第2章 植物組織培養(yǎng)技術

《第2章 植物組織培養(yǎng)技術》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《第2章 植物組織培養(yǎng)技術（43頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

1、 第2章 植物組織培養(yǎng)技術 第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)概述 一、授課章節(jié) 第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)概述。 二、學時安排 2學時。 三、教學目標 1．掌握植物組織培養(yǎng)的含義。 2．了解植物組織培養(yǎng)的類型劃分。 3．理解植物組織培養(yǎng)的應用原理。 4．掌握植物組織培養(yǎng)的特點和應用。 四、教學重點、難點分析 重點： 植物組織培養(yǎng)的含義、特點和應用。 難點： 植物組織培養(yǎng)的應用原理。 五、教具 電化教學設備，植物組織培養(yǎng)試管苗。 六、教學方法 講授法，多媒體課件。 七、教學過程 Ⅰ.導入 前面我們學習了有關植物育種的一些知識，今天，請看我給同學們看一樣東

2、西(教師拿出試管苗)，問同學們這是什么呢？這就是我們要學的植物組織培養(yǎng)。 II.新課 一、植物組織培養(yǎng)的含義 植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞以及原生質體培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，使其長成完整植株的過程。由于培養(yǎng)物脫離母株在試管內培養(yǎng)，故又稱離體培養(yǎng)、試管培養(yǎng)。 二、植物組織培養(yǎng)的類型 植物組織培養(yǎng)由于分類依據不同可劃分為不同的類型。 植株培養(yǎng)：對幼小植株的培養(yǎng)。 植物組織培養(yǎng) 根據培養(yǎng)對象 器官培養(yǎng)：對根、莖、葉、花、果實、種子等離體器官的培養(yǎng)。 組織培養(yǎng)：對植物體的各部分組織進行的培養(yǎng)。 細胞培養(yǎng)：對單個細胞或較小細胞團的培養(yǎng)。

3、 原生質體培養(yǎng)：對除去細胞壁的原生質體的培養(yǎng)。 根據培養(yǎng)方式 固體培養(yǎng)：加入瓊脂等凝固劑，使培養(yǎng)基固體化，在此培養(yǎng)基上的培養(yǎng)。 液體培養(yǎng)：培養(yǎng)基中不加凝固劑，培養(yǎng)基為液體，在此培養(yǎng)基上的培養(yǎng)。 根據培養(yǎng)過程 初代培養(yǎng)：將外植體進行的第一次培養(yǎng)。 繼代培養(yǎng)：將培養(yǎng)一段時間的培養(yǎng)物轉接到新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)的過程。 光培養(yǎng)：培養(yǎng)過程中需要光照的培養(yǎng)。 暗培養(yǎng)：培養(yǎng)過程中不需要光照的培養(yǎng)。 根據培養(yǎng)條件 三、植物組織培養(yǎng)的應用原理 （一）植物細胞全能性 植物細胞全能性，是指植物體上每個具有完整細胞核的植物細胞，都具有該植物體的全部遺傳信息和產生完整植株的能力。植物

4、的體細胞一旦脫離所在器官或組織的束縛成為離體狀態(tài)時，在一定的營養(yǎng)、激素和外界條件作用下，就可能表現出全能性，而生長發(fā)育成為完整的植株。 （二）細胞的分化和形態(tài)建成 （三）植物的再生功能 四、植物組織培養(yǎng)的特點 （一）研究材料來源單一，無性系遺傳信息相同 （二）試驗經濟，管理方便，工作效率高 （三）培養(yǎng)條件人為控制，可周年連續(xù)進行試驗或生產 （四）生長快，周期短，繁殖率高 五、植物組織培養(yǎng)的應用 （一）優(yōu)良品種的快速繁殖 （二）脫毒及脫毒苗的再繁育 （三）植物新品種的培育 （四）種質資源的保存和交換 （五）有用次生代謝產物的生產 III.作業(yè) 1.簡述植物組織培養(yǎng)的

5、概念和培養(yǎng)類型。 2.植物組織培養(yǎng)技術有哪些特點？ 3.植物組織培養(yǎng)在生產上有哪些方面的應用？ 4.通過學習，你對植物組織培養(yǎng)技術是怎樣理解的？ 第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)廠房的設計與構建 一、授課章節(jié) 第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)廠房的設計與構建。 二、學時安排 2學時。 三、教學目標 1．了解組培工廠的基本結構、各部分結構的具體功能。 2．理解組培工廠的設計原則與總體要求，能夠根據需要和實際情況科學設計組培工廠。 3．掌握廠房的基本組成，儀器設備配備與設計要求。 4．了解常用儀器與用具的使用方法。 四、教學重點、難點分析 重點： 組培工廠的設計原

6、則與總體要求。 難點： 根據需要和實際情況科學設計組培工廠。 五、教具 電化教學設備、組培工廠現場或實驗室。 六、教學方法 講授法，演示法。 七、教學過程 Ⅰ.導入 復習：植物組織培養(yǎng)的概念，類型及應用。 提問：細胞全能性的概念。 上次課我們學習了植物組織培養(yǎng)的基本知識，那么從事植物組織培養(yǎng)的生產需要一些基本的儀器和設備，今天我們來學習植物組織培養(yǎng)的廠房的設計與構建。 II.新課 一、植物組織培養(yǎng)廠房的設計 （一）設計原則 1.環(huán)境清潔、安靜、遠離污染源。 2.按照工作的目的和規(guī)模決定廠房的設計。 3.按照自然工作程序先后合理布局，避免生產環(huán)節(jié)倒排。 4.經

7、濟實用，節(jié)能安全。 （二）具體要求 1.廠房選址時應選擇周圍安靜、陽光充足、無高大建筑物遮擋的環(huán)境；最好在常年主風向的上風方向，盡量減少污染；要求交通便利，便于產品的運送。 2.廠房各車間的大小和比例相對合理，車間的設計和設備的配置、擺放與其功能相適應。 3.廠房必須滿足3個基本的需要：生產準備（器皿洗滌與存放、培養(yǎng)基制備、各種器具的滅菌）、無菌操作和控制培養(yǎng)。 4.廠房的建筑與裝修材料要耐腐蝕，便于消毒和清潔。 （三）廠房基本組成 廠房根據結構和應用范圍一般設計為藥品配制間、洗滌間、培養(yǎng)基制作間、緩沖間、無菌操作間、試管苗培養(yǎng)間、試管苗馴化移植間。 1.藥品配制間 （1）任

