2018-2019學(xué)年高中生物 專題1 基因工程 1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具教學(xué)案（含解析）新人教版選修3.doc

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DNA重組技術(shù)的基本工具 1.基因工程的基本原理是基因重組，外源DNA能在受體細(xì)胞表達(dá)的理論基礎(chǔ)是密碼子的通用性。 2．DNA重組技術(shù)的基本工具有限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。 3．限制性核酸內(nèi)切酶可識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并在特定位點(diǎn)上切割。 4．Ecoli DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶既能連接黏性末端也能連接平末端。 5．質(zhì)粒作為基因工程的載體需具備的條件有：能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并自我復(fù)制；具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；具有標(biāo)記基因。 6．在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。 一、基因工程的概念及其誕生與發(fā)展 1．基因工程的概念[填表] 別名 DNA重組技術(shù) 操作環(huán)境 生物體外 操作對象 基因 操作水平 DNA分子水平 結(jié)果 創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品 2．基因工程的誕生和發(fā)展 (1)基礎(chǔ)理論的突破：DNA是遺傳物質(zhì)的證明；DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立；遺傳密碼的破譯。 (2)技術(shù)的發(fā)明：基因轉(zhuǎn)移載體和工具酶的相繼發(fā)現(xiàn)；DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明；DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)及重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功；第一例轉(zhuǎn)基因動物的問世及PCR技術(shù)的發(fā)明。 二、DNA重組技術(shù)的基本工具 1．限制性核酸內(nèi)切酶(又稱限制酶) (1)來源：主要來自原核生物。 (2)功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。 (3)結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。 (4)應(yīng)用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ識別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為G↓AATTC和CCC↓GGG，在圖中寫出兩種限制酶切割DNA后產(chǎn)生的末端并寫出末端的種類。 EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶識別的堿基序列不同，切割位點(diǎn)不同(填“相同”或“不同”)，說明限制酶具有專一性。 2．DNA連接酶 (1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 (2)種類：[填表] 　　種類 比較　　 Ecoli DNA連接酶 T4DNA連接酶 來源 大腸桿菌 T4噬菌體 特點(diǎn) 只能連接黏性末端 既可以連接黏性末端，又可以連接平末端 3．基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 (1)種類 ①常用載體：質(zhì)粒 ②其他載體：λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。 (2)作用 ①作為運(yùn)載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)。 ②利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。 (3)載體須具備的條件及其作用(連線) 三、重組DNA分子的模擬操作 1．所用材料用具中，剪刀代表EcoRⅠ，透明膠條代表DNA連接酶。 2．用剪刀進(jìn)行DNA“切割”時(shí)，應(yīng)找出G—A—A—T—T—C序列并在G—A之間作切口進(jìn)行“切割”。 3．若操作正確，不同顏色的黏性末端能互補(bǔ)配對。 1．基因工程是一種新興的生物技術(shù)，實(shí)施該工程的最終目的是(　　) A．定向提取生物體的DNA分子 B．定向?qū)NA分子進(jìn)行人工“剪切” C．在生物體外對DNA分子進(jìn)行改造 D．定向改造生物的遺傳性狀 解析：選D　基因工程也稱DNA重組技術(shù)，它是按照人類的意愿，將某種基因有計(jì)劃地轉(zhuǎn)移到另一種生物中去的新技術(shù)，故實(shí)施基因工程的最終目的是定向改造生物的遺傳性狀。 2．下列關(guān)于限制酶的說法，正確的是(　　) A．限制酶廣泛存在于各種生物中，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì) B．一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 C．不同的限制酶切割DNA后都會形成黏性末端 D．限制酶均特異性地識別由6個(gè)核苷酸組成的序列 解析：選B　限制酶主要存在于微生物中；限制酶具有專一性，即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列；不同的限制酶切割DNA后會形成黏性末端或平末端；限制性核酸內(nèi)切酶均能特異性地識別核苷酸序列，但識別的核苷酸序列不一定由6個(gè)核苷酸組成。 3．