檢測(cè)方法，鑒于此，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。 11 禽源沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)技術(shù) 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽源沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)和PCR檢測(cè)技術(shù)以及種雞場(chǎng)主要流行沙門(mén)氏菌（B群和D群沙門(mén)氏菌屬）血清學(xué)ELISA檢測(cè)技術(shù)。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于各種禽類(lèi)攜帶沙門(mén)氏菌的檢疫、診斷、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，也可用于規(guī)模化種雞場(chǎng)中沙門(mén)氏菌病的凈化。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB 4789.4—2016　食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品微生物學(xué)檢驗(yàn)　沙門(mén)氏菌檢驗(yàn) GB/T 6682　分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 GB/T 19495.2　轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求 GB/T 27401　實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范　動(dòng)物檢疫 NY/T 541—2016　獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范 3　 試劑和材料 3.1　 除另有規(guī)定外，所用化學(xué)試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用水均符合GB/T 6682二級(jí)水的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)中人員配置、實(shí)驗(yàn)室管理、儀器設(shè)備使用、樣品實(shí)驗(yàn)試劑和廢棄物處理等均符合GB/T 27401的規(guī)定。 3.2　 LB液體培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄A.1）。 3.3　 BPW前增菌液（見(jiàn)附錄A.2）。 3.4　 SC增菌液（見(jiàn)附錄A.3）。 3.5　 TTB增菌液（見(jiàn)附錄A.4）。 3.6　 XLD鑒別培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄A.5）。 3.7　 電泳緩沖液（見(jiàn)附錄A.6）。 3.8　 陽(yáng)性對(duì)照選擇雞白痢沙門(mén)氏菌（CVCC535）、腸炎沙門(mén)氏菌（CVCC3377）作為陽(yáng)性對(duì)照。 3.9　 陰性對(duì)照選擇不含DNA模板的滅菌超純水。 3.10　 沙門(mén)氏菌（B群和D群沙門(mén)氏菌屬）ELISA檢測(cè)試劑盒。 4　 儀器設(shè)備 4.1　 4 ℃普通冰箱（溫控范圍2 ℃～8 ℃）。 4.2　 生化培養(yǎng)箱（溫度范圍：5 ℃～50 ℃，溫度均勻度：≤1 ℃）。 4.3　 二級(jí)生物安全柜。 4.4　 PCR儀。 4.5　 電泳儀（電壓90 V～120 V）。 4.6　 控溫?fù)u床（溫度范圍：5 ℃～50 ℃）。 4.7　 凝膠成像儀。 4.8　 高壓滅菌鍋（滅菌溫度：105 ℃～135 ℃；工作壓力：≤0.35 MPa）。 4.9　 振蕩器。 4.10　 電子天平（感量0.001）。 4.11　 單道微量移液器（2 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL）。 4.12　 8或12道微量移液器（10 μL）與配套吸頭。 4.13　 酶標(biāo)儀。 5　 樣品采集、儲(chǔ)存及運(yùn)輸 5.1　 按NY/T 541—2016規(guī)定進(jìn)行采樣。無(wú)菌操作采集疑似沙門(mén)氏菌感染禽類(lèi)的糞便、臟器（勻漿）或肛拭子等，編號(hào)。 5.2　 樣品采集和樣品處理應(yīng)戴一次性手套，不得交叉污染。 5.3　 采集的樣品儲(chǔ)存和運(yùn)輸，按照NY/T 541—2016規(guī)定進(jìn)行。 6　 鑒別培養(yǎng)和PCR檢測(cè)方法 本實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)操作符合GB/T 19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求，樣品增菌培養(yǎng)方案按照GB 4789.4—2016執(zhí)行。 6.1　 鑒別培養(yǎng) 6.1.1　 按體積1:9比例，取糞便、臟器0.5 g或肛拭子等加入到4.5 mL的BPW前增菌液試管中，置于37 ℃搖床中，220 rpm 培養(yǎng)10 h～12 h。 