8、務：主要用于化學藥品的儲藏、稱量和溶液的配制。 （2）設計要求：干燥、通風、無直射光線。房間內設立工作臺，工作臺最好用抗鹽堿，耐腐蝕的臺面，要牢固、平穩(wěn)，具有較好的抗震性能。注意磁力攪拌器與電子天平要分開臺面放置。 （3）儀器與用具配置：大型工作臺、藥品柜、普通冰箱、電子分析天平、托盤天平、磁力攪拌器、容量瓶、燒杯、量筒等。 2.洗滌間 （1）任務：洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存；外植體的預處理與清洗；試管苗的出瓶、清洗與整理等工作。 （2）設計要求：房間內應寬敞明亮，方便多人同時操作；配備大型水槽，上下水道要暢通；地面、天花板及墻壁應耐濕和便于清潔；應有晾干臺，用于

9、放置洗滌后的培養(yǎng)器皿。 （3）儀器與用具配置：水槽、晾干臺、周轉箱、烘箱等。 3.培養(yǎng)基制作間 （1）任務：主要負責培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。 （2）設計要求：房間寬敞明亮、通風良好，方便多人同時操作；目前滅菌大多采用電加溫，墻體建筑時要預先設計電路線，確保用電線路和滅菌鍋的用電安全。在滅菌鍋上方的墻壁設置換氣窗，利于通風排氣。地面、墻壁應用耐濕材料鋪設，防水、防潮、防腐蝕。 （3）儀器與用具配置：托盤天平、酸度計、工作臺、高壓滅菌鍋、周轉箱、儲物柜等。 4.緩沖間 （1）任務：防止工作人員進出時帶進雜菌。 （2）設計要求：面積一般2～3m2為宜；緩沖間應安裝紫

10、外燈，用以照射滅菌；配備鞋柜、衣柜、拖鞋，用于工作人員進入無菌操作室前在此更衣換鞋， （3）儀器與用具配置：紫外燈、鞋柜、衣柜、工作服等。 5.無菌操作間(接種間) （1）任務：進行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉移。 （2）設計要求：接種室宜小不宜大，一般7~8m2。地面、天花板及四壁要求盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置推拉門，以減少開關門時的空氣擾動。房間密閉，干爽安靜，清潔明亮。在適當位置吊裝1~2盞紫外燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。 （3）儀器與用具配置：超凈工作臺、紫外燈、空調機、醫(yī)用小推車、接種器具消毒器、酒精燈、

11、接種工具、擱物架等。 6.試管苗培養(yǎng)間 （1）任務：接種材料的培養(yǎng)生長。 （2）設計要求：培養(yǎng)間的大小可根據生產規(guī)模和培養(yǎng)架的大小、數目及其它附屬設備而定。其設計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁和天花板要求光滑平坦、有絕熱防火的性能。能夠控制光照和溫度，并保持相對的無菌環(huán)境；適當位置安裝紫外燈進行照射滅菌。 （3）儀器與用具配置：培養(yǎng)架、空調機、光照時控器、溫度計、搖床等。 7.試管苗馴化移植間 （1）任務：進行試管苗的馴化和移植。 （2）設計要求：通常在日光溫室內進行，其面積大小根據生產規(guī)模而定。要求能夠控溫調濕、控光通風、控菌防蟲。 （3）儀器

12、與用具配置：移栽容器、彌霧裝置、遮陽網、移栽基質等。 二、基本儀器設備和用具 （一）滅菌設備 1.濕熱滅菌設備（高壓蒸汽滅菌鍋）：用于培養(yǎng)基、玻璃器皿以及其它可高溫滅菌用品的滅菌，根據規(guī)模大小有小型手提式、中型立式、大型臥式等不同規(guī)格；根據控制方式分為手動控制、半自動控制和全自動控制等不同類型。 2.過濾滅菌設備（防細菌濾膜）：防細菌濾膜的網孔直徑為0.45μm以下，當溶液通過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。主要用于赤霉素、玉米素、脫落酸等不耐熱物質的滅菌。 3.干熱滅菌設備：利用高溫烘烤或灼燒的

13、方法進行滅菌，包括烘箱（器皿和器械的滅菌）、酒精燈（用于接種工具的滅菌）、接種器械滅菌器等。 4.其它滅菌設備：利用紫外光波、超聲波、臭氧等殺菌，主要用于對空氣和物體表面進行消毒。常用設備包括紫外燈、超聲波清洗器、臭氧發(fā)生器等。 （二）接種設備與用具 1.超凈工作臺：超凈工作臺是植物組織培養(yǎng)最常用、最普及的無菌操作裝置。根據風幕形成的方式可分為水平風和垂直風兩種；根據使用方式分為單人單面、雙人單面、雙人雙面等。 2.接種工具：外植體接種或培養(yǎng)物繼代轉接時使用的各種工具。常用的有： 尖頭鑷：用于分離植物組織等； 槍型鑷：用于夾取植物器官繼代轉接和外植體接種； 解剖剪：用于幼嫩組織、

14、細胞團等剪??； 彎頭剪：用于轉接、剪取試管苗莖段等； 解剖刀：用于外植體或培養(yǎng)物切割； 接種針：用于莖尖剝離和愈傷組織轉移； 切割盤：用于原球莖、愈傷組織、植物器官等切割分離。 3.顯微鏡：包括雙目體視顯微鏡(解剖鏡)、生物顯微鏡、倒置顯微鏡和電子顯微鏡，用于剝離莖尖和進行培養(yǎng)物的觀察、分析、拍照等。 （三）培養(yǎng)設備與用具 1.培養(yǎng)架：試管苗在培養(yǎng)間里培養(yǎng)時通常擺放在培養(yǎng)架上。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設5～8層，最低一層離地高約20cm，其他每層間隔30cm左右。培養(yǎng)架長度根據日光燈的長度而設計，如采用40W日光燈，則長1.3m，寬度一般為60cm。 2.恒溫振蕩器：用于液體

