玉米赤霉烯酮ELISA快速檢測試劑盒操作說明書(一)

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1、精品資料 博恒 ? 玉米赤霉烯酮 ELISA 快速檢測試劑盒操作說明書 1 、 簡介 本試劑盒采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附 ELISA 原理快速定量檢測谷物、飼料中的玉米赤 霉烯酮（ ZearaLenone,ZEN ） 。 谷物 / 飼料的前處理包括：提取、過濾、稀釋，處理時間大約為 20-40 分鐘。 本試劑盒的檢測限為：10 ppb ;谷物/飼料中ZEN的回收率 > 80%;批內(nèi)、批間變異 系數(shù) <15% 。 2 、 試劑盒組成 A. 24/48/96 孔 ZEN 酶標(biāo)板： 3/6/12 條X8 孔 B. 20 X濃縮洗滌液：25mL （用蒸儲水稀釋20倍使用） 1瓶

2、 C. ZEN 抗體 : 3/6/12mL 1 瓶 （紅蓋 ） D. 酶標(biāo)二抗： 3/6/12 mL 1 瓶 （綠蓋 ） E. 顯色液： 3/6/12 mL 1 瓶 （藍(lán)蓋 ） F. 終止液 :3/6 mL 1 瓶 （黃蓋 ） G. ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品 :1.5/2mL/ 瓶（ 0、 30 、 60 、 200 、 500ppb ） 各 1 瓶 H. 操作說明書 1 份 注意 ：標(biāo)準(zhǔn)品含有低濃度 ZEN 、終止液含 2 N H 2SO 4 ，需小心取用；勿在有效期外使用本 試劑盒。 3 、 貯存條件與有效期 2- 8 ℃避光貯存，忌 0 ℃以下凍存，有效期見試劑盒內(nèi)蓋。 4 、

3、樣品處理程序 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：配制 60% 甲醇水溶液（ v/v ， 60:40 ）和 20% 甲醇水溶液（ v/v ， 20:80 ） 。 注意：請精確配制上述溶液，以免影響檢測的準(zhǔn)確性 。 稱取 5 g 具有代表性的粉碎樣品于 100 mL 帶塞三角瓶內(nèi)， 準(zhǔn)確加入 25 mL 60% 甲醇 水溶液。 將加入了甲醇水溶液的樣品放入振蕩器內(nèi)（或用手強(qiáng)力振蕩） ，充分振蕩 3 分鐘后，用 whatman 1 號濾紙過濾，收集濾液。 取濾液 2mL ，加入 6 mL 20% 甲醇水溶液，混勻，用 whatman 1 號濾紙過濾，此為 樣品待檢液。 、，、.一、、一 注意 ? 某些

4、樣品待檢液（如花生等）久置影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為保證檢測的準(zhǔn)確性，樣品 提取后請即時檢測。 ? 若樣品待檢液不立即檢測，請將其存儲于棕色玻璃瓶內(nèi)， 2-8 C避光保存。 ? 試劑盒在使用前，請將試劑盒內(nèi)所有試劑放到室溫（ 20- 25 C）進(jìn)行溫度平衡。試齊IJ 用完后立即將其放置回 2- 8 C冰箱內(nèi)保存。 ? 在每個步驟操作時， 速度要快，不要使板孔暴露在空氣中時間過久， 避免酶標(biāo)板變干。 未用完的酶標(biāo)板需密閉于自封帶內(nèi)，防止受潮且避光保存于 2-8 C冰箱內(nèi)。 ? 在溫育時，避免光照，建議將酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi) （在有蓋容器內(nèi)放置一塊平整濕紗布 ） 進(jìn)行溫育。 ? 若樣品數(shù)

5、量超過20份，請用多通道加樣器操作。 5、定量檢測程序 5.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，恢復(fù)至室溫后，打開自封袋，取出所需數(shù)量的板條插 入微孔架，記錄空白、 ZEN標(biāo)準(zhǔn)品①②③④⑤號及樣品的位置（可參照下表所示） 。其 余板條封口后放入冰箱。將 20 X濃縮洗滌液用超純水或蒸儲水稀釋 20倍，待用。 1 2 3-- 12 A 空白 樣品 B 標(biāo)準(zhǔn)品① 樣品 C 標(biāo)準(zhǔn)品② 樣品 D 標(biāo)準(zhǔn)品③ 樣品 E 標(biāo)準(zhǔn)品④ 樣品 F 標(biāo)準(zhǔn)品⑤ 樣品 G 樣品 樣品 H 樣品 樣品 5.2 加樣：空白孔

6、加入100 ^L洗滌液（不加ZEN抗體）。ZEN標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔相應(yīng)地加 入標(biāo)準(zhǔn)品（①②③④⑤ ）和樣品待檢涌0山/孔（如上表所示加入），再加入ZEN抗體 （50 L /孔），此時各孔中溶液體積為 100山。將酶標(biāo)板在水平桌面上輕微振蕩（注意 避免液體濺出），使之混勻，放入濕盒內(nèi)（在有蓋容器內(nèi)放置一塊平整濕紗布 ），37 c溫育 30分鐘。注意：此操作步驟要快，盡量保持前后孔溫育時間一致，每次加樣須更換新的 吸頭。 5.3 洗板：甩出孔中的液體，用洗瓶或移液器將洗滌液加入各孔中 （滿孔），再次甩出孔中液 體，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打以除去孔中的液體， 再重復(fù)操作洗滌步驟三次 （共洗四

