細胞工程的理論基礎(chǔ)與應(yīng)用PPT課件

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細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)的分類 培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)類型 細胞在體外可以無限增殖培養(yǎng)嗎？,1,,組織培養(yǎng)的的實質(zhì)，就是模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，即無菌、適當?shù)臏囟?、濕度和一定的培養(yǎng)條件。概括地說，組織培養(yǎng)就是建立活體的結(jié)構(gòu)成分在體外生存生長的適宜環(huán)境。,2,3,培養(yǎng)細胞形態(tài)分類粘附型：附著在培養(yǎng)的固相支持物表面才能生長；絕大多數(shù)細胞屬于此類型，包括 上皮細胞、成纖維 細胞、多角形細胞等 懸浮型：不必附著于固相支持物表面，可在懸浮狀態(tài)下生長；如白細胞、巨噬細胞,4,Lifespan of cultured human cells,Senescence (M1),Crisis (M2),5,細胞工程的理論基礎(chǔ)與應(yīng)用,,6,一、細胞工程的概念,細胞工程（Cell Engineering)指以細胞為對象，應(yīng)用生命科學理論，借助工程學原理與技術(shù)，有目的地利用或改造生物遺傳性狀，以獲得特定的細胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性科學技術(shù)。,7,細胞工程一般指以動植物為研究對象，可以是完整的細胞、組織或器官、胚胎，也可以是原生質(zhì)體、細胞核、染色體、細胞器等。細胞工程與基因工程、酶工程、微生物工程、生物化學工程、蛋白質(zhì)工程、代謝工程一起構(gòu)成了現(xiàn)代生物工程技術(shù)體系。,8,生物工程技術(shù)體系及其發(fā)展關(guān)系,9,細胞生物學是細胞工程的重要理論基礎(chǔ)，此外，遺傳學、分子生物學、發(fā)育生物學、生物化學等也是細胞工程的理論基礎(chǔ)。,10,細胞工程與其他學科、技術(shù)的關(guān)系,11,二、細胞工程的發(fā)展歷史,細胞工程的發(fā)展經(jīng)歷了 探索期、誕生期、快速發(fā)展期,12,1665年英國物理學家Robert Hooke（胡克、虎克）發(fā)現(xiàn)了第一個植物細胞，稱之為“Cell”（小室）。,細胞的發(fā)現(xiàn),13,細胞是生命的基本單位；一切動物和植物都由細胞組成；,德國植物學家 Schleiden (施萊登，1838年)《植物發(fā)生論》德國動物學家 Schwann(施旺，1839年)： 《關(guān)于動植物的結(jié)構(gòu)和生長一致性 的顯微研究》,,細胞學說的誕生,Matthias Jacob Schleiden,Theodar Schwann,14,Rudolf Virchow,1855 德國人R. Virchow 提出 “一切細胞來源于已有的細胞” 的著名論斷；進一步完善了細胞學說。,Cell Theory是19世紀的重大發(fā)現(xiàn)之一，基本內(nèi)容三條： ①有機體是由細胞構(gòu)成的； ②細胞是構(gòu)成有機體的基本單位； ③新細胞來源于已存在細胞的分裂。,15,1885年，Roux發(fā)現(xiàn)雞的神經(jīng)元在生理鹽水中可以存活，并使用“組織培養(yǎng)”一詞。1892年，Driesch利用海膽細胞胚胎分離成單細胞，通過細胞培養(yǎng)獲得了完整幼蟲。1907年，美國學者Harrison使蝌蚪神經(jīng)組織離體培養(yǎng)存活了數(shù)周，且生長出神經(jīng)纖維，開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)先河。,探索期,16,1902年，德國植物學家Haberlandt提出細胞全能性學說，并嘗試進行植物單個細胞離體培養(yǎng)。1937-1938年，Went、Gautheret、Nobercourt幾乎同時成功離體培養(yǎng)胡蘿卜組織，成為植物組織培養(yǎng)的奠基人。1958年，Steward和Reinert發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細胞可分化成體細胞胚，這成為植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域的一個重大突破，同時也驗證了細胞全能性學說。,17,1959年，美籍華人科學家張明覺首次獲得第一個體外受精動物----試管兔。1962年，Capstick成功進行了倉鼠腎細胞的懸浮培養(yǎng)，為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。1958年-1965年，初步建立病毒誘導下的動物細胞融合技術(shù)。1960年，蘭花無性繁殖成功。1960-1970年，建立聚乙二醇誘導植物原生質(zhì)體融合技術(shù)。,誕生期,18,1972年，Carlson通過誘導煙草原生質(zhì)體融合，獲得世界上第一個體細胞雜種植株。1973年，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)，極大促進了植物轉(zhuǎn)基因的研究，并推動了利用轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物、色素、食品添加劑、酶、農(nóng)藥等。,快速發(fā)展期,19,1973年，童第周成功進行核移植，獲得種間雜種魚。1975年，Kohler和Milstein建立小鼠淋巴細胞雜交瘤技術(shù)。1977年，利用胚胎工程技術(shù)成功培育出首例試管嬰兒。