15、培養(yǎng)時改善培養(yǎng)過程的氧氣供應狀況。 3.光照培養(yǎng)箱：對于一些對環(huán)境條件要求特別嚴格的培養(yǎng)物，可培養(yǎng)在能自動調控溫度、濕度、光照等的智能光照培養(yǎng)箱里。 4.培養(yǎng)器皿：根據培養(yǎng)目的和要求不同，可選用不同類型和規(guī)格的培養(yǎng)容器。 （1）三角瓶：主要用于外植體靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或試管苗繼代培養(yǎng)。規(guī)格有50mL，l00mL，150mL，250mL，500mL等，一般使用l50mL三角瓶。優(yōu)點：其培養(yǎng)面積大，利于組織生長；透光度好；由于瓶口較小，不易污染。 （2）試管：主要用于莖尖培養(yǎng)、液體培養(yǎng)。試管要求口徑大，長度稍短、以2cm×15cm、2.5cm×15cm、3cm×15cm 為宜。優(yōu)點：占空間

16、少，單位面積容納的數量多。 （3）果醬瓶：主要用于繼代和生根培養(yǎng)。優(yōu)點：在工廠化大批量生產時使用，價格低廉，成本低；口徑較大，便于操作。缺點：污染率較高；透光性稍差。 （4）塑料瓶：主要用于蘭科植物的培養(yǎng)。有100mL、150mL、200mL、250mL的規(guī)格。優(yōu)點：密封好、透氣性差、瓶內濕度大；質輕，便于操作，不易破損，污染率低；長方盒形的培養(yǎng)株數多，且疊摞起來節(jié)約空間。缺點：可重復利用性較差。 （四）稱量設備與用具 1.天平：用于進行瓊脂、蔗糖和各種藥品的稱量，需要有稱量微量元素和植物激素等的分析天平；稱量大量元素、蔗糖和瓊脂等的托盤天平等不同精度的天平。 2.燒杯：用于配制培養(yǎng)

17、基母液時溶解各種化合物，規(guī)格有50～1000mL不等。 3.量筒：用于量取不同體積的液體，規(guī)格有50～1000mL不等。 4.試劑瓶：用于貯存不同容量的溶液，規(guī)格有50～1000mL不等。 5.移液管：用于吸取各種用量較少的母液，規(guī)格有0.1～10mL不等。 6.容量瓶：用于配制培養(yǎng)基母液時進行定容，規(guī)格有50～1000mL不等。 （五）環(huán)境控制設備與用具 1.空調機：自動控制植物組織培養(yǎng)廠房的溫度，為培養(yǎng)物提供最適宜的溫度條件。 2.冰箱：用于母液和某些試劑的貯存及培養(yǎng)材料的保鮮或與處理等。 3.光照時控器：用于自動控制培養(yǎng)間的光照時間。 （六）其它設備與用具 1.磁力攪

18、拌器：磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質，如各種化學物質等。磁力攪拌器還可加熱，加快物質的溶解。 2.蒸餾水發(fā)生器或純水機：用于制備配制母液和培養(yǎng)基的蒸餾水或去離子水。 3.藥品柜：用于存放各種化學藥品。 4.加熱設備：制備固體培養(yǎng)基時需加熱使固化劑溶化，因此需要加熱設備如液化氣灶、電爐、恒溫水浴鍋等。 5.pH計：用于精確測量和調節(jié)培養(yǎng)基的pH，大規(guī)模生產中一般用精密pH試紙代替。 III.作業(yè) 1.植物組織培養(yǎng)廠房的設計原則和要求有哪些？ 2.植物組織培養(yǎng)的工藝流程是怎樣的？ 3.組建一個植物組織培養(yǎng)生產車間應包括哪幾部分，各部分的設計要求以及主要功能是什么？ 4.植物組織

19、培養(yǎng)需要哪些基本設備，各有何作用？ 第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術（1） 一、授課章節(jié) 第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術（1）。 二、學時安排 2學時。 三、教學目標 1．掌握組培的一般工作程序。 2．掌握不同類型培養(yǎng)器皿和用具的洗滌技術。 3．了解常用消毒滅菌方法的原理，掌握其操作技術，能根據物品種類正確選用消毒滅菌方法。 四、教學重點、難點分析 重點： 常用的消毒滅菌技術。 難點： 滅菌和消毒的區(qū)別及無菌意識的樹立。 五、教具 電化教學設備。 六、教學方法 講授法，演示法。 七、教學過程 Ⅰ.導入 提問：植物組織培養(yǎng)實驗室的基本構成。 本次

20、課主要介紹的是植物組織培養(yǎng)洗滌和消毒滅菌技術。 II.新課 一、洗滌技術 植物組織培養(yǎng)除了要對培養(yǎng)材料和接種用具進行嚴格消毒外，各種用具更要求洗滌清潔，因為各種滅菌方法的有效作用時間都是以材料或用具清潔為前提的。 （一）洗滌液 1.洗衣粉、洗潔精洗滌液 適用于玻璃器皿和金屬類器具的洗滌。 2.鉻酸洗滌液 由重鉻酸鉀和濃硫酸混合而成，屬強氧化劑，對無機離子、灰塵效果好，對油污無效。 鉻酸洗滌液的配制：稱取重鉻酸鉀50g，加入1L蒸餾水，加熱攪拌至完全溶解；冷卻后注入90mL濃硫酸，混合均勻即可。剛配好的洗液是棕紅色，反復使用至變成青褐色則失效。 【注意事項】（1）配制時重鉻酸

21、鉀溶液一定要冷卻后才能加濃硫酸，且只能把濃硫酸緩慢加入重鉻酸鉀溶液中，決不能將重鉻酸鉀溶液或蒸餾水倒入濃硫酸中。（2）由于鉻酸洗滌液具有極強的氧化能力和腐蝕作用，故不要用手直接接觸洗滌液。 （二）各類器皿和用具的洗滌方法 1.新的玻璃器皿：使用前先用1%稀鹽酸浸泡12～24h→用毛刷蘸洗衣粉水刷洗干凈→流水沖洗3～4次→最后用蒸餾水沖淋1遍→晾干（或烘干）后備用。 2.已用過的培養(yǎng)器皿：除去容器內的殘渣→自來水沖洗→浸泡在洗衣粉水中15～30min→用毛刷刷洗干凈→流水沖洗3～4次→最后用蒸餾水沖淋1遍→晾干（或烘干）后備用。 3.已被霉菌等雜菌污染的器皿：121℃高溫高壓蒸汽滅菌30

