沙門(mén)氏菌檢測(cè).doc

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沙門(mén)氏菌檢測(cè) 1 設(shè)備和材料 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 1.1 冰箱：2℃～5℃。 1.2 恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 1.3 均質(zhì)器。 1.4 振蕩器。 1.5 電子天平：感量0.1g。 1.6 無(wú)菌錐形瓶:容量500ml，250ml。 1.7 無(wú)菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸頭。 1.8 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。 1.9 無(wú)菌試管：3mm×50mm、10mm×75mm。 1.10 無(wú)菌毛細(xì)管。 1.11 pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。 1.12 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。 2 培養(yǎng)基和試劑 2.1 緩沖蛋白胨水（BPW）：見(jiàn)附錄中1。 2.2 四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：見(jiàn)附錄中2。 2.3 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液：見(jiàn)附錄中3。 2.4 亞硫酸鉍（BS）瓊脂：見(jiàn)附錄中4。 2.5 HE瓊脂：見(jiàn)附錄中5。 2.6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：見(jiàn)附錄中6。 2.7 沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基。 2.8 三糖鐵（TSI）瓊脂：見(jiàn)附錄中7。 2.9 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑：見(jiàn)附錄中8。 2.10 尿素瓊脂（pH7.2）：見(jiàn)附錄中9。 2.11 氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄中10。 2.12 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄中11。 2.13 糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄中12。 2.14 鄰硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄中13。 2.15 半固體瓊脂：見(jiàn)附錄中14。 2.16 丙二酸鈉培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄中15。 2.17 沙門(mén)氏菌O和H診斷血清。 2.18 生化鑒定試劑盒。 3 操作方法 3.1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備 3.1.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀釋劑等移至操作室內(nèi)。準(zhǔn)備好足夠用量，避免操作中出入操作間。 3.1.2 開(kāi)啟無(wú)菌室紫外殺菌燈和潔凈工作臺(tái)的空氣過(guò)濾裝置30min。 3.1.3 操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好無(wú)菌衣、帽、口罩、手套等。? 3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作臺(tái)面，再用乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開(kāi)口處周圍，待干后用滅菌剪刀或鑷子將供試品啟封。? 3.2 前增菌 稱取25g（ml）樣品放入盛有225ml BPW的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置于盛有225ml BPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測(cè)定pH值，用1mol/ml無(wú)菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500ml錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36℃±1℃培養(yǎng)8 h～18h。如為冷凍產(chǎn)品,應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min,或2℃～5℃不超過(guò)18h解凍。 3.3 增菌 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物，移取1ml，轉(zhuǎn)種于10ml TTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18 h～24h。同時(shí)，另取1ml，轉(zhuǎn)種于10ml SC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。 3.4 分離 分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。各個(gè)平板上的菌落特征見(jiàn)表1。 表 1 沙門(mén)氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征 選擇性瓊脂平板 沙門(mén)氏菌 BS瓊脂 菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。 HE瓊脂 藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。 XLD瓊脂 菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。 沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基 按照顯色培養(yǎng)基的說(shuō)明進(jìn)行判定。 3.5 生化試驗(yàn) 3.5.1 自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門(mén)氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2。 表2 沙門(mén)氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果 三糖鐵瓊脂 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基 初步判斷 斜面 底層 產(chǎn)氣 硫化氫 K A ＋(－) ＋(－) ＋ 可疑沙門(mén)氏菌屬 K A ＋(－) ＋(－) － 可疑沙門(mén)氏菌屬 A A ＋(－) ＋(－) ＋ 可疑沙門(mén)氏菌屬 A A ＋/－ ＋/－ － 非沙門(mén)氏菌 K K ＋/－ ＋/－ ＋/－ 非沙門(mén)氏菌 注：K：產(chǎn)堿，A：產(chǎn)酸，＋：陽(yáng)性，－：陰性；＋(－)多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性；＋/－：陽(yáng)性或陰性。 3.5.2 接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí),可直接接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h，按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時(shí)復(fù)查。 表3 沙門(mén)氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表 反應(yīng)序號(hào) 硫化氫（H2S） 靛基質(zhì) pH7.2尿素 氰化鉀（KCN） 賴氨酸脫羧酶 A1 ＋ － － － ＋ A2 ＋ ＋ － － ＋ A3 － － － － ＋/－ 注：＋：陽(yáng)性，－：陰性，＋/－：陽(yáng)性或陰性。 3.5.2.1 反應(yīng)序號(hào)A1：典型反應(yīng)判定為沙門(mén)氏菌屬。如尿素、KCN 和賴氨酸脫羧酶3 項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表4可判定為沙門(mén)氏菌。如有2項(xiàng)異常為非沙門(mén)氏菌。 表4 沙門(mén)氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表 pH7.2尿素 氰化鉀（KCN） 賴氨酸脫羧酶 判定結(jié)果 － － － 甲型副傷寒沙門(mén)氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果） － ＋ ＋ 沙門(mén)氏菌IV或V（要求符合本群生化特性） ＋ － ＋ 沙門(mén)氏菌個(gè)別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果） 注：＋：陽(yáng)性，－：陰性。 3.5.2.2 反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門(mén)氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。 3.5.2.3 反應(yīng)序號(hào)A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG 陰性為沙門(mén)氏菌，同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性。甲型副傷寒沙門(mén)氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。 3.5.2.4 必要時(shí)按表5 進(jìn)行沙門(mén)氏菌生化群的鑒別。 表5 沙門(mén)氏菌屬各生化群的鑒別 項(xiàng) 目 I II III IV V VI 衛(wèi)矛醇 ＋ ＋ － － ＋ － 山梨醇 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － 水楊苷 － － － ＋ － － ONPG － － ＋ － ＋ － 丙二酸鹽 － ＋ ＋ － － － KCN － － － ＋ ＋ － 注：＋：陽(yáng)性，－：陰性。 3.5.3 如選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)3.5.1的初步判斷結(jié)果，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙海褂蒙b定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。 3.6 血清學(xué)鑒定 3.6.1 抗原的準(zhǔn)備 一般采用1.2％～1.5％瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。O血清不凝集時(shí)，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2％～3％）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌苔于1ml生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時(shí)，將菌株接種在0.55％～0.65％半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^(guò)裝有0.3％～0.4％半固體瓊脂的小玻管1 次～2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。 3.6.2 多價(jià)菌體抗原（O）鑒定 在玻片上劃出2個(gè)約1cm×2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測(cè)菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個(gè)區(qū)域下部加1滴多價(jià)菌體（O）抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對(duì)照。