6.1.2　 取培養(yǎng)后的前增菌液500 μL分別加入到4.5 mL SC和TTB增菌液中，置于37 ℃搖床中，220 rpm 培養(yǎng)18 h～24 h。 6.1.3　 接種針蘸取培養(yǎng)后的SC和TTB增菌液，以“之”字形劃線于XLD鑒別培養(yǎng)基平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h～48 h。 6.1.4　 雞白痢沙門(mén)氏菌形成的菌落呈無(wú)色半透明狀，其它沙門(mén)氏菌在XLD鑒別培養(yǎng)基平板上的形態(tài)一般為黑芯菌落（參見(jiàn)附錄B）。 6.1.5　 每個(gè)樣品挑取3～5個(gè)疑似菌落，分別加入500 μL～1 000 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床中，220 rpm 培養(yǎng)6 h～8 h。 6.2　 PCR的檢測(cè)方法 6.2.1　 引物 參照參考文獻(xiàn)（張江英等，2013），合成基于沙門(mén)氏菌fimW基因的一對(duì)引物作為沙門(mén)氏菌鑒定的通用引物，引物序列參見(jiàn)附錄C。 6.2.2　 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)總體積為25 μL，引物為F1/R1，模板分別為6.1.5中培養(yǎng)的菌液，PCR反應(yīng)體系參見(jiàn)附錄C。 PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃ 保存。同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照。 6.2.3　 PCR產(chǎn)物電泳 取8 μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察結(jié)果，拍照并做好試驗(yàn)記錄。 6.3　 結(jié)果判定 6.3.1　 試驗(yàn)成立條件 陰性對(duì)照及空白對(duì)照PCR產(chǎn)物電泳后，無(wú)擴(kuò)增條帶；陽(yáng)性對(duì)照PCR產(chǎn)物電泳后，在477 bp位置出現(xiàn)一條特異性的擴(kuò)增條帶，試驗(yàn)結(jié)果成立。否則試驗(yàn)不成立。（參見(jiàn)附錄D） 6.3.2　 結(jié)果判定 檢測(cè)樣品PCR產(chǎn)物電泳后，僅有大小約477 bp的特異性條帶，則PCR結(jié)果陽(yáng)性； 檢測(cè)樣品PCR產(chǎn)物電泳后，無(wú)特異性條帶，則PCR結(jié)果陰性。 7　 沙門(mén)氏菌鑒定結(jié)果 根據(jù)6.3.2的結(jié)果，PCR結(jié)果陽(yáng)性可判定為沙門(mén)氏菌陽(yáng)性；PCR陰性則判定為沙門(mén)氏菌陰性。 8　 血清ELISA檢測(cè)方法 8.1　 試劑的準(zhǔn)備 8.1.1　 底物試劑：取1片底物片放入潔凈容器中，加入5.5 mL的底物緩沖液，混合3 min直到完全溶解。 8.1.2　 洗液的配制：將一小袋洗液完全倒入1 L水中（或稱(chēng)取所需的用量，進(jìn)行對(duì)應(yīng)的稀釋?zhuān)?，使用時(shí)務(wù)必完全溶解，洗液可在4 ℃保存1個(gè)月。 8.1.3　 試劑盒其它成分可以直接使用，使用前要回溫至室溫（22 ℃～27 ℃）。 8.2　 操作過(guò)程 8.2.1　 取出包被板，記錄樣品的位置；在A1、A2位置的兩孔加入陰性對(duì)照，在A3、A4位置的兩孔加入陽(yáng)性對(duì)照。 8.2.2　 在剩余的孔內(nèi)分別加入一定量的稀釋好的被檢樣品，樣品可采用雙孔檢測(cè)也可采用單孔檢測(cè)。 8.2.3　 蓋好反應(yīng)蓋板，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)22 ℃～27 ℃孵育30 min。 8.2.4　 用300 μL～350 μL配制好的洗液洗滌板孔，重復(fù)3～5次，此步驟可用洗板機(jī)也可用手洗，最后一次洗板后將液體拍干。 8.2.5　 每孔加入100 μL酶標(biāo)二抗。蓋好反應(yīng)板，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)22 ℃～27 ℃孵育30 min。 8.2.6　 重復(fù)步驟8.2.4。 8.2.7　 每孔加入100 μL底物溶液，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)22 ℃～27 ℃避光孵育15 min。 8.2.8　 每孔加入100 μL終止液。 8.2.9　 用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度并且記錄樣品和對(duì)照的吸光度。 8.3　 結(jié)果判定 8.3.1　 試驗(yàn)成立的條件：按ELISA檢測(cè)試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。 8.3.2　 結(jié)果判定：按ELISA檢測(cè)試劑盒規(guī)定進(jìn)行。 8.3.3　 病原陰性場(chǎng)的血清學(xué)ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)附錄E。 