22、min→趁熱倒去殘渣→自來水沖洗→浸泡在洗衣粉水中15～30min→用毛刷刷洗干凈→流水沖洗3～4次→最后用蒸餾水沖淋1遍→晾干（或烘干）后備用。 4.移液管、量筒等量器：鉻酸洗滌液中浸泡2h以上→取出后在流水中沖洗30min→蒸餾水沖淋1次→晾干（或烘干）后備用。 5.載玻片和蓋玻片：洗滌液中浸泡數小時→水洗→綢布擦干→放在95%的灑精中備用。 6.解剖刀、鑷子、剪刀等：新購置金屬器皿因其上有潤滑油或防銹油，用蘸有四氯化碳的棉布擦去油脂，再用濕布擦凈，干燥備用。每次使用后先用洗衣粉水刷洗，再用酒精擦拭。 二、滅菌與消毒技術 （一）滅菌與消毒的區(qū)別 1．有菌和無菌的范疇 有菌的范

23、疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。 無菌的范疇是：經高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經其他理化滅菌方法處理后的物體一般可認為是無菌的。 2.滅菌與消毒的區(qū)別 滅菌是指用物理或化學方法殺死物體表面和孔隙內一切微生物或生物體。 消毒是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。 由滅菌和消毒的含義可以看出，二者的主要區(qū)別是：滅菌是把所有有生命的物質全部殺死；而消毒主要殺死或抑制物體表面的微生物，但芽孢、厚垣孢子一般不會死亡。 （二）常用的消毒滅菌方法 （三）消毒滅菌技術 1.環(huán)境消毒：方法主要有空氣過濾滅菌、紫外線照射消毒、

24、噴霧消毒和熏蒸消毒等。 ●空氣過濾滅菌：成規(guī)模的植物組織培養(yǎng)車間可采用空氣過濾系統(tǒng)對整個環(huán)境進行空氣過濾滅菌，這種方法投入較高，操作要求比較嚴格，一般較少采用。組織培養(yǎng)中普遍采用的是對無菌操作的微環(huán)境進行空氣過濾滅菌，如超凈工作臺的局部無菌環(huán)境。 ●紫外線照射消毒：利用紫外光波照射滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質和核酸發(fā)生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。緩沖間、接種間、培養(yǎng)間等均可采用紫外線照射消毒，一般照射20~30min。 ●噴霧消毒：利用70%～75%的酒精或0.2%的新潔爾滅對環(huán)境進行噴霧，既可以起到直接殺死環(huán)境中微生物的作用，又可以使飄浮的塵埃降落，防止塵埃上附著的雜菌

25、污染培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料。 ●熏蒸消毒：利用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，按2mL／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加0.2g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間可預先噴濕，關閉緊密，24h后打開門窗通風。 2.用具的消毒滅菌：根據用具種類不同分別采用干熱滅菌、濕熱滅菌、浸泡消毒、擦拭消毒等方法。 ●干熱滅菌：利用烘箱進行烘烤滅菌的方法，適用于各種玻璃器皿和器械的滅菌消毒。方法是將清洗后的玻璃器皿和器械妥為包扎，放入箱內，將箱溫控制在150～170℃，烘烤120min，即可達到滅菌效果。在干熱條件下，細菌的營

26、養(yǎng)細胞抗熱性大為提高，故能源消耗大，又浪費時間，所以目前多采用濕熱滅菌代替，接種工具也可采用消毒器烘烤和酒精燈外焰灼燒的方法消毒。 ●濕熱滅菌：適用于培養(yǎng)基、玻璃器皿、棉塞、布制品及金屬用具等的滅菌，一般滅菌掌握在0.1～0.15MPa壓力下20～30min。 ●浸泡消毒：在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入70%～75%的酒精中浸泡，使用之前取出在酒精燈外焰上灼燒，待冷卻后使用。 ●擦拭消毒：接種用具及超凈工作臺表面等使用前可用70%酒精或0.1~0.2%新潔爾滅溶液進行擦拭消毒。 3.培養(yǎng)基滅菌：培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌，特殊情況下采用過濾無菌。 ●濕熱滅菌：采用高壓蒸汽滅

27、菌鍋滅菌。 ●過濾滅菌：主要針對一些不能處于高溫高壓環(huán)境的物質，如GA3、IAA、ABA（脫落酸）、ZT（玉米素）、部分維生素、多數抗生素和酶。過濾滅菌的原理是細菌濾膜的網孔直徑為0.45μm以下，當溶液通過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子（直徑1μm以上）等因大于濾膜網孔直徑而被阻。 4.外植體消毒：從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物，因此，植物材料必須經嚴格的表面消毒處理。接種的植物材料叫做外植體。外植體的消毒要求比較嚴格，既要能有效殺滅微生物，又要保證植物組織盡量少受傷害。外植體一般采用浸泡消毒的方法，具體方法在以后課程中講授。 III.作業(yè) 1.不同的培養(yǎng)器皿

28、怎樣選擇與洗滌？ 2.植物組織培養(yǎng)環(huán)境如何進行消毒滅菌？ 3．過濾滅菌的技術原理？ 第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術（2） 一、授課章節(jié) 第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術（2）。 二、學時安排 2學時。 三、教學目標 1．掌握培養(yǎng)基的作用。 2．掌握培養(yǎng)基中生長調控物質的作用。 3．了解培養(yǎng)基的類型。 四、教學重點、難點分析 重點： 培養(yǎng)基的基本成分。 難點： 培養(yǎng)基中生長調節(jié)物質的作用。 五、教具 電化教學設備。 六、教學方法 講授法，演示法。 七、教學過程 Ⅰ.導入 培養(yǎng)基是進行植物組織培養(yǎng)的基質，進行植物組織培養(yǎng)必須掌握培養(yǎng)基的基本知識，

29、今天我們就學習培養(yǎng)基的種類和基本成分。 II.新課 三、培養(yǎng)基制備技術 （一）配制培養(yǎng)基的目的 配制培養(yǎng)基的目的是人為提供離體培養(yǎng)材料的營養(yǎng)源。配制的不同培養(yǎng)基，是為滿足不同類型植物材料對營養(yǎng)的不同需要。沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一種合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。 （二）培養(yǎng)基的種類 1.培養(yǎng)基的種類劃分 培 養(yǎng) 基 種 類 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)。 根據形態(tài) 液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中沒有凝固劑為液體狀態(tài)。 根據培養(yǎng)階段 根據培養(yǎng)進程 根據營養(yǎng)水平 初代培養(yǎng)基：初

