《期末總結》PPT課件.ppt

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1、生 物 化 學 主講教師:何海倫,本學期講授內容,第一章:糖類的結構與性質(重點) 第二章:脂類的結構與性質 第三章:氨基酸(重點) 第四章:蛋白質的結構與性質(重點) 第五章:酶(重點) 第六章:核酸化學(重點) 第七章:維生素,第一章:糖類的結構與性質,,,,一、糖類概況 二、糖的旋光性 三、單糖(結構、性質、代表性單糖及衍生物) 四、寡糖 五、復合糖(糖胺聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白) 六、糖鏈結構分析,基本概念,異構 旋光異構 差向異構 不對稱碳原子 對映體 構型 構象 異頭物 異構:化合物具有相同的分子式,但原子連接次序或原子空間排布不同。 構型:具有相同的分子式和結構式,但原子

2、在空間的排布不同,稱之構型。 旋光異構:由于存在手性碳(不對稱碳原子)而具有旋光性 差向異構體:僅有一個不對稱碳原子的構型不同,兩鏡象非對應異構物稱為差向異構體。 不對稱碳原子:與四個不同的原子或基團相連并因此失去對稱性的四面體碳。用C*表示 。,對映體 :一個不對稱碳原子的取代基在空間里的兩種取向是物體與鏡像的關系,并且兩者不能重疊。這兩種旋光異構體稱為對映體。兩個對映體具有程度相同但方向相反的旋光性(D+與L-;D-與L+)和不同的生物活性,其他物理和化學性質完全相同。含n個C*的化合物,其旋光異構體的數目是2n, 組成2n /2對對映體。 非對映體:任一旋光化合物都只有一個對映體,它的其

3、他旋光異構體在理、化性質都與之不同,不是對映體的旋光異構體稱非對映體。 差向異構體:僅一個手性碳構型不同的非對映體稱差向異構體(有幾種情況)。 異頭物 單糖由直鏈結構變成環(huán)狀結構后,羰基碳成為新的手性碳(異頭碳),導致C1差向異構化,產生兩個非對映體,稱之。、異頭物判斷:有2種方式。見P9-10。,異構,結構異構(結構式),立體異構,旋光異構(不對稱碳原子),,幾何異構(順反異構,雙鍵或環(huán)),,,糖的構型的決定,D、L構型(最遠手性碳與甘油醛比較),糖的立體結構表示,Fischer投影式(線形),Haworth式(環(huán)式),吡喃型,呋喃型,,透視式,,注意:糖的構型(D、L)與旋光方向(+、-)

4、并無直接聯(lián)系。,單糖性質,異構化(烯醇式互變),氧化,還原,成酯、成醚(酰基化、甲基化反應),形成糖苷,,糖苷(鍵):環(huán)狀單糖的半縮醛或半縮酮羥基與另一化 合物發(fā)生縮合形成糖苷;糖苷鍵有O-苷、 N-苷、S-苷等;糖苷是縮醛,無醛的性質。,變旋現象(mutarotation):一般醛類在水溶液中 只有一個比旋度,但新配制的葡萄糖水溶液的比旋隨時間而變化。 =+112 稱-D-(+)葡萄糖 =+18.7稱-D-(+)葡萄糖變旋現象將這兩種葡萄糖分別溶于水后,其旋光率都逐漸變?yōu)?52.7,這一現象稱變旋現象。 變旋是由于分子立體結構發(fā)生某種變化的結果。,旋光物質使平面偏

5、振光的偏振面發(fā)生旋轉的能力稱旋光性、光學活性或 旋光度 。 tD100 tD L C -為比旋光度,即單位濃度和單位長度下的旋光度,是特征物理常數。,重要的糖,單糖:甘油醛 、D-核糖、葡萄糖、果糖、半乳糖(結構),寡糖:蔗糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖(鍵型、還原性、旋光性),,多糖:,同多糖: 淀粉、纖維素、糖原、幾丁質,糖胺聚糖(透明質酸、硫酸角質素)、蛋白聚糖,雜多糖:,細菌多糖(肽聚糖、脂多糖、磷壁酸),,,,,糖蛋白:糖肽鍵(N、O型);糖鏈(寡糖鏈,具重要功能),,一、什么是脂質? 二、脂肪酸 三、三酰甘油

6、 四、脂質過氧化 五、磷脂 六、糖脂 七、萜和類固醇 八、脂蛋白 九、脂質的提取、分離,第二章:脂類的結構與性質,脂質的分類,化學組成,單純脂質,復合脂質,衍生脂質,,取代烴,固醇類,萜,其它,,皂化性質,可皂化脂質,不可皂化脂質,,極性,極性脂質,非極性脂質,,生物功能,儲存脂質,結構脂質,活性脂質,,脂質:是一類微溶于水而易溶于非極性溶劑的有機分子,大多數是脂肪酸和醇所形成的酯類及其衍生物。 兩親化合物:具有極性頭部(親水)和非極性尾部(親脂)的分子稱之。 必需脂肪酸:亞油酸和亞

7、麻酸對人體功能必不可少,但必須由膳食提供,稱之。 碘值: 指100g油脂鹵化時所能吸收碘的克數。 皂化值:皂化1g油脂所需的KOHmg數; 乙酰值:中和1g乙?;锼尫诺囊宜崴枰腒OHmg數; 酸值:中和1g油脂中的游離脂肪酸所需的KOHmg數,重要概念,脂 肪 酸 概 況,脂肪酸的種類及簡寫符號: 分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸;偶數碳與奇數碳脂肪酸(奇數碳脂肪酸含量極少?。?;簡寫符號用碳數:雙鍵數雙鍵位號(含順反式)表示,如18:2 9c,12c。 多不飽和脂肪酸家族: 分為-3和-6系列(指離羧基最遠的雙鍵到甲基末端3個碳和6個碳)。如亞油酸和-亞麻酸為-6系列

8、,而-亞麻酸為-3系列。人體內二者不能互轉! 且二者對血脂的影響不同。見89頁表格。,三酰甘油的化學性質,水解與皂化(皂化值),氫化和鹵化(碘值),乙?;êu基,乙?;担?酸?。ㄋ嶂担?,皂化值:皂化1g油脂所需的KOHmg數; 碘值:100g油脂鹵化時所吸收的碘的克數; 乙酰值:中和1g乙?;锼尫诺囊宜崴枰腒OHmg數; 酸值:中和1g油脂中的游離脂肪酸所需的KOHmg數,重要的脂質,磷脂,,甘油磷脂,鞘磷脂,卵磷脂,腦磷脂,脂肪酸,必需脂肪酸(亞油酸、亞麻酸),DHA EPA( -3系列),花生四烯酸(衍生物為類二十碳烷:如前列腺素等),心磷脂,,,鞘糖脂,鞘脂類,,神經酰