再用無(wú)菌的接種環(huán)或針?lè)謩e將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1 min，并對(duì)著黑暗背景進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽(yáng)性反應(yīng)。 3.6.3 多價(jià)鞭毛抗原（H）鑒定同3.6.2。 3.7 結(jié)果與報(bào)告 綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（ml）樣品中檢出或未檢出沙門(mén)氏菌。 附錄 培養(yǎng)基和試劑 1 緩沖蛋白胨水（BPW） 1.1 成分 蛋白胨 10.0g 氯化鈉 5.0g 磷酸氫二鈉（含12 個(gè)結(jié)晶水） 9.0g 磷酸二氫鉀 1.5g 蒸餾水 1000ml pH 7.2±0.2 1.2 制法 將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10 min，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，高壓滅菌121 ℃，15min。 2 四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液 2.1 基礎(chǔ)液 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 5.0g 氯化鈉 3.0g 碳酸鈣 45.0g 蒸餾水 1000ml pH 7.0±0.2 除碳酸鈣外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，再加入碳酸鈣，調(diào)節(jié)pH，高壓滅菌121℃，20 min。 2.2 硫代硫酸鈉溶液 硫代硫酸鈉（含5個(gè)結(jié)晶水） 50.0g 蒸餾水 加至100ml 高壓滅菌121℃，20 min。 2.3 碘溶液 碘片 20.0g 碘化鉀 25.0 g 蒸餾水 加至100 ml 將碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中，再投入碘片，振搖玻瓶至碘片全部溶解為止，然后加蒸餾水至規(guī)定的總量，貯存于棕色瓶?jī)?nèi)，塞緊瓶蓋備用。 2.4 0.5％煌綠水溶液 煌綠 0.5g 蒸餾水 100ml 溶解后，存放暗處，不少于1d，使其自然滅菌。 2.5 牛膽鹽溶液 牛膽鹽 10.0g 蒸餾水 100ml 加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121 ℃，20min。 2.6 制法 基礎(chǔ)液 900ml 硫代硫酸鈉溶液 100ml 碘溶液 20.0ml 煌綠水溶液 2.0ml 牛膽鹽溶液 50.0ml 臨用前，按上列順序，以無(wú)菌操作依次加入基礎(chǔ)液中，每加入一種成分，均應(yīng)搖勻后再加入另一種成分。 3 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液 3.1 成分 蛋白胨 5.0g 乳糖 4.0g 磷酸氫二鈉 10.0g 亞硒酸氫鈉 4.0g L-胱氨酸 0.01g 蒸餾水 1000ml pH 7.0±0.2 3.2 制法 除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以無(wú)菌操作加入亞硒酸氫鈉和1g/L L-胱氨酸溶液10ml（稱取0.1g L-胱氨酸，加1mol/L氫氧化鈉溶液15ml，使溶解，再加無(wú)菌蒸餾水至100ml 即成，如為DL-胱氨酸，用量應(yīng)加倍）。搖勻，調(diào)節(jié)pH。 4 亞硫酸鉍（BS）瓊脂 4.1 成分 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 5.0g 葡萄糖 5.0g 硫酸亞鐵 0.3g 磷酸氫二鈉 4.0g 煌綠 0.025g或5.0g/L水溶液5.0ml 檸檬酸鉍銨 2.0g 亞硫酸鈉 6.0g 瓊脂 18.0g～20g 蒸餾水 1000ml pH 7.5±0.2 4.2 制法 將前三種成分加入300 ml 蒸餾水（制作基礎(chǔ)液），硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20ml和30ml蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20ml和30ml蒸餾水中，瓊脂加入600ml蒸餾水中。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。冷至80 ℃左右時(shí)，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，混勻。將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，再混勻。調(diào)節(jié)pH，隨即傾入瓊脂液中，混合均勻，冷至50℃～55℃。加入煌綠溶液，充分混勻后立即傾注平皿。 注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過(guò)程中不宜過(guò)分加熱，避免降低其選擇性，貯于室溫暗處，超過(guò)48h會(huì)降低其選擇性，本培養(yǎng)基宜于當(dāng)天制備，第二天使用。 5 HE瓊脂（Hektoen Enteric Agar） 5.1 成分 蛋白胨 12.0g 牛肉膏 3.0g 乳糖 12.0g 蔗糖 12.0g 水楊素 2 .0g 膽鹽 20.0g 氯化鈉 5.0g 瓊脂 18.0g～20.0g 蒸餾水 1 000ml 0.4％溴麝香草酚藍(lán)溶液 16.0ml Andrade 指示劑 20.0ml 甲液 20.0ml 乙液 20.0ml pH 7.5±0.2 5.2 制法 將前面七種成分溶解于400 ml 蒸餾水內(nèi)作為基礎(chǔ)液;將瓊脂加入于600 ml 蒸餾水內(nèi)。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基礎(chǔ)液內(nèi),調(diào)節(jié)pH。再加入指示劑,并與瓊脂液合并,待冷至50℃～55℃傾注平皿。 注:①本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過(guò)程中不宜過(guò)分加熱，避免降低其選擇性。 ②甲液的配制 硫代硫酸鈉 34.0g 檸檬酸鐵銨 4.0g 蒸餾水 100ml ③乙液的配制 去氧膽酸鈉 10.0g 蒸餾水 100ml ④Andrade指示劑 酸性復(fù)紅 0.5g 1mol/L氫氧化鈉溶液 16.0ml 蒸餾水 100ml 將復(fù)紅溶解于蒸餾水中,加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時(shí)后如復(fù)紅褪色不全,再加氫氧化鈉溶液1ml～2ml。 6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂 6.1 成分 酵母膏 3.0g L-賴氨酸 5.0g 木糖 3.75g 乳糖 7.5g 蔗糖 7.5g 去氧膽酸鈉 2.5g 檸檬酸鐵銨 0.8g 硫代硫酸鈉 6.8g 氯化鈉 5.0g 瓊脂 15.0g 酚紅 0.08g 蒸餾水 1 000ml pH 7.4±0.2 6.2 制法 除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400ml蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600ml蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，待冷至 50℃～55℃傾注平皿。 注:本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過(guò)程中不宜過(guò)分加熱，避免降低其選擇性，貯于室溫暗處。本培養(yǎng)基宜于當(dāng)天制備，第二天使用。 7 三糖鐵（TSI）瓊脂 7.1 成分 蛋白胨 20.0g 牛肉膏 5.0g 乳糖 10.0g 蔗糖 10.0g 葡萄糖 1.0g 硫酸亞鐵銨（含6 個(gè)結(jié)晶水） 0.2g 酚紅 0.025g或5.0 g/L溶液5.0ml 氯化鈉 5.0g 硫代硫酸鈉 0.2g 瓊脂 12.0g 蒸餾水 1000ml pH 7.4±0.2 7.2 制法 除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400ml蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600ml蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，混勻，分裝試管，每管約2ml～4ml，高壓滅菌121℃10 min 或115℃ 15min，滅菌后置成高層斜面，呈桔紅色。 8 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑 8.1 蛋白胨水 蛋白胨（或胰蛋白胨） 20.0g 氯化鈉 5.0g 蒸餾水 1000ml pH 7.4±0.2 將上述成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝小試管,121℃高壓滅菌15min。 8.2 靛基質(zhì)試劑 8.2.1 柯凡克試劑：將5g對(duì)二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中,然后緩慢加入濃鹽酸25ml。 8.2.2 歐-波試劑：將1g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95％乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸20ml。 8.3 試驗(yàn)方法 挑取小量培養(yǎng)物接種,在36℃±1℃培養(yǎng)1d～2d，必要時(shí)可培養(yǎng)4d～5d。加入柯凡克試劑約0.5ml，輕搖試管,陽(yáng)性者于試劑層呈深紅色；或加入歐-波試劑約0.5ml，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面,陽(yáng)性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。 注：蛋白胨中應(yīng)含有豐富的色氯酸。每批蛋白胨買來(lái)后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。 9 尿素瓊脂（pH 7.2） 9.1 成分 蛋白胨 1.0g 氯化鈉 5.0g 葡萄糖 1.0g 磷酸二氫鉀 2.0g 0.4％酚紅 3.0ml 瓊脂 20.0g 蒸餾水 1000ml 20%尿素溶液 100ml pH 7.2±0.2 9.2 制法 除尿素、瓊脂和酚紅外，將其他成分加入400ml蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600 ml 蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑后分裝，121℃高壓滅菌15min。冷至50℃～55℃,加入經(jīng)除菌過(guò)濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2％。分裝于無(wú)菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆谩? 9.3 試驗(yàn)方法 挑取瓊脂培養(yǎng)物接種,在36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。尿素酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。 10 氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基 10.1 成分 蛋白胨 10.0g 氯化鈉 5.0g 磷酸二氫鉀 0.225g 磷酸氫二鈉 5.64g 蒸餾水 1000ml 0.5％氰化鉀 20.0ml 10.2 制法 將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，分裝后121℃高壓滅菌15min。放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻。每100ml 培養(yǎng)基加入0.5％氰化鉀溶液2.0ml（最后濃度為1:10000），分裝于無(wú)菌試管內(nèi),每管約4ml,立刻用無(wú)菌橡皮塞塞緊,放在4℃冰箱內(nèi),至少可保存兩個(gè)月。