30、代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。 繼代培養(yǎng)基：繼代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。 完全培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入適宜的植物激素和有機附加物的培養(yǎng)基。 基本培養(yǎng)基：只含有無機鹽、蔗糖、維生素和水等最基本成分的合成培養(yǎng)基。如Ms、White、Nitsch、N6等培養(yǎng)基。 誘導培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)時誘導外植體生長與脫分化的培養(yǎng)基。 增殖培養(yǎng)基：繼代培養(yǎng)中促進培養(yǎng)物快速增殖的培養(yǎng)基，也稱擴繁培養(yǎng)基。 生根培養(yǎng)基：誘導試管苗生根的培養(yǎng)基。 2.常用培養(yǎng)基的配方和特點 目前已公開報道的基本培養(yǎng)基有許多種類，各有不同的特點和適用范圍，在植物組織培養(yǎng)生產中應根據不同的植物種類和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的

31、選用不同的培養(yǎng)基。 常用的培養(yǎng)基配方： 表1 常用培養(yǎng)基配方 含量（mg/L） MS（1962） B5（1968） White （1943） SH （1972） Knudson C （1946） VW （1949） N6 （1974） (NH4)2S04 NH4N03 KN03 Ca(N03)2·4H20 CaCl2·2H20 Ca3(PO4)2 1650 l900 440 134 2500 150 80 200 2500 200

32、 500 1000 500 525 200 463 2830 166 MgS04·7H20 KH2PO4 NaH2P04·H20 Na2SO4 Na2—EDTA 370 170 37.3 250 150 37.3 720 17 200 400 15 250 250 250 250 185 400 37.3 FeSO4·7H20 Fe2(SO4)3 KCl Fe2(C4H4O6)3 27.8 27.8 2.5

33、 65 20 25 28 27.8 NH4H2PO4 MnSO4·H20 MnS04·4H20 ZnSO4·7H20 H3B03 KI Na2Mo04·2H20 MoO3 CuSO4·5H20 CoCl2·6H20 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 10 2.0 3.0 0.75 0.25 0.025 0.025 5 3 1.5 0.75 0.001 0.01 300 10 1.0 5.0 1.0 0.1

34、0.2 0.1 7.5 7.5 4.4 3.8 1.6 0.8 鹽酸硫胺素VBl 煙酸 鹽酸吡哆醇VB6 肌醇 甘氨酸 0.1 0.5 0.5 100 2.0 10 1.0 1.0 100 0.1 0.3 0.1 3 5.0 5.0 5.0 1000 1 0.5 0.5 2 蔗糖 pH 30000 5.8 20000 5.5 20000 5.6 30000 5.8 20000 5.8 20000 5.5 50000 5.8 表2

35、常用基本培養(yǎng)基的特點 基本培養(yǎng)基種類 設計由來 特點 適用范圍 MS 1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計 無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液；它的硝酸鹽和銨鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，比例也比較合適，不需要添加更多的有機附加物。 廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養(yǎng) B5 1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計 除含有較高的鉀鹽外，還含有較低的氨態(tài)氮和較高的鹽酸硫胺素 適合雙子葉植物，尤其木本植物的培養(yǎng) White 1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計 無機鹽數量較低，提高了MgSO4的濃度 適于生根培養(yǎng)

36、 SH 1972年由Schenk和Hidebrandt設計 鹽分濃度較高，銨態(tài)氮含量較低，鹽酸硫胺素和硝酸鉀含量較高 在不少單子葉和雙子葉植物的組培中應用效果較好 Knudson C 1922年由Knudson為蘭科種子培養(yǎng)而設計，后經多次改良 成分簡單，不能滿足大多數植物組織細胞的生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質 適用于蘭科植物種子培養(yǎng)和萌發(fā) VW Vacin 和Went 在1949年設計 培養(yǎng)基的總離子強度稍低些，磷以磷酸鈣的形式供給 適用于氣生蘭的組培 N6 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計 成分較簡單，KN03和(NH4)2S04含量高 適用

37、于單子葉植物花藥培養(yǎng)，廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng) （三）培養(yǎng)基的組成 培養(yǎng)基主要有水、無機鹽、有機物、植物生長調節(jié)物質、培養(yǎng)基的支持材料五大類組成。 1.水 水是植物原生質體的組成成分，也是一切代謝過程的介質和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以確保母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質，大規(guī)模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。 2.無機元素 (1)大量元素指濃度大于0.5 mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KC

38、l、MgS04·7H20、CaCl2·2H20等化合物來提供。 (2)微量元素指濃度小于0.5 mmol／L的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。 鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時，它又是葉綠素形成必要的。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉綠有促進作用。在制作培養(yǎng)基時不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其pH在5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeS04·7H20和Na2-EDTA結合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質會導致生長發(fā)育異常。 3.有機化合物 (1)糖類

39、：這類有機物的作用一是培養(yǎng)物賴以生長的碳源；二是使培養(yǎng)基維持一定的滲透壓。 · 種類：常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖，麥芽糖、半乳糖、甘露糖等在組織培養(yǎng)中也有應用。 · 使用濃度：一般在2％～3％。 ※在大規(guī)模生產時，可用食用的綿白糖代替。 （2）維生素類：這類化合物在植物細胞中主要以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。 · 種類：硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、煙酸(維生素B3，又稱維生素PP)、泛酸(維生素B5)、生物素(維生素H)、鈷胺素(維生素B12)、葉酸(維生素B11）等。 · 使用濃度：0.1～1.0 mg/L (3)肌醇(環(huán)己六

40、醇)： · 作用：在糖類的相互轉化中起重要作用；參與細胞壁和細胞膜的構建；能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成；對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用。 · 使用濃度：一般為1OO mg／L。 (4)氨基酸： · 作用：是很好的有機氮源，可被細胞直接吸收利用。 · 常用種類：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。有時應用水解乳蛋白（LH）或水解酪蛋白（CH），但由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。 (5)天然復合物：其成分比較復雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化

41、作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般盡量不使用。 · 椰乳 是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復合物，一般使用濃度在10％～20％。它在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中有促進作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進作用，但莖尖組織的大小若超過1 mm時，椰乳就不發(fā)生作用。 · 香蕉 用量為150～200 g/L。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應用，對原球莖增殖有明顯促進效果，并有利于壯苗與生根。 · 馬鈴薯 去掉皮和芽后，加水煮30 min，經過過濾，取其濾液使用。用量為150～200 g／L。添加后可得到健壯的植株。 4.植物生長調節(jié)物質 植物生長調節(jié)物質是培養(yǎng)基的