9、胺,鞘胺醇,神經節(jié)苷脂,腦苷脂,,,,,磷脂酸,,,飽和脂肪酸:月桂酸、軟、硬脂酸、花生四烯酸,,兩個長長的碳氫鏈形成一個非極性的尾巴,含磷酸的一端則是極性的頭部,各種磷酸甘油酯的差別就在于其極性頭的大小,形狀和電荷的差異。,萜和類固醇,萜:由兩個或多個異戊二烯單位組成;如類胡蘿卜素為四萜;單萜、倍半萜等。 類固醇:即甾類,環(huán)戊烷多氫菲衍生而來;,膽固醇衍生物,激素:5類,膽汁酸,維生素D,脂蛋白:由脂質和蛋白質以非共價鍵結合而成的復合物,血漿可分為乳糜微粒、VLDL、IDL、LDL、HDL五類;血漿脂蛋白的結構與各自的功能!,其它,,氨基酸類別,非蛋白質氨基酸,蛋白質氨基酸 (20種),酸性

10、氨基酸,天冬氨酸,谷氨酸,堿性氨基酸,賴氨酸,組氨酸,精氨酸,中性氨基酸,極性氨基酸,非極性氨基酸,絲氨酸,蘇氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰氨,谷氨酰胺,,甘氨酸,丙氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,苯丙氨酸,,甲硫氨酸,色氨酸,脯氨酸,頡氨酸,,,,,,,相應的結構和縮寫,,,氨基酸的酸堿性質,根據酸堿質子理論,HA A- H+ 氨基酸是兩性電解質,既是質子供體,又是質子受體。當氨 基酸完全質子化時,可看作是多元酸;COOH和NH3+可以發(fā) 生解離,用Ka表示它們的解離常數;在氨基酸溶液中,pH值 計算公式如下: pH=pKalg(質子受體/質子供體) 當pH大于等電點時,氨基酸帶凈

11、負電荷;當pH小于等電點時,氨基酸帶凈正電荷!在一定的pH范圍內,氨基酸溶液的pH離等電點愈遠,氨基酸所攜帶的凈電荷愈大。,,,,pKa = 1.82.4,pKa = 3.94.3,pKa = 6.0,pKa = 8.3,pKa = 10,pKa = 8.811,pKa = 1012.5,,pKa 越小質子越容易放出,氨基酸中有很多可以放出質子或接受質子的基團,氨基酸側鏈的離子化與其 pKa,His 是唯一具有近中性 pKa 基團 咪唑基(imidazole) 的氨基酸,,,a 酸基或氨基的 pKa 都比 R 基團上面者要低 (較容易解離),在pH2.34和 pH9.60處,Gly具有緩沖能力

12、。,氨基酸的化學反應,-氨基參加的反應,,,DNFB: 2,4-二硝基氟苯,PITC:苯異硫氰酸酯,-羧基參加的反應,成鹽成酯,成酰氯(與二氯亞砜等),脫羧基反應,疊氮反應(氨基酸酯與肼、亞硝酸),,-氨基與-羧基共同參加反應,與茚三酮反應(氨與還原茚三酮發(fā)生作用生成紫色物質),成肽反應,,側鏈R基參加的反應,酪氨酸酚羥基Pauly 反應,組氨酸咪唑Pauly反應,精氨酸胍基坂口反應,色氨酸吲哚基,半胱氨酸巰基,,氨基酸的旋光性與光譜性質,氨基酸的旋光性: 氨基酸的構型(指-碳)也以甘油醛為參考物,從蛋白質的酸水解或酶水解液中得到的都是L型,但D型氨基酸在自然界也存在;蛋白質用堿水解或有機合

13、成氨基酸時,得到的都是無旋光性的DL-消旋物 Gly一種構型,無旋光性 Thr和Ile有四種光學異構體。 其余17種氨基酸有兩種光學異構體:L型、D型。 構成蛋白質的氨基酸均屬L-型。 氨基酸的光譜性質: 參與蛋白質組成的20多種氨基酸在可見光區(qū)沒有光吸收,在紅外區(qū)和遠紫外區(qū)都有光吸收,但在近紫外區(qū)只有芳香族氨基酸有光吸收;Tyr, Trp, Phe,氨基酸混合物的分析分離,分離方法,柱層析,紙層析(相對遷移率,非極性性質),薄層層析,離子交換層析(電荷和非極性),氣相層析,高效液相層析,,氨基酸洗脫順序的判定:氨基酸與樹脂的親合力主要決定于它們之間的靜電吸引,其次是氨基酸側鏈與樹脂聚苯乙烯

14、之間的疏水相互作用;親和力愈大愈難洗脫!,第四章:蛋白質(重點),蛋白質概況; 蛋白質的共價結構; 蛋白質的三維結構; 蛋白質的結構與功能的關系; 蛋白質的分離、純化與鑒定;,相關概念總結,構象:指具有相同結構式和相同構型的分子在空間里可能的多種形態(tài);構象形態(tài)間的改變不涉及共價鍵的破裂!每一種天然蛋白質都有自己特有的空間結構或三維結構,稱之為蛋白質的構象;一個給定的蛋白質可以有多種構象,但只有一種或少數幾種在能量上是有利的。,氨基酸殘基:肽鏈中的氨基酸由于參加肽鍵的形成因而 不在是原來完整的分子,稱為氨基酸殘基;兩個氨基酸形成一個肽鍵時失去一分子水,因此失去的水分子數比氨基酸殘基數少一個。每個

15、氨基酸殘基的平均分子量為110。氨基酸的平均分子量為128。 肽:由兩個或多個氨基酸殘基通過肽鍵相連而形成的化合物;肽有寡肽和多肽之分。一條肽鏈通常在一端含有一個游離的末端氨基,稱為N-末端,而另一端含有一個游離的末端羧基稱為C-末端; Edman化學降解法:用Edman試劑PITC與游離氨基作用生成PTH-氨基酸,并可用各種層析技術分離;用此法降解,一次可連續(xù)測出60-70個氨基酸殘基的序列,同源蛋白質:在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質 稱同源蛋白質。同源蛋白質具有共同的進化起源。同源蛋白質具有明顯的氨基酸序列相似性,稱之為序列同源。根據同源蛋白質的氨基酸序列資料可建立系統(tǒng)樹(進化樹

16、)。兩個物種的同源蛋白質,其序列中氨基酸的差異數目與這些物種間的進化發(fā)生差異是成比例的。 蛋白質激活:在生物體內有些蛋白質是以前體形式合成,不具有活性,只有按一定方式裂解除去部分肽鏈后才具有生物活性,稱之為蛋白質激活。如酶原激活。 固相肽合成:是控制合成技術的巨大進步,利用固相肽合成儀已成功合成多種肽和蛋白質。其實質是肽的羧基端第一個氨基酸共價掛接在樹脂上,然后加入氨基受保護的第二個氨基酸并發(fā)生縮合反應,形成肽鍵,依次類推。最后是肽與樹脂斷裂并去掉氨基端的保護基團。,超二級結構:由若干相鄰的二級結構元件組合在一起,彼此相互作用,形成種類不多,有規(guī)則的 二級結構串,并在多種蛋白質中充當三級結構的

17、構件,稱為超二級結構。已知有3種基本形式:、、。 結構域:在多肽鏈上由二級結構元件或超二級結構形成的相對獨立的 緊密球狀實體,是三級結構的局部折疊區(qū)。較小的球狀蛋白質或亞基是單結構域,而較大的球狀蛋白質或亞基是多結構域。結構域可分4類:全結構、 ,結構、全結構和富含金屬或二硫鍵結構域。 蛋白質變性:天然蛋白質分子在受到理化因素的作用時導致溶解度降低、不對稱性增高、生物活性喪失及理化特性改變,此過程稱之為蛋白質變性。 蛋白質變性的實質是分子中次級鍵被破壞,引起天然構象解體。變性不涉及共價鍵破壞,即蛋白質一級結構仍保持完好。當變性因素除去后,變性蛋白質又可重新回復到天然構象,此為蛋白質的復性。是否