1984年，Villadsen利用胚胎細胞克隆出一只綿羊，這是首次通過核移植技術(shù)克隆的哺乳動物。1987年，Gordon獲得分泌組織纖溶酶激活因子tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠，隨后轉(zhuǎn)基因羊、牛、豬的乳腺生物反應(yīng)器相繼成功。,20,1996年7月5日，世界上第一只克隆羊“多利”在英國蘇格蘭盧斯林研究所的試驗基地誕生。證實高等動物體細胞核的全能性。細胞工程歷史上的一個里程碑。,21,Breast cell,22,,,23,John B. Gurdon discovered in 1962 that the specialisation of cells is reversible. In a classic experiment, he replaced the immature cell nucleus in an egg cell of a frog with the nucleus from a mature intestinal cell. This modified egg cell developed into a normal tadpole. The DNA of the mature cell still had all the information needed to develop all cells in the frog.,24,Shinya Yamanaka discovered more than 40 years later, in 2006, how intact mature cells in mice could be reprogrammed to become immature stem cells. Surprisingly, by introducing only a few genes, he could reprogram mature cells to become pluripotent stem cells, i.e. immature cells that are able to develop into all types of cells in the body. (induced pluripotent stem cells, iPS cells),25,三、細胞工程的應(yīng)用,動植物快速繁殖包括試管植物、人工種子、試管動物、克隆動物 2. 新品種培育指在細胞、細胞器、細胞核、染色體或組織水平上進行遺傳性狀改良。包括原生質(zhì)體誘變、細胞融合、單倍體/多倍體育種、雌雄核發(fā)育、胚胎嵌（融）合等技術(shù)。,26,3. 細胞工程生物制品利用動植物細胞、組織培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因動植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物制品。,27,動物細胞生物制藥,哺乳動物細胞表達的蛋白可以經(jīng)修飾成具有活性的蛋白產(chǎn)品，明顯優(yōu)于酵母、大腸桿菌表達系統(tǒng)。倉鼠腎細胞生產(chǎn)狂犬病毒疫苗、乙腦疫苗； 幼地鼠腎（BHK21）細胞生產(chǎn)口蹄疫疫苗； 中國倉鼠卵巢（CHO）細胞生產(chǎn)乙肝疫苗； 2BS細胞和KMB17細胞生產(chǎn)甲肝疫苗； 2BS細胞和MRC5細胞生產(chǎn)水痘疫苗。,28,FDA批準的動物細胞制備藥物： 胰島素、組織纖溶酶激活劑（治療心臟?。?； 促紅細胞生成素（治療貧血）； 白介素（治療腎癌）； 凝血因子III和IV（治療血友病）； 腫瘤壞死因子受體（治療類風濕性關(guān)節(jié)炎）。,29,1975年，英國 科學家Kohler 和Milstein 建立 雜交瘤技術(shù) （hybridoma technique),骨髓瘤細胞 1.體外無限增殖； 2.HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或者TK(胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型,HAT選擇培養(yǎng)基含 次黃嘌呤H、 氨基蝶呤A、 胸腺嘧啶核苷T (阻斷DNA合成的正常途徑及補救途徑,30,基因工程單克隆抗體的制備,31,轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器,將外源基因轉(zhuǎn)入細胞或動植物，利用細胞增殖或動植物代謝制備外源基因的表達產(chǎn)物的技術(shù)----轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器技術(shù)。 被轉(zhuǎn)入外源基因的細胞或動植物----轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器。,32,轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器的特點比較,33,人重組tPA （組織纖維蛋白酶原激活劑） 生產(chǎn)流程,34,胚胎干細胞移植法及顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠,轉(zhuǎn)染,35,細胞工程的應(yīng)用（續(xù)）,4. 細胞療法與組織修復指利用培養(yǎng)的細胞或離體再造的組織修復受損的細胞、組織或器官,36,干細胞（自我更新、分化潛能） 單能干細胞（只能分化為單一類型的干細胞） 多能干細胞 全能干細胞胚胎干細胞 成體干細胞 誘導性多能干細胞Q: 干細胞應(yīng)用存在的問題？,37,組織工程（tissue engineering） 1987年提出，指利用細胞、生物材料、細胞因子實現(xiàn)組織修復或再生的技術(shù)。基本要素：種子細胞、支架材料、細胞因子,38,組織工程的三條技術(shù)路線,,39,