“分子縫合針”——DNA連接酶“縫合”的部位是(　　) A．堿基對之間的氫鍵 B．堿基與脫氧核糖 C．雙鏈DNA片段間的磷酸二酯鍵 D．脫氧核糖與脫氧核糖 解析：選C　相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸之間由磷酸和脫氧核糖形成的磷酸二酯鍵連接，DNA連接酶連接的是此化學(xué)鍵。 4．下列通常不被用作基因工程載體的是(　　) A．細(xì)菌質(zhì)粒　　　　　　B．λ噬菌體的衍生物 C．動植物病毒 D．細(xì)菌核區(qū)的DNA 解析：選D　常用的載體有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。細(xì)菌的核區(qū)由一個(gè)大型的環(huán)狀DNA分子經(jīng)反復(fù)折疊纏繞而成，它控制著細(xì)菌的主要性狀，一般不能用作基因工程的載體。 5．質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列有關(guān)質(zhì)粒的說法錯誤的是(　　) A．質(zhì)粒不僅存在于細(xì)菌中，某些病毒也具有 B．質(zhì)粒作為載體時(shí)，應(yīng)具有標(biāo)記基因和多個(gè)限制酶切點(diǎn) C．質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子，存在于擬核(區(qū))外的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中 D．質(zhì)粒能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存，并在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制 解析：選A　質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子，不僅存在于細(xì)菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中沒有質(zhì)粒；質(zhì)粒作為載體時(shí)，應(yīng)具有標(biāo)記基因和多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子，存在于細(xì)胞核或擬核外的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中；質(zhì)粒能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存，并在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。 1．限制性核酸內(nèi)切酶 (1)作用特點(diǎn)：具有專一性，表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面 ①能夠識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。 ②能夠切割特定序列中的特定位點(diǎn)。 (2)識別序列的特點(diǎn)：遵循堿基互補(bǔ)配對原則，無論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，如圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。 如以為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對稱。 (3)作用產(chǎn)物：黏性末端或平末端。 ①黏性末端：是限制性核酸內(nèi)切酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)形成的，如圖所示： ②平末端：是限制性核酸內(nèi)切酶在它識別序列的中心軸線處切開時(shí)形成的，如圖所示： 2．限制性核酸內(nèi)切酶與DNA連接酶的關(guān)系 (1)區(qū)別： 作用 應(yīng)用 限制性核酸內(nèi)切酶 使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂 用于提取目的基因和切割載體 DNA 連接酶 在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵 用于目的基因和載體的連接 (2)兩者的關(guān)系可表示為： 3．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較 比較項(xiàng)目 DNA連接酶 DNA聚合酶 相同點(diǎn) 作用實(shí)質(zhì)相同，都是催化磷酸二酯鍵的形成 不同點(diǎn) 是否需要模板 不需要 需要 接DNA鏈 雙鏈 單鏈 作用過程 在兩個(gè)DNA片段間形成磷酸二酯鍵 將單個(gè)核苷酸加到已存在的DNA單鏈片段上，形成磷酸二酯鍵 作用結(jié)果 將已存在的DNA片段連接 合成新的DNA分子 用途 基因工程 DNA復(fù)制 [題組沖關(guān)] 1．下列關(guān)于幾種酶作用的敘述，錯誤的是(　　) A．DNA連接酶能使不同脫氧核苷酸的磷酸與脫氧核糖連接 B．RNA聚合酶能與基因的特定位點(diǎn)結(jié)合，催化遺傳信息的轉(zhuǎn)錄 C．一種限制酶能識別多種核苷酸序列，并切割出多種目的基因 D．DNA聚合酶能把單個(gè)脫氧核苷酸分子連接成一條DNA單鏈 解析：選C　限制酶具有專一性，一種限制酶一般只能識別一種核苷酸序列，并在特定位點(diǎn)切割DNA分子。DNA連接酶能使不同DNA片段的脫氧核苷酸的磷酸與脫氧核糖連接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能與基因的特定位點(diǎn)結(jié)合，催化遺傳信息的轉(zhuǎn)錄；DNA聚合酶能以DNA的一條鏈為模板，把單個(gè)脫氧核苷酸分子連接成一條DNA單鏈，復(fù)制形成新的DNA分子。 2．(江蘇高考改編)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請回答下列問題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識別序 列及切 割位點(diǎn) 圖1 圖2 (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用__________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。 (2)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對序列為________________________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (3)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 解析：(1)基因工程中選擇合適的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因時(shí)，應(yīng)保留目的基因和至少一個(gè)標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)的完整性，即遵循“目的基因切兩側(cè)，標(biāo)記基因留一個(gè)”的基本原則，最好選擇切割產(chǎn)生不同末端的兩種限制酶同時(shí)切割質(zhì)粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入帶來的不正常表達(dá)，因此據(jù)圖分析應(yīng)選擇的限制酶為BclⅠ和HindⅢ，切割后質(zhì)粒上保留的四環(huán)素抗性基因作為標(biāo)記基因。酶切后的載體和目的基因通過DNA連接酶的作用形成重組質(zhì)粒。(2)因?yàn)锽clⅠ和BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端相同，所以可以被DNA連接酶連接，連接部位的6個(gè)堿基對序列為，但是連接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的識別序列，連接部位不能被這兩種酶切開。(3)由圖可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ識別并切割，因此圖中質(zhì)粒上存在3個(gè)Sau3AⅠ的切割位點(diǎn)，若將3個(gè)切割位點(diǎn)之間的DNA片段分別編號為a、b和c，則完全酶切(3個(gè)切割位點(diǎn)均被切割)會產(chǎn)生3種大小的DNA片段，即為a、b和c；考慮只切1個(gè)切割位點(diǎn)，有三種情況，都產(chǎn)生一種大小的DNA片段，即大小均為a＋b＋c；考慮切2個(gè)切割位點(diǎn)，則會產(chǎn)生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a幾種不同大小的DNA片段。綜上所述，若用Sau3AⅠ識別并切割圖中質(zhì)粒，最多可獲得7種大小的DNA片段，即為a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。 答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接 (2)　都不能　(3)7 [方法規(guī)律] 限制酶的選擇技巧 根據(jù)目的基因兩端的限制酶 切割位點(diǎn)確定限制酶的種類 ①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶， 如圖甲可選擇PstⅠ； ②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶， 如圖甲不能選擇SmaⅠ； ③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接， 也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒， 如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶 (但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn)) 根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn) 確定限制酶的種類 ①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致， 以確保產(chǎn)生相同的黏性末端； ②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選 擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限 制酶SmaⅠ會破壞標(biāo)記基因；如果所選酶的切割位 點(diǎn)不只一個(gè)，則切割重組后可能丟失某些片段， 若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，則切割重組后的 片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制 1．種類 (1)常用載體：質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 (2)其他載體：λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。 2．具備條件 (1)能自我復(fù)制：能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制。 (2)有切割位點(diǎn)：有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源基因插入。 (3)具有標(biāo)記基因：具有特殊的標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。 (4)無毒害作用：對受體細(xì)胞無毒害作用，否則受體細(xì)胞將受到損傷甚至死亡。 3．作用 (1)用它作為運(yùn)輸工具，將目的基因送入受體細(xì)胞中。 (2)利用它在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。 [名師點(diǎn)撥]　細(xì)胞膜上的載體與基因工程中的載體不同 (1)化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體化學(xué)成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物，也可能是生物，如動植物病毒等。 (2)功能不同：細(xì)胞膜上的載體功能是協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞；基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。 [題組沖關(guān)] 3．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的識別序列及切割位點(diǎn)分別是 —C↓TTAAG— 和 —G↓AATTC—。如圖表示的是四種質(zhì)粒和目的基因，其中箭頭所指部位為酶的識別位點(diǎn)，質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是(　　) 解析：選A　目的基因兩側(cè)有MunⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶的識別序列，用這兩種酶切割都可得到目的基因，且未破壞標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)；B中質(zhì)粒無標(biāo)記基因，不符合作為載體的條件；C、D中的標(biāo)記基因都會被破壞。 4．(全國卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題： (1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有________________________(答出兩點(diǎn)即可)，而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是___________________________；并且__________________________和____________________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________________________________。 在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有__________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來自________________。 解析：(1)質(zhì)粒作為載體，應(yīng)具備的基本條件有：有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制，或能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制；有特殊的標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇等。(2)在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素進(jìn)行篩選，其中未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目 的基因的大腸桿菌，因不含氨芐青霉素抗性基因而都不能在此培養(yǎng)基上存活，二者不能區(qū)分。含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，都能在此培養(yǎng)基上存活，二者也不能區(qū)分。若要將含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)一步篩選出來，還需要使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。(3)某些噬菌體經(jīng)改造后作為載體，導(dǎo)入受體細(xì)胞后，其DNA復(fù)制所需的原料來自受體細(xì)胞。 答案：(1)能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因(答出兩點(diǎn)即可) (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素　(3)受體細(xì)胞 [方法規(guī)律] 載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理 載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如圖所示： [隨堂基礎(chǔ)鞏固]　 1．以下有關(guān)基因工程的敘述，正確的是(　　) A．基因工程是細(xì)胞水平上的生物工程 B．基因工程的產(chǎn)物對人類都是有益的 C．基因工程育種的優(yōu)點(diǎn)之一是目的性強(qiáng) D．基因工程產(chǎn)生的變異屬于人工誘變 解析：選C　基因工程是在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行有目的地改造，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，產(chǎn)生人類所需要的基因產(chǎn)物。因而基因工程是分子水平上的生物工程，其產(chǎn)生的變異屬于基因重組，而不屬于人工誘變；基因工程雖是按照人們的意愿改造生物，目的性強(qiáng)，但并不是所有的基因產(chǎn)物對人類都有益。 2．有關(guān)DNA重組技術(shù)中的工具——“分子縫合針”“分子手術(shù)刀”“分子運(yùn)輸車”的組合正確的是(　　) ①DNA連接酶?、贒NA聚合酶?、巯拗泼? ④RNA聚合酶?、葺d體 A．②③⑤　　　　　　　B．①③④ C．①③⑤ D．④③⑤ 解析：選C　基因工程中，“手術(shù)刀”是限制酶，“縫合針”是DNA連接酶，“運(yùn)輸車”是指將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的載體。 3．下列有關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的敘述，正確的是(　　) A．用限制性核酸內(nèi)切酶切割一個(gè)DNA分子中部，獲得一個(gè)目的基因時(shí)，被水解的磷酸二酯鍵有2個(gè) B．