18、蛋白質變性與復性可逆,仍有疑問。,蛋白質折疊:蛋白質折疊不是隨機的而是通過累積選擇找到自由能最低的構象;折疊需要折疊酶和分子伴侶參加。 分子伴侶:是一類與蛋白質折疊有關的蛋白質家族(來源相同、結構相似、功能相關),它們通過抑制新生肽鏈不正常的聚集并排除與其他蛋白質不合理的結合而協(xié)助多肽鏈的正確折疊。 血紅蛋白分子病:導致一個蛋白質中氨基酸改變的基因突變能產生分子病,這是一種遺傳病。了解最清楚的分子病是鐮刀狀細胞貧血病,該病人的不正常的血紅蛋白稱HbS,它只是在兩條鏈的N端第6位上Glu被Val置換。這一改變使血紅蛋白表面產生一個疏水小區(qū),導致血紅蛋白聚集成不溶性的纖維束,并引起紅細胞鐮刀狀化和

19、輸氧能力降低。地中海貧血是由于缺失一個或多個編碼血紅蛋白鏈的基因造成的。,別構效應: 別構部位與配體的結合可能影響其他亞基,使這些亞基構象改變,增強或減弱對底物的結合。 協(xié)同效應 正協(xié)同效應:引起與配體結合能力的增強(激活) 負協(xié)同效應:引起與配體結合能力的減弱(抑制) 正效應物:促進活性部位與配基結合的別構效應物。 負效應物:抑制活性部位與配基結合的別構效應物。 別構蛋白:除了有活性部位(結合底物)外,還有別構部位(結合調節(jié)物)。有時活性部位和別構部位分屬不同的亞基(活性亞基和調節(jié)亞基),活性部位之間以及活性部位和調節(jié)部位之間通過蛋白質構象的變化而相互作用。,,等電聚焦:也稱電聚焦,是一

20、種高分辨率的蛋白質分離技術,也可用于蛋白質等電點的測定。在外加電場時,蛋白質混合物在具有pH梯度的介質中移向并聚焦(停留)在等于其等電點的pH處,形成區(qū)帶。 密度梯度離心:蛋白質顆粒在具有密度梯度的介質中離心時,質量和密度大的顆粒比質量和密度小的顆粒沉降得快,且每種蛋白質顆粒沉降到與其自身密度相等的介質密度梯度時,即停止不前,最后各種蛋白質在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。 鹽溶和鹽析:中性鹽在低濃度時可增加蛋白質的溶解度,即鹽溶。原因是蛋白質分子吸附鹽類離子后,帶電層使蛋白質分子彼此排斥,而與水分子相互作用加強;當離子強度增大到足夠高時,此時與蛋白質疏水基團接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子,導致

21、蛋白質疏水基團暴露,使蛋白質因疏水作用凝聚沉淀。,親和層析: 是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力,也即生物學親和力,建立起來的一種有效的純化方法。 蛋白質純化的總目標:是增加制品的純度,即設法除去變性的和不需要的蛋白質以增加單位蛋白質重量中所需蛋白質的含量或生物活性。分離純化蛋白質的程序為:前處理(細胞或組織處理)、粗分級分離(除去雜蛋白)和細分級分離。,,蛋白質概況,蛋白質的化學組成:碳(50%)、氫(7%)、氧(23%)、氮(16%)、硫(0-3%)、其它元素微量;蛋白質的平均含氮量為16%,此為凱氏定氮法測定蛋白質含量的基礎。,,,,,蛋白質結構的層次,蛋白質的共價結構(一級結構

22、),氨基酸殘基、 肽(鍵)、 蛋白質一級結構的測定、氨基酸序列與生物功能 、 肽的人工合成,氨基酸殘基:肽鏈中的氨基酸由于參加肽鍵的形成因而 不在是原來完整的分子,稱為氨基酸殘基;兩個氨基酸形成一個肽鍵時失去一分子水,因此失去的水分子數比氨基酸殘基數少一個。每個氨基酸殘基的平均分子量為110。氨基酸的平均分子量為128。 肽:由兩個或多個氨基酸殘基通過肽鍵相連而形成的化合物;肽有寡肽和多肽之分。一條肽鏈通常在一端含有一個游離的末端氨基,稱為N-末端,而另一端含有一個游離的末端羧基稱為C-末端;,,肽鍵,具有部分雙鍵的性質,肽鍵比一般碳-氮單鍵短,與肽鍵相連的氫原子和氧原子呈反式構型,肽鍵不可自

23、由旋轉,,肽的理化性質: 肽鍵的酰氨氫不解離,肽的酸堿性質主要決定于肽鍵中的游離末端-NH2、-COOH及側鏈R基上的可解離基團; 肽中末端-羧基的pKa值比游離氨基酸的大,末端 -氨基的pKa值比游離氨基酸的??; 游離的-氨基、 -羧基和R基可發(fā)生與氨基酸中相應的類似反應,如茚三酮反應等; 蛋白質部分水解后所得的肽若不發(fā)生消旋,則具有旋光性,短肽的 旋光度約等于組成氨基酸的旋光度之和,較長的肽的旋光度則不是簡單加和;,活性肽:具特殊的生物學功能的肽段,如腦啡肽、谷胱甘肽、肌肽等;,肽,蛋白質一級結構的測定,測定多肽鏈的數目,蛋 白 質 測 序 的 步 驟,拆分多肽鏈,斷開多肽鏈內的二

24、硫鍵,測定每一肽鏈的氨基酸組成,鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端,裂解多肽鏈為較小的肽段,測定各肽段的氨基酸序列,利用重疊肽重建完整多肽鏈的一級結構,確定二硫鍵的位置,,,,,,,,,蛋白質測序的重要方法,N-末端測定,二硝基氟苯(DNFB)法:肽游離末端NH2與DNFB反應生成DNP-肽,最后水解生成黃色DNP-氨基酸,丹磺酰氯(DNS)法:用DNS取代DNFB,生成DNS-氨基酸,苯異硫氰酸(PITC)法:生成PTH-氨基酸,從肽上斷裂下來,氨肽酶法:外切酶,但效果不好,,C-末端測定,肼解法:測定C-末端的最重要的化學方法,肽與肼反應,除C-末端氨基酸游離外,其他氨基酸轉變?yōu)榘被狨k禄?/p>

25、,還原法:C-末端氨基酸用硼氫化鋰還原成相應的-氨基醇,羧肽酶法:最有效、最常用,羧肽酶A,羧肽酶B,羧肽酶C,羧肽酶Y,,,二硫鍵的斷裂,過甲酸氧化法:將二硫鍵氧化成磺酸基,巰基化合物還原法:將二硫鍵還原成巰基,然后用烷基化試劑如碘乙酸保護巰基,防止其重新被氧化,,氨基酸組成的測定:,酸水解:是主要方法,多用HCl,同時輔以堿水解;所得氨基酸不消旋,但Trp全部被破壞,Ser,Thr,Tyr部分破壞,Asn和Gln的酰氨基被水解,生成Asp和Glu;,多肽鏈的裂解,酶裂解:,胰蛋白酶:專一性強,斷裂Lys或Arg的羧基參與形成的肽鍵,糜蛋白酶:斷裂Phe,Trp,Tyr,Leu等疏水氨基酸的