42、關鍵性物質，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用，控制著培養(yǎng)物的脫分化、再分化和形態(tài)建成。 （1）生長素類： · 作用：在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長。 · 種類及活性：常用種類有IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)等。作用能力的強弱順序為：2，4-D＞NAA＞IBA＞IAA。 · 穩(wěn)定性：IAA是天然存在的生長素，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解，故要避光貯存，過濾滅菌。其他3種生長素為人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞。特別是NAA穩(wěn)定性好，活性較高

43、，價格低廉，所以應用最普遍。 · 溶解性：生長素不溶于水，IAA、NAA、IBA配制時可先用少量95％酒精助溶。2，4-D可用0.1 mol／L的NaOH或KOH助溶。 （2）細胞分裂素類： · 作用：①誘導芽的分化促進側芽萌發(fā)生長，細胞分裂素與生長素相互作用，當組織內細胞分裂素／生長素的比值高時，誘導愈傷組織或器官分化出不定芽。②促進細胞分裂與擴大。③抑制根的分化。因此，細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時使用。 · 種類及活性：這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-芐氨基嘌呤)、Kt(激動素)、Zt(玉米素)等。作用能力的強弱順序是：ZT＞6-B

44、A＞KT，常用的是人工合成的、性能穩(wěn)定的、價格適中的6-BA。 · 溶解性：細胞分裂素不溶于水，也不溶于酒精，一般可溶于0.1mol/L的鹽酸或NaOH溶液中。 （3）赤霉素(GA)：有20多種，培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。 赤霉素溶于酒精，配制時可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％-100％失效，應當過濾滅菌。 生長調節(jié)物質的使用量甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調節(jié)物質的使用濃度，因植

45、物的種類、部位、時期、內源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0.05～5 mg／L，細胞分裂素0.05～10 mg／L。 5.培養(yǎng)基的其他成分 (1)瓊脂：在固體培養(yǎng)時瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在90℃以上熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量在6～10 g／L之間。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH等因素有關，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也

46、會逐漸喪失凝固能力。 加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比，優(yōu)點在于操作簡便，通氣問題易于解決，便于經常觀察研究等，缺點是培養(yǎng)物的吸收面積?。桓鞣N養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用；培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產生毒害作用。 (2)抗生物質：抗生物質有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20 mg／L之間。添加抗生物質可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失?？股馗饔衅湟志V，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但應當注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用。 （3）抗氧化物：培養(yǎng)基中添加抗氧化物是為了抑制外植體和培養(yǎng)物褐變。常用的抗氧化劑有半胱氨酸、維生素C、檸

47、檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。 （4）活性炭：活性炭有很強的吸附作用，它可以吸附非極性物質和色素等大分子物質，包括瓊脂中所含的雜質，培養(yǎng)物分泌的酚類、醌類物質及激素等。通常使用濃度為0.1～10g／L。 培養(yǎng)基中添加活性炭的作用：防止褐化；促進生根；降低玻璃苗的產生頻率；活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用。但是，活性炭具有副作用：吸附培養(yǎng)基中的生長調節(jié)物質；削弱瓊脂的凝固能力，添加時須注意。 III.作業(yè) 1.培養(yǎng)基的作用是什么？ 2.培養(yǎng)基一般包括哪些基本成分？ 3. 培養(yǎng)基中添加的植物生長調控物質有哪些？ 各有什么作用？ 第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術（3） 一、授課章

48、節(jié) 第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術（3）。 二、學時安排 2學時。 三、教學目標 1．掌握培養(yǎng)基母液的配制技術。 2．掌握培養(yǎng)基的配制、分裝包扎技術。 3．掌握培養(yǎng)基高壓滅菌技術。 4．掌握無菌操作技術。 四、教學重點、難點分析 重點： 1．培養(yǎng)基母液配制。 2．培養(yǎng)基的制備技術。 3．培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌。 4．無菌操作技術。 難點： 1．培養(yǎng)基母液、培養(yǎng)基配制的計算。 2．無菌操作技術步驟的剖析。 五、教具 電化教學設備、試管苗、接種工具、培養(yǎng)基。 六、教學方法 講授法，模擬實驗法。 七、教學過程 Ⅰ.導入 提問：培養(yǎng)基的作用。 復習：

49、培養(yǎng)基的基本成分。 II.新課 （四）培養(yǎng)基的配制 1.培養(yǎng)基母液的配制：所謂母液是欲配制培養(yǎng)液的濃縮液，也稱貯備液。母液配制的目的一是方便快速配制培養(yǎng)基，二是保證各物質成分的準確性及配制時的快速移取。 （1）母液配制方法 ●單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般mg/mL表示。 ●混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數稱量，分別溶解后各類混合在一起定容到一定體積配成混合母液。 （2）母液配制流程 確定培養(yǎng)基配方 確定母液種類 計算 稱量 溶解 混合定容 分裝 貼標簽 冰箱保存 記錄 （3）母液配制要求 ●母液濃縮倍

50、數：大量元素10～20倍；微量元素100～200倍；鐵鹽100倍；有機物100～200倍。 ●選用蒸餾水，分析純或化學純試劑，防止沉淀。 ●激素母液濃度：0.5～1mg/mL，1次配成50mL或100mL （4）藥品用量的計算：配制母液時藥品用量(mg)=配方用量(mg)×濃縮倍數×制備容量（L） （5）母液配制技術 以MS培養(yǎng)基為例，配制過程如下： 表1 MS培養(yǎng)基母液配制（單位：mg/L） 母液種類 成分 規(guī)定量 擴大倍數 稱取量 母液體積(mL) 配1L培養(yǎng)基吸取量(mL) 大 量 元 素 KNO3 NH4N03 MgSO4·7H20 KH2P

51、04 CaCl2·2H2O 1900 1650 370 170 440 10 19000 16500 3700 1700 4400 1000 100 微 量 元 素 MnS04·4H20 ZnS04·7H20 H3B03 KI Na2Mo04·2H20 CuS04·5H20 CoCl2·6H20 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 100 2230 860 620 83 25 2.5 2.5 l000 10 鐵 鹽 Na2EDTA FeS04·4H20 37.3 2

52、7.8 100 3730 2780 1000 10 有 機 物 甘氨酸 鹽酸硫胺素 鹽酸吡哆醇 煙酸 肌醇 2.0 0.1 0.5 0.5 100 100 200 10 50 50 10000 1000 10 ●大量元素母液 配成濃縮10倍的母液。用感量0.01g托盤天平按表2-4稱取藥品，分別加入100mL左右蒸餾水中，再用磁力攪拌器攪拌促進溶解，然后倒入1000mL容量瓶中，再加水定容至刻度，成為10倍母液。注意Ca2+和SO42、PO43易發(fā)生沉淀，因此CaCl2·2H2O充分溶解后最后加入。 ●微量元素母液 配成濃縮100倍的