限制性核酸內(nèi)切酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大 C. 和序列被限制酶切出的黏性末端堿基數(shù)不同 D．只有用相同的限制性核酸內(nèi)切酶處理含目的基因的片段和質(zhì)粒，才能形成重組質(zhì)粒 解析：選B　用限制酶切割DNA分子中部獲得一個(gè)目的基因時(shí)，需剪切2次，水解磷酸二酯鍵4個(gè)；限制酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大；和序列被限制酶切出的黏性末端均有4個(gè)堿基；切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶，如果不同的限制酶切割DNA分子所產(chǎn)生的末端存在互補(bǔ)關(guān)系，則兩末端也可連接。 4．下列關(guān)于DNA連接酶作用的敘述，正確的是(　　) A．將單個(gè)核苷酸加到某個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵 B．將斷開的2個(gè)DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵 C．連接2條DNA鏈上堿基之間的氫鍵 D．只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端連接起來，而不能將兩者之間的平末端進(jìn)行連接 解析：選B　DNA連接酶和DNA聚合酶都能催化磷酸二酯鍵的形成，但DNA連接酶是在2個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，將2個(gè)DNA片段連接成重組DNA分子；DNA聚合酶則是將單個(gè)的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯鍵，合成新的DNA分子。 5．下列四條DNA片段，可能是由同一種限制酶切割而成的是(　　) A．①②　　　B．②③　　　C．③④　　　D．②④ 解析：選D　只有②和④的黏性末端的堿基都是互補(bǔ)的，它們可能是由同一種限制酶切割而成的。 6．下列有關(guān)基因工程和酶的敘述，正確的是(　　) A．同種限制酶既可以切割目的基因又可以切割質(zhì)粒，因此不具備專一性 B．載體的化學(xué)本質(zhì)與載體蛋白相同 C．限制酶不能切割煙草花葉病毒的核酸 D．DNA連接酶可催化脫氧核苷酸鏈間形成氫鍵 解析：選C　一種限制酶可識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子，因此具有專一性。載體有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等，成分不單一；載體蛋白的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。煙草花葉病毒的核酸為RNA，限制酶不能切割。DNA連接酶可催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。 7．根據(jù)圖表的內(nèi)容回答問題： 幾種限制酶識別序列切割位點(diǎn) 限制酶 SmaⅠ EcoRⅠ PstⅠ 切割位點(diǎn) (1)假設(shè)所用的限制酶均能將所識別的位點(diǎn)完全切開，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到________種DNA片段。如果將質(zhì)粒載體和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切產(chǎn)物再加入DNA連接酶，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有________________________、______________________________________________、 ________________________。 (2)為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體酶切后的末端任意連接，酶切時(shí)應(yīng)該選用的酶是_______________________________________________、____________________。 解析：(1)含目的基因的DNA分子上含有2個(gè)EcoRⅠ和1個(gè)PstⅠ的酶切位點(diǎn)，3個(gè)切點(diǎn)全部切開，則形成4種DNA片段。質(zhì)粒與含目的基因的DNA片段都用EcoR Ⅰ切割，目的基因兩端和質(zhì)粒切口處的黏性末端相同，只考慮兩個(gè)DNA片段相連，則會形成3種連接產(chǎn)物，即質(zhì)粒與質(zhì)粒相連、質(zhì)粒與目的基因相連、目的基因與目的基因相連。(2)為了防止任意連接，可選用EcoRⅠ和SmaⅠ兩種酶同時(shí)切割。 答案：(1)4　質(zhì)粒載體－質(zhì)粒載體連接物　目的基因－目的基因連接物　質(zhì)粒載體－目的基因連接物 (2)EcoRⅠ　SmaⅠ [課時(shí)跟蹤檢測]　 一、選擇題 1．下圖為DNA分子的某一片段，其中①②③分別表示某種酶的作用部位，則相應(yīng)的酶依次是(　　) A．DNA連接酶、限制酶、解旋酶 B．限制酶、解旋酶、DNA連接酶 C．解旋酶、限制酶、DNA連接酶 D．限制酶、DNA連接酶、解旋酶 解析：選C　解旋酶可催化堿基之間氫鍵(①)的斷裂，限制酶可使兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵(②)斷開，而DNA連接酶則催化磷酸二酯鍵(③)的形成。 2．下列關(guān)于DNA重組技術(shù)基本工具的說法，正確的是(　　) A．DNA連接酶只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端 B．微生物中的限制性核酸內(nèi)切酶對自身DNA無損害作用 C．限制酶切割DNA后一定能產(chǎn)生黏性末端 D．質(zhì)粒是基因工程中唯一的載體 解析：選B　DNA連接酶分為兩類：Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，前者只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端連接起來，而后者既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，也可以連接雙鏈DNA片段的平末端。