26、羧基端肽鍵,嗜熱菌蛋白酶:專一性差,斷裂Val,Leu,Phe,Tyr,Trp等氨基參與形成的肽鍵,胃蛋白酶:在酸性條件穩(wěn)定,肽鍵 兩側均為疏水氨基酸。在確定二硫鍵位置時,常用到此酶。,其它酶:略,,化學裂解:,溴化氰(CNBr):只斷裂Met的羧基形成的肽鍵,羥氨(NH2OH):在pH9時,專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵,其它條件下不專一,,,,,肽段的氨基酸測序,Edman化學降解法:用Edman試劑PITC與游離氨基作用生成PTH-氨基酸,并可用各種層析技術分離;用此法降解,一次可連續(xù)測出60-70個氨基酸殘基的序列;工作量大,操作麻煩;現改用蛋白質測序儀。,酶解法:利用氨肽酶和羧肽

27、酶,局限性大,有困難,質譜法:質譜儀,由核苷酸序列推定法:mRNA cDNA ,推出 cDNA的核苷酸序列,然后推測出蛋白質的氨基酸序列,,,肽段在肽鏈中次序的確定:需借助重疊肽。 重疊肽:由于不同的斷裂方法即斷裂的專一性不同,產生的切口彼此錯位,使兩套肽段正好跨過切口而重疊的肽段;獲得重疊肽需要兩種或兩種以上的不同方法斷裂同一多肽樣品,得到兩套或多套肽段。,,二硫鍵位置的確定:一般采用胃蛋白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質。一是胃蛋白酶專一低,切點多,得到含有二硫鍵的肽段較小,易分離鑒定;二是在酸性條件下,有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應。,,,蛋白質的氨基酸序列與生物功能;肽合成,同源蛋白質:

28、在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質稱同源蛋白質。同源蛋白質具有共同的進化起源。同源蛋白質具有明顯的氨基酸序列相似性,稱之為序列同源。根據同源蛋白質的氨基酸序列資料可建立系統(tǒng)樹(進化樹)。兩個物種的同源蛋白質,其序列中氨基酸的差異數目與這些物種間的進化發(fā)生差異是成比例的。,蛋白質激活:在生物體內有些蛋白質是以前體形式合成,不具有活性,只有按一定方式裂解除去部分肽鏈后才具有生物活性,稱之為蛋白質激活。如酶原激活。,肽的人工合成:,氨基酸共聚合(由一種或兩種氨基酸反應),控制合成(由不同氨基酸按一定順序):接肽反應需接肽試劑,為避免接肽試劑與某些活潑基團反應,故在接肽前須首先將這些基團加以封閉

29、或保護,如氨基保護或羧基保護等。在正常條件下,羧基和氨基之間不會自發(fā)形成肽鍵,即氨基或羧基需活化,通常是羧基活化。,,固相肽合成:是控制合成技術的巨大進步,利用固相肽合成儀已成功合成多種肽和蛋白質。其實質是肽的羧基端第一個氨基酸共價掛接在樹脂上,然后加入氨基受保護的第二個氨基酸并發(fā)生縮合反應,形成肽鍵,依次類推。最后是肽與樹脂斷裂并去掉氨基端的保護基團。,蛋白質的三維結構,,,蛋白質的二級結構,無規(guī)卷曲,轉角,折疊片,螺旋:最常見、最典型、最豐富的二級結構元件,螺旋:是重復性結構,每圈螺旋站3.6個氨基酸殘基,沿螺旋軸上升0.54nm,即螺距值;由氫鍵封閉的環(huán)為13元環(huán);一般為右手螺旋;分子內

30、或鏈內氫鍵使之穩(wěn)定,減少R基間的相互作用或-碳原子無分支結構均利于其穩(wěn)定,而Pro存在可中斷之。(影響該結構的因素課件),,非重復性結構,,折疊片:為重復性結構; 折疊片的肽鏈處于曲折的伸展狀態(tài);借助鏈間或肽段間的氫鍵而穩(wěn)定;分為平行和反平行折疊片,平行的比反平行的更規(guī)則。0.7nm,纖維狀蛋白質,不溶性(硬蛋白),可溶性蛋白,角蛋白,膠原蛋白:結締組織中(骨、皮膚等)大量存在, 結構特點重復單元:Gly-X-Pro(Gly-X-HyPro),彈性蛋白:存在于結締組織,角蛋白:主要存在于毛發(fā)中(結構特點),角蛋白:天然存在于絲中(結構特點(Gly-Ala /Ser-Gly-Ala ),,,肌球

31、蛋白,血纖蛋白原,其它,,,說明: 角蛋白經充分伸展后可轉變成角蛋白,即折疊片結構。,無規(guī)卷曲:二級結構的一種結構單元,在這種結構單元的存在下,才使得蛋白質形成球形,這一部分的存在往往與蛋白的活性有關。 無規(guī)卷曲與其他二級結構一樣是明確而穩(wěn)定的結構。,球狀蛋白質: 其種類遠比纖維狀蛋白質多,蛋白質結構的復雜性和功能的多樣性主要體現在球狀蛋白質; 球狀蛋白質的整個肽鏈沒有均一的二級結構,但具有多種二級結構元件如螺旋、折疊片、無規(guī)卷曲等,由此構建的三級結構結構域,并將球狀蛋白質分成4大類; 其三維結構具有明顯的 折疊層次,且疏水測鏈球狀分子內部,親水側鏈暴露在分子表面; 在多數的胞內酶、血漿蛋

32、白及蛋白類激素都屬于球狀蛋白質。,超二級結構:由若干相鄰的二級結構元件組合在一起,彼此相互作用,形成種類不多,有規(guī)則的 二級結構串,并在多種蛋白質中充當三級結構的構件,稱為超二級結構。已知有3種基本形式:、、。,結構域:在多肽鏈上由二級結構元件或超二級結構形成的相對獨立的 緊密球狀實體,是三級結構的局部折疊區(qū)。較小的球狀蛋白質或亞基是單結構域,而較大的球狀蛋白質或亞基是多結構域。結構域可分4類:全結構、 ,結構、全結構和富含金屬或二硫鍵結構域。,蛋白質變性與蛋白質折疊,蛋白質的結構與功能的關系,肌紅蛋白和血紅蛋白是兩個研究得最透徹的蛋白質,它們是蛋白質結構與功能的范例。肌紅蛋白是哺乳動物肌肉中

33、儲氧的蛋白質,它和血紅蛋白的亞基在氨基酸序列上具有明顯的同源性,它們的構象和功能也十分相似。,肌紅蛋白,輔基血紅素:原卟啉與Fe的絡合物稱血紅素。,卟啉化合物有很強的著色力,使生物組織呈現特定的顏色。卟啉環(huán)中心的鐵原子有6個配位鍵,其中4個與四吡咯環(huán)的N原子相連,另2個沿垂直于卟啉環(huán)面的軸分布在環(huán)面的上下。 鐵原子可以是亞鐵(Fe2+)或高鐵(Fe3+),相應的血紅素稱為亞鐵血紅素和高鐵血紅素,相應的肌紅蛋白稱為亞鐵肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白。其中只有亞鐵態(tài)的蛋白質才能結合O2。 在肌紅蛋白分子中,血紅素共價地結合于肌紅蛋白分子的疏水空穴中。其中血紅素鐵在第5配位鍵與珠蛋白第93位His殘基的