7、次）。 5.4 加酶標(biāo)二抗：將洗好的酶標(biāo)板平放，加入酶標(biāo)二抗 100 山/孔，置于濕盒內(nèi)， 37 c溫 育30分鐘。 5.5 洗板：參照5.3 5.6 顯色：將洗好的酶標(biāo)板平放，加入顯色液 100 L /孔，37 c顯色5分鐘（若顯色較淺， 可適當(dāng)延長，但不宜超過 10分鐘）。 5.7 終止及測定：將顯色完畢的酶標(biāo)板取出，加入終止液 50 瓜/孔，輕微震蕩混勻，以空 白孔調(diào)零，在450 nm 處測量吸光值 A （在加入終止液5分鐘內(nèi)讀取吸光值）。 5.8 結(jié)果判定：以ZEN標(biāo)準(zhǔn)品濃度 30ppb、60ppb、200ppb、500ppb 的常用對數(shù)值（1gC） 為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)

8、品相應(yīng)的吸光值 A與0ppb的標(biāo)準(zhǔn)品A值的比值（B/B 0%）為縱坐標(biāo) [B/B 0%=標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的吸光值 /0ppb 標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值X 100%],繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根 據(jù)樣品孔的吸光值計(jì)算樣品的 B/B 0%值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到相應(yīng)樣品中 ZEN的含量（已 考慮樣品提取的稀釋倍數(shù)，結(jié)果無需換算 ）。（或可直接用 RADEWIN 等專用ELISA分析 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出結(jié)果）。如果檢測結(jié)果高于檢測上限，請將待測樣品提取液用 30% 甲醇水（v/v , 30:70 ）稀釋后再檢測，測定結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。 6、限量（定性）檢測程序 樣品處理程序見四，適用于同時定性檢測

9、多個限量標(biāo)準(zhǔn)不同的樣品，以 ZEN標(biāo)準(zhǔn)品③ 號（60ppb）作參照進(jìn)行定性比較，不需作標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品提取液根據(jù)限量標(biāo)準(zhǔn)的不同， 用30%的甲醇水溶液按下表稀釋： 限量標(biāo)準(zhǔn) & 60ppb & 500ppb 待檢樣品提取液 1mL 0.3mL 30%的甲醇水 0 2.2mL 稀釋倍數(shù) 1 50/6 6.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，恢復(fù)至室溫后，打開自封袋，取出所需數(shù)量的板條插入 微孔架，記錄空白、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品③號（60ppb）及樣品的位置，其余板條封口后放入冰箱。 6.2 反應(yīng)：空白孔加入100 匹 洗滌液（不加ZEN抗體）。ZEN標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔相應(yīng)地加

10、 入標(biāo)準(zhǔn)品③號（60ppb）和稀釋后的待檢樣品提取液各 505/孔，再加入ZEN抗體（50 人/孔），將酶標(biāo)板在水平桌面上輕微振蕩 （注意避免液體濺出），使之混勻，置濕盒內(nèi)， 37 c溫育30分鐘。注意：此操作步驟要快，盡量保持前后孔溫育時間一致，每次加樣 須更換新的吸頭。 6.3 洗板：參照5.3 6.4 加酶標(biāo)二抗：參照5.4 6.5 洗板：參照5.5 6.6 顯色：參照5.6 6.7 終止及測定：參照5.7 （目測法不加終止液 ） 6.8 結(jié)果判定：目測法（未加終止液前目測）：比較樣品孔與標(biāo)準(zhǔn)品參照孔的顏色，若樣品 孔顯色比標(biāo)準(zhǔn)品參照淺，則為陽性，樣品中 ZEN的含量超出

11、限量標(biāo)準(zhǔn)；若深者，則為 陰性；若顏色接近，則需用酶標(biāo)儀測吸光值比較。儀器法：酶標(biāo)儀檢測在 450nm 波長 處各孔的吸光值 A,若樣品的 A值 ＜標(biāo)準(zhǔn)參照的 A值，為陽性，表示樣品中 ZEN的含 量超出限量標(biāo)準(zhǔn)；若樣品 A值＞標(biāo)準(zhǔn)參照 A值，為陰性。 7、自備儀器及試劑 酶標(biāo)儀（內(nèi)置 450nm 濾光片）或黃曲霉毒素 B1 專用測定儀 20-200山微量移液器及配套吸頭 恒溫培養(yǎng)箱（ 0℃-50℃） 、冰箱、感量 0.01g 的天平、小型粉碎機(jī)或碾缽 玻璃器皿：三角瓶、燒杯、分液漏斗、蒸發(fā)皿、量筒、具塞試管、滴管、移液管等 其他：甲醇、 whatman 1 號濾紙、吸水紙等 8 、 國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 19540-2004 飼料中玉米赤霉烯酮的測定 薄板層析法和 ELISA 分析法 GB 2715 2005 糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 小麥和玉米中玉米赤霉烯酮限量指標(biāo)為 60科g/kg GB 13078.2-2006 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)飼料和玉米中玉米赤霉烯酮的允許量 500科g/kg 地址：南昌市高新區(qū)火炬大道 201 號江西留學(xué)生創(chuàng)業(yè)園 郵編： 330029 電話： 0791-8130250 傳真： 0791-8130250 可編輯修改