細(xì)菌內(nèi)的限制酶能限制異源DNA的侵入并使之失活，即能將外源DNA切斷，從而保護(hù)自身的遺傳特性。限制酶切割DNA后，產(chǎn)生的末端有黏性末端和平末端兩種。質(zhì)粒是常用的載體，除此之外，基因工程中用到的載體還有λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。 3．玉米的PEPC酶固定CO2的能力較水稻的強(qiáng)60倍。我國科學(xué)家正致力于將玉米的PEPC基因?qū)胨局?，以提高水稻產(chǎn)量。下列有關(guān)該應(yīng)用技術(shù)的敘述，錯誤的是(　　) A．該技術(shù)是在DNA水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的 B．該技術(shù)的操作環(huán)境是生物體內(nèi) C．該技術(shù)的原理是基因重組 D．該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是定向產(chǎn)生人類需要的生物類型 解析：選B　由題意可知，該技術(shù)為基因工程，是在生物體外進(jìn)行的操作。 4．基因工程在操作過程中需要限制酶、DNA連接酶、載體三種工具。以下有關(guān)基本工具的敘述，正確的是(　　) A．所有限制酶的識別序列均由6個(gè)核苷酸組成 B．所有DNA連接酶均能連接黏性末端和平末端 C．真正被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒 D．原核生物內(nèi)的限制酶可切割入侵的DNA分子而保護(hù)自身 解析：選D　大多數(shù)限制酶的識別序列由6個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成；DNA連接酶包括Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，前者只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端連接起來；在基因工程操作中真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。 5．質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列關(guān)于質(zhì)粒的說法正確的是(　　) A．質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)都要整合到染色體DNA上 B．質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外的小型細(xì)胞器 C．基因工程使用的質(zhì)粒一定含有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn) D．質(zhì)粒上堿基之間數(shù)量存在A＋G＝U＋C 解析：選C　基因工程使用的載體需有一至多個(gè)酶切位點(diǎn)，具自我復(fù)制的能力，有標(biāo)記基因，對受體細(xì)胞安全，且分子大小適合。質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后不一定都要整合到染色體DNA上，如宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞則不需整合。質(zhì)粒是小型環(huán)狀雙鏈DNA分子而不是細(xì)胞器，也不會有堿基U。 6．圖1表示DNA的基本結(jié)構(gòu)，圖2表示染色體DNA的片段，箭頭是某種限制酶的識別序列和作用位點(diǎn)，下列相關(guān)說法正確的是(　　) A．圖1中a所示部位即圖2中箭頭所示部位 B．圖2所示的DNA片段被限制酶切割后獲得的末端形式與圖1下端相同 C．Ecoli DNA連接酶可以將兩個(gè)圖1所示結(jié)構(gòu)連接成為一個(gè)DNA片段 D．基因工程的載體必須具有圖2所示的堿基序列 解析：選A　圖2箭頭所示的部位表示兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，圖1中a部位是磷酸二酯鍵；圖2所示的DNA片段被限制酶切割后將獲得黏性末端，而圖1所示的DNA具有的末端是平末端；Ecoli DNA連接酶只可以“縫合”雙鏈DNA片段的黏性末端，圖1所示為平末端；限制酶有多種，基因工程中的載體具有其中一個(gè)或幾個(gè)限制酶識別的序列即可，不必一定含有圖2所示的堿基序列。 7．某線性DNA分子含有3 000個(gè)堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的識別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。下列有關(guān)說法正確的是(　　) a酶切割產(chǎn)物(bp) b酶再次切割產(chǎn)物(bp) 1 600；1 100；300 800；300 A．在該DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有3個(gè)和2個(gè) B．a(chǎn)酶與b酶切出的黏性末端不能相互連接 C．a(chǎn)酶與b酶切斷的化學(xué)鍵不相同 D．用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進(jìn)行反復(fù)切割、連接操作，若干循環(huán)后，序列會明顯增多 解析：選D　a酶切割后形成3個(gè)片段，說明a酶的切割位點(diǎn)有2個(gè)，則識別序列有2個(gè)；b酶切割a酶的切割產(chǎn)物后得到800 bp、300 bp的片段，說明在a酶的產(chǎn)物中，1 600 bp中有一個(gè)切割位點(diǎn)，被切成兩個(gè)800 bp片段，1 100 bp中有一個(gè)切割位點(diǎn)，被切成800 bp片段和300 bp片段，即b酶的識別序列有2個(gè)。a酶與b酶切出的黏性末端可互補(bǔ)，因而能相互連接。a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵均為磷酸二酯鍵。 