34、咪唑N配位結合;第6配位鍵是O2的結合部位。血紅素的鐵原子如果處在水環(huán)境則容易被氧 化成Fe3+,失去氧合能力,此時H2O分子代替O2成為Fe3+的第6個配體。CO能與O2競爭第6配位鍵,且結合能力遠大于O2。,血紅蛋白(Hb)的主要功能是在血液中結合并轉運氧氣,它存在于紅細胞中。 Hb的結構:脊椎動物的Hb由4個多肽鏈亞基組成,如成人的血紅蛋白主要是HbA,亞基組成為22,次要組分是HbA2,亞基組成為22;每個血紅蛋白分子都有4個血紅素,每個血紅素分別位于每個多肽鏈中的裂隙處,并暴露在分子的表面。 氧合過程中的構象變化:氧合作用顯著改變Hb的四級結構,且氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白具有不同的

35、構象。 氧合曲線和別構效應:氧合曲線呈S形曲線(氧飽和度與氧分壓之間),即血紅蛋白的氧合具有正協(xié)同性同促效應,一個O2的結合增加同一Hb分子中其余空的氧合部位對O2的親合力; Hb對O2親和力的影響因素:H+、CO2促進O2從血紅蛋白中釋放,O2也促進H+、CO2 在肺泡毛細血管中釋放;BPG(2,3-二磷酸甘油酸)降低Hb對O2的親和力,其只與去氧血紅蛋白結合。 鐮刀狀細胞貧血?。菏且环N血紅蛋白分子病,該病人的不正常的血紅蛋白稱HbS,它只是在兩條鏈的N端第6位上Glu被Val置換。這一改變使血紅蛋白表面產生一個疏水小區(qū),導致血紅蛋白聚集成不溶性的纖維束,并引起紅細胞鐮刀狀化和輸氧能力降低。

36、,蛋白質的分離純化,蛋白質的分離和純化:主要是利用蛋白質之間各種特性的差異,包括蛋白質分子的酸堿性質、分子的大小和形狀、溶解度、吸附性質和對配體分子的特異親合力。 蛋白質的酸堿性質:蛋白質是兩性電解質。在蛋白質分子中,可解離基團主要來自側鏈上的功能團,此外還有少數的末端-羧基和-氨基。小肽的帶電性判斷 可以把蛋白質分子看作是一個多價離子,所帶電荷的性質和數量是由蛋白質分子中的可解離基團的種類和數目以及溶液的pH所決定的。 對某一種蛋白質來說,在某一pH時,它所帶的 正電荷與負電荷恰好相等,即凈電荷為零,這一pH稱蛋白質的等電點。蛋白質的等電點在中性鹽存在下可發(fā)生明顯的變化,這是由于蛋白質

37、分子中的可解離基團可與中性鹽中的陽離子或陰離子相結合。在沒有其他鹽類干擾時,蛋白質的 質子供體基團解離出來的質子數與質子受體基團結合的質子數相等時的pH稱為蛋白質的等離子點。 蛋白質分子的形狀:測定蛋白質分子的形狀或構象,最精確的方法是 X射線晶體結構分析,但這種方法只能測定晶體狀態(tài)的蛋白質空間結構。對于溶液中的蛋白質分子的形狀,只能借助間接的方法來描述蛋白質分子構象的輪廓。,測定蛋白質分子相對質量的方法,,,,,,蛋白質沉淀法,,蛋白質的分離純化方法,,,,蛋白質分離純化方法,,電荷,電泳(凈電荷、分子大小、形狀),區(qū)帶電泳,聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE),毛細管電泳,離子交換層析:相應的

38、離子交換膠,CM陽離子,DEAE陰離子,等電聚焦:外加電場時,蛋白質混合物在具有pH梯度的介質中移向并聚焦(停留)在等于其等電點的pH處,形成區(qū)帶。,層析聚焦:層析柱中建立連續(xù)的pH梯度,蛋白質樣品由柱上端隨緩沖液的展開而聚焦在各自的等電點pH處,形成區(qū)段。,吸附:吸附層析,吸附劑(硅石、氧化鋁、活性碳)和疏水吸附劑,與待分離分子和雜質分子的吸附與解吸能力不同。,特異親和力:親和層析,其它:如高效液相層析(HPLC), 快速蛋白液相層析(FPLC),,,,,蛋白質純度的鑒定方法:采用物理化學方法如電泳、離心沉降、HPLC和溶解度分析等。純的蛋白質電泳時,其電泳圖譜只呈現一個條帶或峰,離心時以單

39、一的沉降速度移動;純的蛋白質在一定的溶劑系統(tǒng)中具有恒定的溶解度,即溶解度曲線只有一個折點,在折點以前直線斜率為1,在折點以后斜率為零;此外,N-末端分析也用于純度鑒定(單體蛋白質而言)。 必須指出,采用任何單獨的一種方法鑒定純度只能作為蛋白質均一性的必要條件而非充分條件,即蛋白質往往在一種鑒定中表現為均一性,而在另一種鑒定中又表現為不均一性。,蛋白質含量測定與純度鑒定: 測定蛋白質含量的常用方法有:凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法(Lowry法,標準測定方法) 、紫外吸收法、染料(考馬斯亮藍)結合法、膠體金法(帶負電的疏水膠體,洋紅色,遇蛋白質變藍色,靈敏度最高),第五章:酶(重

40、點),酶概論; 酶促反應動力學; 酶的作用機制和酶的調節(jié);,基本概念,酶具有生物催化功能的蛋白質或核酸。酶作為生物催化劑具有高效性、高度專一性、活性調控和易失活等特點。通過降低反應的活化能,加速化學反應的進行。 多酶復合體由幾種酶靠非共價鍵彼此嵌合而成,也稱酶系。 酶的分類國際酶學委員會根據催化反應類型,將酶分為6大類,即氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構酶類和連接酶類。 酶活力即酶活性,指酶催化某一化學反應的能力,酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學反應的反應速率來表示,二者呈線性相關。所以測定酶活力就是測定酶促反應速率,酶促反應速率可用單位時間內底物的減少量或產物的

41、增加量來表示。 酶單位(U)在一定條件下,一定時間 內將一定量的底物轉化為產物所需的酶量。酶的含量用每克酶制劑或酶毫升酶制劑含有多少酶單位表示(U/g或U/ml)。,酶的比活力每mg蛋白質所含的酶的活力單位數表示,其代表酶的純度,也可用來比較每單位質量蛋白質的催化能力。 轉化數在一定條件下每秒鐘每個酶分子轉換底物的分子數,或每秒鐘每微摩爾酶分子轉化底物的微摩爾數。 核酶(ribozyme)某些具有催化功能的RNA,即為核酶。核酶的發(fā)現,開辟了生物化學研究的新領域,提出了生命起源的新概念:即RNA可能早于蛋白質和DNA,是生命起源中首先出現的生物大分子。 酶的專一性即酶對底物的高度選擇性,酶一般