53、母液。用感量0.0001g分析天平按表2-4準確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至1000mL。 ●鐵鹽母液 配成濃縮100倍的母液，用感量0.01g托盤天平按表2-4稱取藥品，分別溶解，混合后加水定容至1000mL。 ●有機物母液 配成濃縮100倍的母液。用感量0.001g分析天平按表2-4分別稱取藥品，溶解，混合后加水定容至1000mL。 ●每種激素必須單獨配成母液，濃度一般配成0.5～1mg／mL，用時根據需要取用。多數激素難溶于水，要先溶于特定溶劑，然后才能加水定容。具體方法為：IAA、IBA、GA、NAA等先溶于少量95％的酒精中，再加水定容到一定體積；2，4-D可用少

54、量0.1mol/L的NaOH溶解后，再加水定容到一定體積；Kt和BA先溶于少量0.1mol/L的HCl中再加水定容。 （6）母液的保存 將配制好的母液分別倒入試劑瓶中，貼好標簽，在標簽上注明母液名稱，配制倍數與日期。然后放入冰箱內4℃低溫保存，用時再按比例稀釋。 2.培養(yǎng)基的配制 （1）培養(yǎng)基配制工藝流程 確定培養(yǎng)基 配方及用量 計算母液用量 移取母液 定容 玻璃器皿洗滌 調節(jié)pH 分裝 培養(yǎng)基熬制 高壓滅菌 干燥 稱取瓊脂、蔗糖 封口 標識、記錄 （2）培養(yǎng)基制備的操作步驟 ●確定培養(yǎng)基配方及用量：根據培養(yǎng)對象、培養(yǎng)目的等，通過查閱資料及咨詢等

55、確定培養(yǎng)基配方，然后據外植體的數量和試驗處理的多少確定培養(yǎng)基的用量。 ●稱取瓊脂、蔗糖：用托盤天平分別稱取0.6%～1%的瓊脂、2%～3%的蔗糖。 ●培養(yǎng)基熬制：量取純凈水放入加熱容器，純凈水的體積應少于所配制培養(yǎng)基體積，約占終體積的2/3~3/4，加入稱量好的瓊脂和糖，接通電源加熱。邊加熱邊攪拌，防止糊底和溢出，至完全溶化。 ●母液取用量的計算： 基本培養(yǎng)基配方成分母液取用量（mL）=1000÷濃縮倍數×制備培養(yǎng)基的體積（L）； 生長調節(jié)物質母液取用量（mL）=配方中的濃度（mg/L)÷母液濃度（mg/mL) ×制備培養(yǎng)基體積（L） ●移取母液：根據計算出的母液用量，按大量元素、

56、微量元素、鐵鹽、有機成分、植物激素的順序將母液取出，混合。 ●定容：將母液混合液加入到瓊脂完全溶化的培養(yǎng)基中，攪拌混勻，并加水定容到所需體積。 ●調節(jié)pH：用酸度計或精密pH試紙測試培養(yǎng)基溶液的pH(5.5~6.8)，偏堿滴加0.1mol/L的HCl調整，偏酸滴加0.1mol/L的NaOH調整，直到達到配方要求值。 ●分裝：用乳膠管把配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中，100～150mL的培養(yǎng)瓶每瓶裝入30～35mL左右的培養(yǎng)基，分裝時數量要均勻、合適，培養(yǎng)基不沾附瓶口和瓶壁。 ●封口：用合適的封口材料和線繩包扎。 ●標識與記錄：封裝好的培養(yǎng)基做好標記放到高壓滅菌鍋中準備滅菌。 3.

57、培養(yǎng)基的高壓滅菌 ●加水：滅菌鍋加水至淹沒電熱絲（或高低水位線之間）。 ●裝鍋：將培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋。 ●密封：封閉高壓滅菌鍋各出氣口。 ●加壓：接通電源加壓至0.05MPa。 ●排氣：斷開電源，打開排氣閥，排冷氣至壓力為0MPa。 ●穩(wěn)壓：接通電源，繼續(xù)加壓至0.1MPa開始計時，保壓在0.1~0.15Mpa維持20～30min，此時溫度在121~125℃。 ●降壓：穩(wěn)壓時間到，關閉電源自然冷卻至壓力為0MPa。 ●出鍋：開鍋后取出培養(yǎng)基冷卻，貯存于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經24h無雜菌生長，可保存?zhèn)溆谩? 4.培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌時注意的問題 （1）培養(yǎng)基熬制時

58、邊煮邊攪拌，防止糊底。用旺火煮開，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。 （2）配制培養(yǎng)基一定按母液順序依次加入。 （3）熬制培養(yǎng)基過程中，先放入難溶解的瓊脂及有機附加物（馬鈴薯、香蕉等），最后加入藥劑混合液，因混合液中的有機物遇熱時間長易分解失效。 （4）多數植物適宜的pH在5.6～6.5，而培養(yǎng)基經高壓滅菌pH一般會降低0.2～0.3個單位，故調節(jié)pH時應比選定pH提高0.2～0.3個單位。 （5）分裝培養(yǎng)基時，注意不能將培養(yǎng)基溶液噴灑到瓶壁口處，容易落菌污染。 （6）滅菌過程中須完全排除鍋內冷水汽，使鍋內全部是熱水蒸汽，滅菌才能徹底。 （7）培養(yǎng)基滅菌嚴格按要求時間進行，如超過時間

59、，培養(yǎng)基成分發(fā)生變化易失效。 （8）培養(yǎng)基滅菌后，立即取出擺平冷卻。取出過晚凝固差，影響接種轉苗質量。 四、無菌操作（接種）技術 接種是指把無菌的植物材料切割，經無菌操作手序，放到培養(yǎng)基上的全部操作過程。它是組織培養(yǎng)過程中易于污染的一個環(huán)節(jié)，接種操作必須在無菌條件下進行。 ●在接種前30min打開無菌操作間和超凈工作臺的紫外燈進行環(huán)境滅菌。 ●照射20min后關閉紫外燈，打開風機使超凈工作臺處于工作狀態(tài)。 ●接種人員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等。 ●接種人員上工作臺后，用70%~75%酒精擦拭雙手，然后擦拭工作臺面。 ●用70%~75%酒精擦拭接種工具并反復