a酶切割后形成的黏性末端為：　 b酶切割后形成的黏性末端為：　 當(dāng)用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進(jìn)行反復(fù)切割、連接操作后，①和④、②和③的連接產(chǎn)物會增多。 8．下面是四種不同質(zhì)粒的示意圖，其中ori為復(fù)制必需的序列，amp為氨芐青霉素抗性基因，tet為四環(huán)素抗性基因，箭頭表示一種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。若要得到一個(gè)能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的含重組DNA的細(xì)胞，應(yīng)選用的質(zhì)粒是(　　) 解析：選C　A項(xiàng)破壞了復(fù)制必需的序列。B項(xiàng)氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因都完好，在四環(huán)素培養(yǎng)基上和氨芐青霉素培養(yǎng)基上都能生長。C項(xiàng)氨芐青霉素抗性基因被破壞，四環(huán)素抗性基因完好，能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長。D項(xiàng)氨芐青霉素抗性基因完好，四環(huán)素抗性基因被破壞。 9．下表所示為常用的限制酶及其識別序列和切割位點(diǎn)，由此推斷以下說法，正確的是(　　) 限制酶名稱 識別序列和切割位點(diǎn) 限制酶名稱 識別序列和切割位點(diǎn) BamHⅠ ATCC KpnⅠ GGTA EcoRⅠ ATTC Sau3AⅠ ATC HindⅡ GTAC SmaⅠ CCGG 注：Y＝C或T，R＝A或G。 A．限制酶切割后不一定形成黏性末端 B．限制酶的切割位點(diǎn)一定在識別序列的內(nèi)部 C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端 D．一種限制酶只能識別一種核苷酸序列 解析：選A　由表中信息可知，HindⅡ能識別4種不同的核苷酸序列；Sau3AⅠ酶的切割位點(diǎn)在識別序列的外部；BamHⅠ酶與Sau3AⅠ酶切割后能形成相同的黏性末端；SmaⅠ酶切割后產(chǎn)生的是平末端。 10．對下圖所示黏性末端的相關(guān)說法錯誤的是(　　) A．甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制性核酸內(nèi)切酶催化產(chǎn)生的 B．甲、乙具相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，但甲、丙之間不能 C．DNA連接酶作用位點(diǎn)在b處，催化磷酸基團(tuán)和脫氧核糖之間形成化學(xué)鍵 D．切割甲的限制性核酸內(nèi)切酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子 解析：選C　甲圖表示在G和A之間進(jìn)行剪切，乙圖表示在C和A之間進(jìn)行剪切，丙圖表示在C和T之間進(jìn)行剪切，因此三者需要不同的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行剪切；甲和乙的黏性末端相同，能夠通過堿基互補(bǔ)配對形成重組DNA分子，但甲和丙不行；DNA連接酶作用的位點(diǎn)是磷酸二酯鍵，乙圖中的a和b分別表示磷酸二酯鍵和氫鍵；甲和乙形成的重組DNA分子相應(yīng)位置的DNA堿基序列為，而甲圖表示在G和A之間切割，所以該重組序列不能被切割甲的限制性核酸內(nèi)切酶識別。 二、非選擇題 11．下列是基因工程的有關(guān)問題，請回答： (1)限制性核酸內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的__________(填化學(xué)鍵名稱)斷裂，形成的末端總體可分為兩種類型，分別是________________。 (2)目的基因和載體重組時(shí)需要的工具酶是________，與限制性核酸內(nèi)切酶相比，它對所重組的DNA兩端堿基序列____________(填“有”或“無”)專一性要求。 (3)如圖表示的是構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)的某種質(zhì)粒與目的基因。已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。 分析可知，最好選擇限制酶________切割質(zhì)粒，限制酶________切割目的基因所在的DNA，這樣做的好處分別是________________________、_____________________________。 解析：(1)限制性核酸內(nèi)切酶作用的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后形成平末端或黏性末端。(2)目的基因與載體連接需要用DNA連接酶。(3)限制酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—，用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒只會破壞一個(gè)標(biāo)記基因。 答案：(1)磷酸二酯鍵　黏性末端和平末端　(2)DNA連接酶　無　(3)Ⅰ?、颉∶涪袂懈钯|(zhì)粒不會把兩個(gè)標(biāo)記基因都破壞　目的基因兩端均有酶Ⅱ的識別序列 12．目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如下圖所示。 (1)構(gòu)建人工質(zhì)粒時(shí)要有抗性基因，以便于_________________________________。 (2)pBR322分子中有單個(gè)EcoRⅠ限制酶作用位點(diǎn)，EcoRⅠ只能識別序列—GAATTC—，并只能在G和A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)EcoRⅠ的切點(diǎn)，請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端：__________________________________。 (3)pBR322分子中另有單個(gè)的BamHⅠ限制酶作用位點(diǎn)，現(xiàn)將經(jīng)BamHⅠ處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用恢復(fù)________鍵，成功獲得了重組質(zhì)粒，說明_______________________________________________。 (4)為了檢測上述重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無Ampr和Tetr的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結(jié)果(空圈表示與圖二對照無菌落的位置)。與圖三空圈相對應(yīng)的圖二中的菌落表現(xiàn)型是____________________，圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是_____________________________________________________。 解析：(1)質(zhì)粒作為基因表達(dá)載體的條件之一是要有抗性基因，以便于篩選(鑒別)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。(2)同一種限制酶切割DNA分子產(chǎn)生的黏性末端相同，根據(jù)題意可知：該目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端為： 　　　　　　　　目的基因 —G　　　AATTC—…… —G　　　AATTC— —CTTAA　　　G—…… —CTTAA　　　G— (3)DNA連接酶催化兩個(gè)DNA片段形成磷酸二酯鍵；而通過DNA連接酶作用能將兩個(gè)DNA分子片段連接，表明經(jīng)兩種限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。(4)由題意知：由于與圖三空圈相對應(yīng)的大腸桿菌能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，而不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，故可推知與圖三空圈相對應(yīng)的圖二中的菌落能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素。由圖二、圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌都能抗氨芐青霉素，而經(jīng)限制酶BamHⅠ作用后，標(biāo)記基因Tetr被破壞，故導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌不能抗四環(huán)素，即多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是pBR322質(zhì)粒。 答案：(1)篩選(鑒別)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞 (2)如下所示： 　　　　　　　　目的基因 —G　　　AATTC—…… —G　　　AATTC— —CTTAA　　　G—…… —CTTAA　　　G— (3)磷酸二酯　兩種限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同 (4)能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素　pBR322質(zhì)粒 13．(全國卷Ⅲ)圖(a)中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點(diǎn)，圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點(diǎn)是唯一的)。 圖(b) 根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題： (1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_____________________________________________。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達(dá)的原因是_________________________________________________________。 圖(c) (3)DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來的酶，常見的有________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是______________。 解析：(1)由題圖可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制性內(nèi)切酶的共同識別序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此經(jīng)BamHⅠ酶切得到的目的基因可以與圖(b)所示表達(dá)載體被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。(2)在基因表達(dá)載體中，啟動子應(yīng)位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能順利地轉(zhuǎn)錄，再完成翻譯過程，即順利表達(dá)。圖(c)中甲所示的目的基因插入在啟動子的上游，丙所示目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄，因此目的基因不能表達(dá)。(3)常見的DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。 答案：(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄(其他答案合理即可)(3)Ecoli DNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