42、只能催化一種或一類反應,作用于一種或一類底物。酶的專一性可分為結構專一性和立體異構專一性,用“誘導契合說”解釋酶的專一性已被廣泛認同。 酶的分離純化是酶學研究的基礎,大多數酶的本質是蛋白質,故可用分離純化蛋白質的方法純化酶。但要選擇合適的材料,操作條件要溫和,且在制備過程中,每一步都要測定酶的總活力和比活力,以了解酶的回收率和提純倍數。 酶工程是將酶學原理與化學工程技術及基因重組技術有機結合而形成的新型應用技術,是生物工程的重要組成部分,并必將成為一個很大的生物技術產業(yè)。,酶促反應動力學:底物濃度與酶促反應速率的關系呈雙曲線,即當底物濃度較低時,反應速率與底物濃度呈正比關系,表現為一級反應;當

43、底物濃度逐漸增加時,反應速率不再按正比關系升高,反應表現為混合級反應;當底物濃度達到 足夠高時,反應速率與底物濃度幾乎無關,反應達到最大反應速率,表現為零級 反應。 米氏方程1913年Michaelis和Menten在前人工作基礎上,根據酶反應的中間復合物學說,即: E S ES E P 假定 E S ES 迅速建立平衡,底物濃度遠大于酶濃度下,ES分解成產物的逆反應忽略不計,推導出一個數學方程式來表示底物與酶反應速率之間的定量關系,稱為米氏方程,表達式如下: Vmax S/ (Km S) 式中Km為米氏常數,其物理意義是當酶反應速率達到最大反

44、應速率一半時的底物濃度,單位是mol/L,與底物濃度的單位一樣。,,,,,,,米氏常數Km的意義如下: Km是酶的一個特征常數,其大小只與酶的性質有關,而與酶的濃度無關; Km值隨測定的底物、反應溫度、pH及離子強度而改變,即Km作為常數只是針對一定的底物、溫度、pH和離子強度而言; Km值可以判斷酶的專一性和天然底物:有的酶可作用于幾種底物,因此就有幾個Km值,其中Km值最小的底物稱為該酶的最適底物或天然底物。Km值隨不同底物而異的現象可以幫助判斷酶的專一性; 若已知某個酶的Km值,可以計算出在某一底物濃度時的反應速率相當Vmax的比例; Km值可以幫助推斷某一代謝反應的方向和途徑

45、:同一種底物往往可以被幾種酶作用,催化不同的反應走不同的途徑,究竟走哪一條途徑決定于Km值最小的酶,只有Km值小的酶反應比較占優(yōu)勢。 利用作圖法測定Km和Vmax值: Km值可用公式計算求得,Km ( k2 k3) /k1;當k3遠小于k2 時, Km k2 /k1 Ks,在此時,Km相當于ES復合物的解離常數Ks! ,,,Vmax= k3 Et (Et 為總酶濃度); Km和Vmax可根據實驗數據通過作圖法直接求得:即將米氏方程進行變換,使其成為直線方程,然后用圖解法求出Km與Vmax值。例如,Lineweaver-Burk雙倒數作圖法:1/ Km/Vmax 1/S1/Vmax ,

46、橫軸截距為-1/Km,縱軸截距為1/Vmax ; 酶的抑制:酶主要是蛋白質,使酶蛋白變性而導致酶活力喪失的作用稱為失活作用;若由于酶的必需基團化學性質的改變,但酶并未變性,而引起酶活力的降低或喪失稱為抑制作用。引起抑制作用的物質稱為抑制劑。抑制類型如下:,抑制類型,不可逆抑制:抑制劑與酶的必需基團以共價鍵結合,不能用物理方法除去抑制劑。,可逆抑制:以非共價鍵結合,競爭性抑制:競爭酶的結合部位,非競爭性抑制:同時和酶的不同部位結合,反競爭性抑制:酶與底物結合后,才可與抑制劑結合,,,競爭性抑制,Vmax不變,Km增加; 可逆抑制動力學 非競爭性抑制,Vmax減小,Km不變; 反

47、競爭性抑制,Vmax減小,Km減??;,,,,,,,,,,,,,,,Vmax,Km,Km,S, mM,vo,I,I,Vmax unchanged Km increased,Vmax decreased Km unchanged,Both Vmax & Km decreased,,,I,= Km,,重要的抑制劑,不可逆抑制劑,非專一性:,有機磷化合物:與酶活性部位Ser-OH共價結合,強烈抑制膽堿酯酶活性;敵敵畏、敵百蟲,有機汞、有機砷化合物:與酶分子中Cys-SH作用,抑制含巰基的酶,重金屬:使酶蛋白變性失活,用螯合劑可解除,氰化物、硫化物、CO:與酶分子中金屬離子形成絡合物,烷化劑:與酶的巰基

48、、氨基、羧基、咪唑基等結合,專一性: 作用某一種酶,Ks型:具底物類似結構,可與相應酶結合,并帶有一個活潑的化學基團,可對酶分子的必需基團進行修飾,從而抑制酶的活性。亦稱親和標記試劑。,Kcat型:具有底物類似結構,本身也是酶的底物,且存在潛伏的反應基團:當發(fā)生催化反應時,潛伏基團暴露或活化,作用酶活性部位的必需基團或輔基,使酶不可逆失活。亦稱自殺性底物。,,,,可逆抑制劑:最重要和最常見的是競爭性抑制劑。這類抑制劑與天然代謝物在結構上十分相似,能選擇性抑制病菌或癌細胞在代謝過程中的某些酶,故稱之為抗代謝物。如磺胺藥,對氨基苯磺酰胺,它是對氨基苯甲酸的結構類似物,而對氨基苯甲酸是葉酸結構的一部

49、分,細菌不能直接利用外源的葉酸,只能在二氫葉酸合成酶的作用下,利用對氨基苯甲酸為原料合成二氫葉酸,繼而合成四氫葉酸嘌呤核苷酸合成中重要的輔酶!因此,可利用競爭性抑制的原理設計藥物。 此外,過渡態(tài)底物類似物也可作為競爭性抑制劑:所謂過渡態(tài)底物是指底物和酶結合而形成的中間復合物被活化后的過渡形式。過渡態(tài)底物對酶的親和力遠大于底物,因此可將抑制劑的化學結構設計成類似于過渡態(tài)底物,從而一起酶的強烈抑制。目前報道的過渡態(tài)底物類似物都是競爭性抑制劑,其抑制效率比基態(tài)底物類似物高的多。 溫度、pH、激活劑對酶活性的影響:存在酶反應的最適溫度、最適pH;凡能提高酶活性的物質都稱為激活劑,它對酶的作用具有一

50、定的選擇性,即一種激活劑對某種酶起激活作用,而對另一種酶可能起抑制作用。,酶的作用機制和酶的調節(jié),酶活性部位酶的催化能力只局限在酶分子的一定區(qū)域,只有少數特異的氨基酸殘基參與了底物結合與催化作用,這些特異的氨基酸殘基比較集中的區(qū)域,即與酶活性直接相關的區(qū)域稱為酶的活性部位或活性中心。,活性部位包括,結合部位決定酶的專一性;,催化部位決定酶的催化能力,酶活性部位的共同特點: 酶活性部位在酶分子的總體積中只占相當小的部分,通常只占整個酶分子體積的1%2%; 酶的活性部位是一個三維實體(空間概念):不是點、線、面的概念; 酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補,而是在結合過程中二者發(fā)生一定的構象變化

