沙門氏菌檢驗詳細流程ppt課件

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GB4789 4 2010食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗 1 沙門菌概況 沙門菌是1885年由Salmon氏等在豬霍亂流行時 分離出的豬霍亂沙門菌 由于Salmon氏對本屬細菌的發(fā)現(xiàn)貢獻卓越 故定名為沙門菌屬 沙門菌屬是腸桿菌科中最重要的病原菌 它是一群抗原結(jié)構(gòu) 生化特性相似的革蘭氏陰性桿菌 血清型繁多 目前已發(fā)現(xiàn)的沙氏菌有2500多個血清型和變種 我國發(fā)現(xiàn)的有250多個血清型 2 沙門菌的分類 根據(jù)生化反應(yīng)不同 分為2個種 腸道沙門菌 Samonellaenterica 腸道亞種 subsp enterica 薩拉姆亞種 subsp salamae 亞利桑那亞種 subsp arizonae 豪頓亞種 subsp houtenae 因迪卡亞種 subsp indica 邦戈爾沙門菌 Samonellabongori 3 沙門菌種和亞種的鑒別 4 沙門氏菌的血清分型 迄今為止沙門氏菌有57個O抗原116個H抗原Vi抗原被分成2500多個血清型 Vi抗原 O抗原 H抗原 5 沙門氏菌命名與書寫方式 目前的命名方法規(guī)定 腸道沙門菌腸道亞種 亞種 給予專用名 并采用標本分離地址的地名 菌名的第一個字母需大寫 且亞種 的所用菌名不能用斜體 例如 腸道沙門菌鼠傷寒血清型應(yīng)書寫為Salmonellaentericasubsp entericaserotypeTyphimurium 但在實際工作中 可簡寫為S Typhimurium 其他沙門氏菌均不給專用名 只在亞種數(shù)字名后直接書寫抗原式 比如S 66 z35 新的血清型名稱的批準必須有巴斯德研究所 德國漢堡衛(wèi)生研究所及美國CDC3個實驗室的一致同意 6 沙門氏菌檢驗程序 7 目的 修復(fù)損傷的細菌細胞 方法 25g mL 樣品 225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中 以8000r min 10000r min均質(zhì)1min 2min 或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中 用拍擊式均質(zhì)器拍打1min 2min 若樣品為液態(tài) 不需要均質(zhì) 振蕩混勻 如使用均質(zhì)袋 可直接進行培養(yǎng) 于36 1 培養(yǎng)8h 18h 前增菌 8 無菌均質(zhì)袋 9 輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物 移取1mL 轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi) 于42 1 培養(yǎng)18 24h 同時 另取1mL 轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi) 于36 1 培養(yǎng)18 24h 分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán) 劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板 或HE瓊脂平板或顯色培養(yǎng)基平板 于36 1 分別培養(yǎng)18 24h XLD瓊脂平板 HE瓊脂平板 顯色培養(yǎng)基平板 或40h 48h BS瓊脂平板 觀察各個平板上生長的菌落 為了最大可能的檢出沙門氏菌 原則上必須使用兩種以上選擇性分離培養(yǎng)基 選擇性增菌與分離 10 分離培養(yǎng)基回收率測定 11 典型菌落 BS 菌落為黑色有金屬光澤 棕褐色或灰色 菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色 有些菌株形成灰綠色的菌落 周圍培養(yǎng)基不變 國產(chǎn)BS 進口BS 12 典型菌落 HE 國產(chǎn)HE 進口HE 藍綠色或藍色 多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色 有些菌株為黃色 中心黑色或幾乎全黑色 13 典型菌落 XLD 進口XLD 國產(chǎn)XLD 菌落呈粉紅色 帶或不帶黑色中心 有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心 或呈現(xiàn)全部黑色的菌落 有些菌株為黃色菌落 帶或不帶黑色中心 14 銅綠假單胞菌也呈紫紅色 可以通過前增菌排除 所以推薦在檢測中的前增菌用TTB 粉紅色 深紅色 干燥菌落 邊緣鋸齒狀等均非沙門氏菌菌落 15 生化試驗 自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落 分別接種三糖鐵 TSI 瓊脂 賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板 取菌落一部分于斜面劃線后穿刺底層 接種針在接種TSI后不要滅菌 直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板 于36 培養(yǎng)18 24h 必要時可延長至48h 16 穿刺TSI方法 17 接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時 可直接接種蛋白胨水 供做靛基質(zhì)試驗 尿素瓊脂 pH7 2 氰化鉀 KCN 培養(yǎng)基 也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種 于36 1 培養(yǎng)18h 24h 必要時可延長至48h 將已挑菌落的平板儲存于2 5 或室溫至少保留24h 以備必要時復(fù)查 18 沙門氏菌屬的三糖鐵和賴氨酸脫羧酶試驗結(jié)果 該表顯示 只有在三糖鐵斜面產(chǎn)酸 底層產(chǎn)酸 同時賴氨酸陰性的菌株可排除 其他反應(yīng)結(jié)果均有沙門菌屬的可能 同時也均有不是沙門菌的可能 19 TSI的反應(yīng)賴氨酸脫羧酶試驗 20 沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表 反應(yīng)序號A1 為典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬 如尿素 KCN和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常 按下表可判定為沙門氏菌 如有2項異常為非沙門氏菌 21 沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表 反應(yīng)序號2 補做甘露醇和山梨醇試驗 沙門菌靛基質(zhì)陽性變體兩項結(jié)果均為陽性 反應(yīng)序號3 補做ONPG ONPG陰性 同時賴氨酸脫羧酶陽性為沙門菌 但甲型副傷寒沙門菌賴氨酸脫羧酶為陰性 22 沙門氏菌屬各生化群的鑒別必要時按此表進行沙門菌生化群鑒定 23 沙門菌的其他鑒定 API20EVITEK32GNI 卡片 24 沙門菌的血清學(xué)鑒定 培養(yǎng)基 一般使用新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面作純培養(yǎng) 取斜面上部培養(yǎng)物作O抗原玻片凝集試驗 下部凝結(jié)水里的培養(yǎng)物作H抗原 H抗原的位相誘導(dǎo)試驗制備半固體瓊脂 融化完全分裝10ml 管 121 滅菌15分鐘 冷至50 備用 取誘導(dǎo)用血清1滴加到小平皿中 傾入冷至50 的10ml半固體瓊脂 輕輕搖勻 凝固 將培養(yǎng)物接種到平板的中央 放入濕盒中培養(yǎng)過夜 取邊緣的菌進行H抗原的檢測 25 血清學(xué)鑒定時的注意要點 做血清凝集時 同時應(yīng)用生理鹽水做對照 O血清不凝集時 可將菌株轉(zhuǎn)接于瓊脂量較高 如2 5 3 的斜面上 再做凝集 如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反應(yīng)時 應(yīng)挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成菌懸液 煮沸后再檢查 常見于傷寒沙門菌 有極少數(shù)的二相沙門菌會同時出現(xiàn)2相H抗原 也有一些沙門氏菌在培養(yǎng)過程中H抗原會出現(xiàn)第1項和第2項之間的轉(zhuǎn)變 所以血清誘導(dǎo)實驗要用新鮮的培養(yǎng)物進行誘導(dǎo) 26 謝謝大家 27