A A 附　錄　A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基配制 A.1　 LB液體培養(yǎng)液 A.1.1　 成分 胰蛋白胨 5 g 酵母提取粉 10 g 氯化鈉 10 g 水 1 000 mL A.1.2　 制備 將各成分加入水中，攪混均勻，121 ℃高壓滅菌15 min。 A.2　 BPW前增菌液 A.2.1　 成分 蛋白胨 10.0g 氯化鈉 5.0g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O) 9.0g 磷酸二氫鉀 1.5g 水 1 000mL A.2.2　 制備 將各成分加熱溶解于1 000 mL水中，121 ℃高壓滅菌15 min備用。 A.3　 SC增菌液 A.3.1　 成分 蛋白胨 5.0g 乳糖 4.0g 亞硒酸氫鈉 4.0g 磷酸氫二鈉 10.0g L-胱氨酸 0.01g 水 1 000mL A.3.2　 制備 將各成分加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，無(wú)菌操作分裝于滅菌三角瓶或試管中備用。當(dāng)天制備當(dāng)天使用，無(wú)需高壓滅菌。 A.4　 TTB增菌液 A.4.1　 成分 蛋白胨 9.0 g 牛肉粉 4.5 g 氯化鈉 2.7 g 碳酸鈣 40.5 g 膽鹽 5.0 g 硫代硫酸鈉 50.0 g 水 1 050 mL A.4.2　 制備 將各成分溶解于1 050 mL蒸餾水中，加熱煮沸，臨用前加入20 %碘液 20 mL，0.1 % 煌綠10 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置。 A.5　 XLD鑒別培養(yǎng)基 A.5.1　 成分 酵母浸粉 3.0g L-賴(lài)氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 檸檬酸鐵銨 0.8 g 硫代硫酸鈉 6.8 g 氯化鈉 5.0 g 苯酚紅 0.08g 瓊脂 13.0g 水 1 000 mL pH 7.4+/- 0.2 25 ℃ A.5.2　 制備 將上述成分加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，冷至50 ℃左右時(shí)，傾入無(wú)菌平皿，備用。 A.6　 TAE電泳緩沖液 A.6.1　 成分 Tris-乙酸 40 mmol/L EDTA（pH 8.0） 1 mmol/L A.6.2　 制備 將50倍TAE電泳濃縮緩沖液用蒸餾水50倍稀釋即可。 B B 附　錄　B （資料性附錄） 沙門(mén)氏菌在XLD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)圖 沙門(mén)氏菌在XLD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)圖見(jiàn)圖B.1。 A B 說(shuō)明： A——有黑色中心的菌落； B——無(wú)色半透明菌落。 圖B.1　 沙門(mén)氏菌在XLD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)圖 C C 附　錄　C （資料性附錄） 引物序列和PCR反應(yīng)體系 沙門(mén)氏菌鑒定引物序列見(jiàn)表C.1。 表C.1　 沙門(mén)氏菌鑒定引物序列 引物名稱(chēng) 引物序列 片段大小 fimW F 5-AACAGTCACTTTGAGCATGGGTT-3 477bp R 5-GAGTGACTTTGTCTGCTCTTCA-3 PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表C.2。 表C.2　 PCR反應(yīng)體系 組分 體積 (mL) 水 10.5 2Mix 12.5 F1 (25 mmoL/L) 0.5 R1(25 mmoL/L) 0.5 Template 1 （菌液） Total 25 D D 附　錄　D （資料性附錄） PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖 PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖見(jiàn)圖D.1。 說(shuō)明：M為DNA Marker DL；1-5為陽(yáng)性； + 為陽(yáng)性對(duì)照；- 為陰性對(duì)照。 圖D.1　 PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖 E E 附　錄　E （資料性附錄） 血清學(xué)陽(yáng)性率標(biāo)準(zhǔn) 用于病原陰性場(chǎng)血清學(xué)ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定。 依據(jù)血清學(xué)ELISA檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性率≤3 %認(rèn)定為沙門(mén)氏菌凈化示范場(chǎng)判定標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性率≤5 %認(rèn)定為沙門(mén)氏菌凈化創(chuàng)建場(chǎng)的血清學(xué)的判定標(biāo)準(zhǔn)。 _________________________________