60、灼燒。 ●進行外植體表面滅菌與接種：將外植體3～5個為一組放入70%~75%的酒精溶液浸潤10～60S→取出后再放入2%的次氯酸鈉溶液浸泡10～15min→用無菌水反復沖洗3～5次（1min/次）→放入無菌吸水紙上吸干水分，進行適當切割→打開已準備好的培養(yǎng)基瓶蓋或封口膜，在酒精燈無菌圈內接入外植體→封口。如此反復操作，直到全部外植體接種完成。注意工具用后及時滅菌，避免交叉污染。 ●接種完畢，清理干凈工作臺。標識接種材料并放入培養(yǎng)間培養(yǎng)。 III.作業(yè) 1.欲配制500毫升MS培養(yǎng)基大量元素母液，需硝酸鉀多少克？ 2.如何制備MS培養(yǎng)基？ 3.如何進行無菌操作？ 第四節(jié) 植物

61、組織培養(yǎng)快速繁殖技術 一、授課章節(jié) 第四節(jié) 植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術。 二、學時安排 2學時。 三、教學目標 1．掌握植物組培快繁的流程。 2．掌握植物組培快繁的程序。 四、教學重點、難點分析 重點： 植物組培快繁的程序。 難點： 初代培養(yǎng)中誘導外植體生長與分化途徑。 五、教具 電化教學設備, 各培養(yǎng)階段的試管苗。 六、教學方法 講授法，演示法。 七、教學過程 Ⅰ.導入 本次課主要介紹的是植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術。 II.新課 一、植物組培快繁的流程 母體材料 → 外植體的選擇 → 外植體的處理 → 外植體的表面消毒 → 外植體的接種 → 初代

62、培養(yǎng) → 繼代培養(yǎng)（多次循環(huán)）→ 壯苗與生根培養(yǎng) → 試管苗馴化與移栽 二、植物組培快繁的程序 （一）外植體的選擇 1.外植體選擇的原則 ●選擇優(yōu)良的種質 外植體一定要選擇具有該品種典型特征、遺傳性穩(wěn)定、生長健壯、無病蟲害的優(yōu)良植株。 ●選擇生理狀態(tài)良好的材料 盡量選擇幼嫩的、生理狀態(tài)良好的材料。 ●選擇生長旺盛、再生能力強的材料 在生長季節(jié)選擇年幼的材料，這樣的材料生長旺盛、再生力強，接種成功率高。 ●選擇來源豐富的材料 為了建立一個高效而穩(wěn)定的組培快繁體系，需反復試驗，所以一定要選用來源豐富的材料。 ●選擇合適的外植體大小 適宜的外植體大?。呵o尖分生組織0.2～0

63、.5mm，莖段長帶1～2個節(jié)，葉片0.5cm×0.5cm。 2.外植體的選擇 就無菌短枝扦插、叢生芽培養(yǎng)來說，木本植物、能形成莖段的草本植物以采取莖尖和莖段比較適宜；有些草本植物植株短小或沒有顯著的莖，可用葉片、葉柄、花萼、花瓣作外植體。 （二）外植體的處理 將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，洗時可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗滌結束后，進入無菌操作室進行消毒接種。 （三）外植體的表面滅菌 按照無菌操作技術中介紹的方法，打開電源使超凈工作臺處于工作狀態(tài)，將接種工具、消毒的玻璃器皿、無菌水、配制好的滅菌劑等放入超凈工作臺，接種員做好準備進入無菌操

64、作室，點燃酒精燈，對接種工具進行灼燒滅菌。 外植體每3～5個為一組放入70％~75％的酒精中浸泡10～60S→取出后放入2％的次氯酸鈉溶液浸泡10～15min→用無菌水反復沖洗3～5次→用已滅菌的剪刀或解剖刀將外植體切割到適當大小，準備接種。 （四）外植體的接種 先打開已準備好的培養(yǎng)基瓶蓋或封口膜，將三角瓶傾斜拿在手中，使瓶口靠近酒精燈火焰，并將瓶口在火焰上方轉動灼燒數秒鐘。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入瓶內，輕輕插在培養(yǎng)基上。將葉片背面接觸培養(yǎng)基，莖尖、莖段要按其生長極性的上下端，正放在培養(yǎng)基上。外植體接種以每瓶放一枚組塊為宜。接完種后，將瓶口在火焰上再灼燒數秒鐘，蓋上瓶蓋或封口膜

65、。然后再接下一瓶，直到全部接種完畢。最后做好記錄，注明處理材料的物種名稱、處理方法、接種日期等。 （五）培養(yǎng) 1.培養(yǎng)條件 （1）溫度 溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，大多數植物組織培養(yǎng)都在23~27℃之間進行，一般采用25土2℃。 （2）光照 主要表現在光強和光照時間方面。組織培養(yǎng)中多采用2000~3000Lx的光強，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 （3）濕度 影響組織培養(yǎng)的濕度包括以下兩個方面：培養(yǎng)容器內的濕度和培養(yǎng)室內環(huán)境的濕度。一般要求培養(yǎng)室內要保持70％～80％的相對濕度。 （4）培養(yǎng)基的pH 不同的植物對培養(yǎng)基最適pH的要求是不同的。大多數植物適宜的p

66、H在5.6～6.5之間，一般培養(yǎng)基皆要求5.8。 （5）滲透壓 培養(yǎng)基中由于有無機鹽類、蔗糖等化合物，因此，會影響滲透壓的變化。通常1~2個大氣壓對植物生長有促進作用，2個大氣壓以上對植物生長有阻礙作用。 （6）氣體 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。接種時應避免把外植體全部埋入培養(yǎng)基中，以免造成缺氧。 2.培養(yǎng)程序 ●初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。 （1）頂芽和腋芽的發(fā)育 頂芽和腋芽在離體培養(yǎng)中都可被誘導而生長發(fā)育。從芽萌發(fā)變?yōu)橛字Γ字^續(xù)生長，形成新的頂芽和側芽。再將新形成的芽切割下來繼續(xù)培養(yǎng)，反復萌生新的枝條，在很短的時間內重復芽→枝→苗的再生過程，就能生產出許多再生小植株。 （2）不定芽的發(fā)育 由外植體產生不定芽，通常首先要經脫分化過程，形成愈傷組織的細胞。然后經再分化形成器官原基。多數情況下它先形成芽，后形成根。即外植體→產生愈傷組織→產生不定芽→產生植株。 （3）體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育