51、后才互補的:此動態(tài)的辨認過程稱為誘導契合; 酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂縫內,底物分子或底物分子的一部分結合到裂縫內并發(fā)生催化作用; 底物通過次級鍵結合到酶上:酶與底物形成ES復合物主要靠氫鍵、鹽鍵、范德華力和疏水相互作用; 酶活性部位具有柔性或可運動性:活性部位更易被破壞;,補充: 酶的催化作用是由氨基酸側鏈上功能基團和輔因子為媒介的,主要的有His、Ser、Cys、Lys、Glu、Asp的側鏈常直接參加催化過程;輔因子對于酶的催化具有協(xié)同作用; 對于多底物的酶促催化反應,存在著1個以上的底物結合部位,在活性部位存在1個以上的催化基團,能進行協(xié)同催化; 與底物相比較,酶分子很大

52、,而活性部位通常只比底物稍大一些,故活性部位通常包圍著底物。,1.絲氨酸蛋白酶的結構特點 絲氨酸蛋白酶類包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶(胰肽酶E)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)和其他相關酶。之所以稱為絲氨酸蛋白酶,是因為它們有共同的、涉及特有的反應絲氨酸殘基的作用機制;二異苯氟磷酸(DIPF)是絲氨酸蛋白酶的不可逆抑制劑,它只能與活性部位的Ser殘基結合,從而導致酶的失活,這就證明了這個絲氨酸殘基是酶活性所必需的。(雖然乙酰膽堿酯酶本身不是一種蛋白酶,但該酶是一個絲氨酸酯酶,并在機制上與絲氨酸蛋白酶相似)。,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶都能完成同樣的反應---肽鏈裂解

53、。雖然它們的結構和作用機制是十分相似的,但是,它們卻表現出很不相同的(基團)專一性。這三種酶的分子量大約是25 kD,有相似的的順序和三維空間結構,整個分子呈橢球形。它們的活性中心存在催化三聯(lián)體(His57、Asp102和Ser195) 的位置。催化三聯(lián)體在三種胰臟酶中都存在。,3.絲氨酸蛋白酶進化上的關系 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶來自同一組織--胰臟,都是內肽酶。這三種酶被認為是由一個共同的祖先基因(ancestral gene)在進化過程中通過同源趨異進化(divergent evolution) 產生的三個基因編碼的。因為: 1).這三種酶的活性中心都含有可與DIFP起反應的

54、Ser殘基; 2).在活性部位的Ser附近都含有相同的氨基酸順序: --Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-- 3).在它們的三級結構中都含有相同的、恒定的 Asp102-His57-Ser195- 的組合順序(相同的電荷轉換系統(tǒng)); 4).它們氨基酸的順序大約有40%相同; 5) 它們有很相似的空間結構。,枯草桿菌蛋白酶和小麥胚芽絲氨酸羧肽酶(一種外肽酶)也是絲氨酸蛋白酶,彼此之間以及與胰凝乳蛋白酶之間在一級或三級結構上不具有共同的可辯別的關系。然而,這兩種酶在它們的活性部位上具有與胰臟酶相似的催化三聯(lián)體,由于這兩種酶活性部位相應的催化三聯(lián)體的順序是不同的(在胰凝乳蛋白酶中是A

55、sp102His57Ser195,在枯草桿菌蛋白酶中是Asp32His64Ser221,在小麥胚芽絲氨酸羧肽酶中是Asp338His397-Ser146),因此,它們從一個共同的祖先蛋白(ancestor protein)進化而來是很不可能的。這些酶顯然構成了一個異源趨同進化(convergent evolution)的例子。,,,影響酶催化效率的因素,底物和酶的鄰近效應與定向效應:鄰近效應指酶與底物結合成中間復合物后,使底物與底物之間,酶的催化基團與底物之間的有效濃度大大提高;定向效應指底物的反應基團之間和酶的催化基團與底物的反應基團之間的正確取位產生的效應。,底物形變和誘導契合:酶使底物分

56、子中敏感鍵基團的電子云密度增高或降低,產生電子張力,使底物分子形變而接近其過渡態(tài),降低了反應活化能;,酸堿催化:酶通過瞬時的向底物提供質子或從底物接受質子以穩(wěn)定過渡態(tài)底物而加速反應的催化機制。在生理條件下,pH中性,OH-H+很低,不能起到酸堿催化作用,此時主要依靠廣義的酸堿催化來作用,即酶蛋白分子中某些基團既是質子供體又是質子受體,如氨基、羧基、巰基、酚羥基、咪唑基等。,共價催化:酶蛋白中的親核基團容易攻擊底物的親電中心,形成酶-底物共價結合的中間物,從而降低反應活化能,加速反應。酶蛋白中最常見的3種親核基團是:絲氨酸羥基、半胱氨酸巰基、組氨酸咪唑基;底物中典型的親電中心:磷?;?、?;吞腔?/p>

57、。,金屬離子催化:幾乎1/3的酶催化活性需要金屬離子,金屬離子通過3種主要途徑參與催化過程:結合底物為反應定向;可逆地改變金屬離子的氧化態(tài)調節(jié)氧化還原反應;靜電穩(wěn)定或屏蔽負電荷。,多元協(xié)同催化:,酶活性部位受微環(huán)境影響:非極性、低介電環(huán)境利于酶促反應。,,酶活性的調控,酶活性的調控,激素,產物反饋抑制,抑制劑、激活劑,別構調節(jié):可逆、非共價:別構酶,共價修飾,不可逆共價修飾:酶原激活,可逆共價修飾:,磷酸化與去磷酸化,甲基化與去甲基化,其它,同工酶,,,,別構調節(jié)酶分子的非催化部位(別構部位)與某些化合物可逆地、非共價結合后使酶的構象發(fā)生改變,進而改變酶活性(增加或降低),稱之為酶的別構調節(jié)。

58、具有這種調節(jié)作用的酶稱為別構酶(變構酶)。使酶分子發(fā)生別構作用的物質稱為效應物或別構劑,它包括正效應物(別構激活劑)和負效應物(別構抑制劑)。別構調節(jié)普遍存在于生物界,許多多謝途徑的關鍵酶就是利用別構調節(jié)來控制代謝途徑之間的平衡。別構調節(jié)現象不僅存在于別構酶,還存在于其它的別構蛋白質如血紅蛋白;此外,操縱子中的調節(jié)蛋白也是別構蛋白質。,關于別構酶: 別構酶的酶促反應大多不符合Michaelis-Menten動力學,即不符合米氏方程,其酶促反應曲線為S型(正協(xié)同)或雙曲; 效應物(別構劑)與調節(jié)亞基(調節(jié)部位)結合后導致酶構象的改變,引起酶催化部位的活性增加或降低; 具活性中心和別構中心,