同時(shí)，將不加氰化鉀的培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基,分裝試管備用。 10.3 試驗(yàn)方法 將瓊脂培養(yǎng)物接種于蛋白胨水內(nèi)成為稀釋菌液，挑取1環(huán)接種于氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基。并另挑取1環(huán)接種于對(duì)照培養(yǎng)基。在36℃±1℃培養(yǎng)1 d～2 d，觀察結(jié)果。如有細(xì)菌生長(zhǎng)即為陽(yáng)性（不抑制），經(jīng)2d細(xì)菌不生長(zhǎng)為陰性（抑制）。 注:氰化鉀是劇毒藥,使用時(shí)應(yīng)小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應(yīng)在冰箱內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)失敗的主要原因是封口不嚴(yán),氰化鉀逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細(xì)菌生長(zhǎng)，因而造成假陽(yáng)性反應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)對(duì)每一環(huán)節(jié)都要特別注意。 11 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基 11.1 成分 蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 3.0g 葡萄糖 1.0g 蒸餾水 1000ml 1.6％溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0ml L-賴氨酸或DL-賴氨酸 0.5g/100ml 或1.0g/100ml pH 6.8±0.2 11.2 制法 除賴氨酸以外的成分加熱溶解后,分裝每瓶100ml，分別加入賴氨酸。L-賴氨酸按 0.5％加入，DL-賴氨酸按1％加入。調(diào)節(jié)pH。對(duì)照培養(yǎng)基不加賴氨酸。分裝于無(wú)菌的小試管內(nèi)，每管0.5ml，上面滴加一層液體石蠟，115℃高壓滅菌10min。 11.3 試驗(yàn)方法 從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。氨基酸脫羧酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基應(yīng)呈紫色。陰性者無(wú)堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對(duì)照管應(yīng)為黃色。 12 糖發(fā)酵管 12.1 成分 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化鈉 3.0g 磷酸氫二鈉（含12個(gè)結(jié)晶水） 2.0g 0.2％溴麝香草酚藍(lán)溶液 12.0ml 蒸餾水 1000ml pH 7.4±0.2 12.2 制法 12.2.1 葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，調(diào)節(jié)pH。按0.5％加入葡萄糖，分裝于有一個(gè)倒置小管的小試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。 12.2.2 其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后,分裝每瓶100ml，121℃高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10％溶液，同時(shí)高壓滅菌。將5ml糖溶液加入于100ml培養(yǎng)基內(nèi)，以無(wú)菌操作分裝小試管。 注：蔗糖不純,加熱后會(huì)自行水解者，應(yīng)采用過(guò)濾法除菌。 12.3 試驗(yàn)方法:從瓊脂斜面上挑取小量培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng),一般2d～3d。遲緩反應(yīng)需觀察14d～30d。 13 ONPG 培養(yǎng)基 13.1 成分 鄰硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG） 60.0mg 0.01mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5） 10.0ml 1％蛋白胨水（pH7.5） 30.0ml 13.2 制法 將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，以過(guò)濾法除菌，分裝于無(wú)菌的小試管內(nèi)，每管0.5ml，用橡皮塞塞緊。 13.3 試驗(yàn)方法 自瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物1 滿環(huán)接種于36℃±1℃培養(yǎng)1h～3h 和24h 觀察結(jié)果。如果β-半乳糖苷酶產(chǎn)生，則于1h～3h 變黃色，如無(wú)此酶則24h不變色。 14 半固體瓊脂 14.1 成分 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1.0g 氯化鈉 0.5g 瓊脂 0.35g～0.4g 蒸餾水 100ml pH 7.4±0.2 14.2 制法 按以上成分配好,煮沸溶解,調(diào)節(jié)pH。分裝小試管。121℃高壓滅菌15min。直立凝固備用。注:供動(dòng)力觀察、菌種保存、H抗原位相變異試驗(yàn)等用。 15 丙二酸鈉培養(yǎng)基 15.1 成分 酵母浸膏 1.0g 硫酸銨 2.0g 磷酸氫二鉀 0.6g 磷酸二氫鉀 0.4g 氯化鈉 2.0g 丙二酸鈉 3.0g 0.2％溴麝香草酚藍(lán)溶液 12.0ml 蒸餾水 1000ml pH 6.8±0.2 15.2 制法 除指示劑以外的成分溶解于水，調(diào)節(jié)pH，再加入指示劑，分裝試管，121℃高壓滅菌15min。 15.3 試驗(yàn)方法 用新鮮的瓊脂培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。陽(yáng)性者由綠色變?yōu)樗{(lán)色。