59、且二中心處在酶蛋白的不同亞基或同一亞基的不同部位,即調節(jié)部位不同于催化部位; 許多別構酶常處于代謝途徑的起始部位或受控部位,代謝途徑的終產物常作為別構酶的負效應物抑制這些酶; 所有的別構酶均為寡聚酶; 存在同促效應和異促效應:底物分子本身對別構酶的調節(jié)作用稱同促效應;非底物分子對別構酶的調節(jié)作用稱異促效應;,實例:大腸桿菌的天冬氨酸轉氨甲酰酶, 結構 ATcase相對分子質量是310,0000,由12條肽鏈組成, 每個催化亞基有3個天冬氨酸底物結合部位 ,每個調節(jié)亞基有2個別構劑的結合部位 催化反應: 這是嘧啶核苷酸合成系列反應的第一個反應,反應終產物CTP是ATcase的別構抑制劑,而

60、ATP 是它的別構激活劑 反應動力學曲線 當只有底物天冬氨酸和氨甲酰磷酸存在時,ATcase的反應動力學曲線為S型曲線 ,如果其他條件不變,但反應為一 就有CTP存在,CTP 與ATcase 調節(jié)亞基結合使酶分子構象變化,與底物親和力降低,使反應速度下降,S型曲線右移。如果在反應系統(tǒng)加入ATP而不是CTP,ATP 與ATcase調節(jié)亞基結合后,使酶分子構象變化,與底物親和力增強,反應速度加快,S型曲線左移。 綜上所述,對于ATcase來說,底物,CTP, ATP是它的別構效應劑,可以通過別構效應影響酶的催化活性,從而有效地調節(jié)內嘧啶核苷酸的生物合成,補充:為了區(qū)分符合米氏方程的酶和正協(xié)同效應的

61、別構酶及負協(xié)同效應的別構酶,用協(xié)同指數(cooperativity index,CI)來鑒別不同的協(xié)同作用以及協(xié)同的程度。CI是指酶分子中的結合位點被底物飽和90%和飽和10%時底物濃度的比值。故協(xié)同指數又稱飽和比值(Rs)。CI=Rs=81 1/n ,n為協(xié)同系數(Hill系數),存在下列不同的Rs值: 典型的米氏方程酶:Rs=81; 正協(xié)同效應的別構酶:Rs81,且Rs愈小,正協(xié)同效應愈顯著; 負協(xié)同效應的別構酶:Rs81,且Rs愈大,負協(xié)同效應愈顯著; 此外,也常用Hill系數來判斷酶屬于哪一種類型:米氏方程酶n=1;正協(xié)同別構酶n 1;負協(xié)同別構酶n 1;,調節(jié)酶凡能通過構象變化或亞

62、基解聚或亞基修飾等方式來改變酶活性而對代謝起調節(jié)作用的酶稱為調節(jié)酶。,調節(jié)酶,別構酶:可逆地非共價結合,使構象改變,調節(jié)亞基發(fā)生變構或進一步脫離催化亞基(解聚)。比如天冬氨酸轉氨甲酰酶 ,是CTP生物合成多酶體系反應序列中的第一個酶。,共價調節(jié)酶:通過其它酶對其多肽鏈某些基團進行可逆共價修飾,使處于活性與非活性的互變狀態(tài),從而調節(jié)酶活性;共價修飾主要是磷酸化、腺苷酰化、甲基化等。如在蛋白激酶作用下發(fā)生磷酸化,主要的蛋白激酶有蛋白激酶A,磷酸化酶激酶,蛋白酪氨酸激酶等;共價調節(jié)酶是寡聚酶,且在每個亞基上都含有共價修飾的位點。,,,酶原激活是不可逆共價修飾,指酶前體(酶原)經過蛋白水解酶作用后釋放

63、出肽段,構象發(fā)生變化,形成酶的活性部位,變成有活性的酶。 同工酶指催化相同的化學反應,但其蛋白質的分子結構、理化性質和免疫功能等 方面不同的一組酶,稱為同工酶。關于同工酶的幾點說明: 同工酶的產生可能是基因分化的產物,而基因分化又可能是生物進化過程中為適應不同的代謝方式而引起的,故為適應不同的代謝方式,同工酶在不同組織或不同細胞中分布不同,底物特異性不同和動力學特性不同,這決定了同工酶在體內的功能是不同的,同工酶只做相同的工作,不一定有相同的功能; 同工酶是由不同基因編碼的單體亞基通過不同的比例聚合成不同的多聚體,使得同工酶在催化同一反應時以不同的多聚體形式存在; 同工酶是研究代謝調節(jié)、分子

64、遺傳、生物進化、個體發(fā)育、細胞分化和細胞癌變的有力工具,在酶學、醫(yī)學和生物學研究中具有重要地位。,,,第五章 核酸,核酸 是重要的生物大分子(還有蛋白質、多糖和脂類復合物),是生物化學與分子生物學研究的重要對象和領域。它包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。,腺嘌呤,鳥嘌呤,胞嘧啶C,尿嘧啶U,胸腺嘧啶T,核酸的種類、分布、功能,,所有生物細胞都含有DNA和RNA這兩類核酸,而病毒只含DNA或RNA。 真核生物染色體DNA是線型雙鏈DNA。原核生物的染色體DNA、質粒DNA和真核生物的細胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈DNA。 細胞RNA通常都是線型單鏈,但病毒RNA則有線型與環(huán)狀、雙鏈與單鏈

65、之分。,分布,,,質粒DNA為cccDNA。類病毒為環(huán)狀ssRNA。,功能,DNA:是主要的遺傳物質,遺傳信息以密碼形式編碼在核酸分子上,表現為特定的核苷酸序列。,RNA,參與蛋白質合成,tRNA: 轉運、識別,rRNA: 裝配、催化,mRNA:信使、模板,,多種細胞功能,,,,RNA的5種功能,生物體通過DNA復制將遺傳信息由親代傳遞給子代。通過RNA轉錄和蛋白質翻譯使遺傳信息在子代中得以表達。 基因:是指具有遺傳效應的DNA片段或RNA,它能編碼蛋白質或功能RNA。某些病毒的基因組是RNA。,核酸結構,核酸分子的組成 核酸的四級結構,基本內容,核 酸,核酸分子組成,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖

66、,堿基,A,G,T,C,U,核糖,,脫氧核糖,,,,,,,,堿基結構、稀有堿基、核苷三磷酸、環(huán)化核苷酸,磷酸基的位置 在RNA分子中,磷酸在2、3、5均可;在DNA分子中,磷酸在3、5( D-2-脫氧核糖 )。 核酸分子的形成 由多個核苷酸分子聚合而成,無分支結構。核苷酸分子之間以 3,5磷酸二酯鍵相連。磷酸二酯鍵的走向為3 5。 DNA與RNA的四級結構與蛋白質四級結構比較。,,DNA的四級結構,重要概念,堿基互補配對 指堿基A、T配對,堿基G、 C配對。它們之間分別通過2個氫鍵和3個氫鍵配對。即A=T G =C 。 Chargaff規(guī)則 在雙鏈DNA分子中,堿基摩爾數存在下列關系:A=T G=C A+C=G+T A+G=T+C DNA雙螺旋結構 1953年,Watson和Crick在前人工作的基礎上提出DNA雙螺旋結構模型。該模型的特征如下: 兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸相互纏繞,且兩條鏈均為右手螺旋。堿基平面與縱軸垂直,糖環(huán)平面與縱軸平行; 嘌呤與嘧啶堿基位于雙螺旋的內側; 雙螺旋的平均直徑為2nm, 兩個相鄰堿基對之間的距離為0.34nm,即堿基堆積距離為0.34n

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