2019-2020年高中生物 5.3《血紅蛋白的提取和分離》教學(xué)設(shè)計(jì) 新人教版選修1.doc
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2019-2020年高中生物 5.3《血紅蛋白的提取和分離》教學(xué)設(shè)計(jì) 新人教版選修1 教材內(nèi)容解讀 要點(diǎn)1 如何分離不同種類的蛋白質(zhì) 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異分離蛋白質(zhì)。如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等。 要點(diǎn)2 凝膠色譜柱 (1)定義 凝膠色譜法也稱作分配色譜法,是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。 (2)凝膠 所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體,這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的,如葡聚糖或瓊脂糖。 (3)分離原理 在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道,當(dāng)相對(duì)分于質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠外部移動(dòng),路程較短,移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 要點(diǎn)3 緩沖溶液 (1)緩沖溶液的緩沖作用 在一定范圍內(nèi),緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響,維持pH基本不變。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 (2)緩沖溶液的意義 生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的,為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過(guò)程,就必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。 要點(diǎn)4 電泳 (1)定義 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 (2)電泳原理 許多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán),在一定的pH下,這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分于帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 (3)電泳過(guò)程中影響粒子運(yùn)動(dòng)快慢的因素 ①粒子帶電荷的多少。粒子帶電荷越多在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)越快。 ②粒子的質(zhì)量。粒子質(zhì)量越小在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)越快。 ③粒子的形狀。呈球形或近球形的粒子比鏈狀粒子運(yùn)動(dòng)快。 (4)荷質(zhì)比 粒子在電泳時(shí)運(yùn)動(dòng)的快慢主要取決于電荷與質(zhì)量比,簡(jiǎn)稱荷質(zhì)比。荷質(zhì)比值越大的粒 子電泳時(shí)運(yùn)動(dòng)越快。 要點(diǎn)5 實(shí)驗(yàn)操作 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步:樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 血液由血漿和各種血細(xì)胞組成,其中紅細(xì)胞最多。在紅細(xì)胞的組成中,約90%是血紅蛋白。血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成,包括兩個(gè)-肽鏈和兩個(gè)-肽鏈 (1)樣品處理 ①紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的:去除雜蛋白,以利于后續(xù)步驟的分離純化。 采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞,分離時(shí)采用低速短時(shí)間離心,如500r/min離心2min,然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿,將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入五倍體積的生理鹽水,緩慢攪拌10min,低速短時(shí)間離心,如此重復(fù)洗滌三次,直至上清液中沒有黃色,表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 洗滌次數(shù)、離心速度與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過(guò)少,無(wú)法除去血漿蛋白;離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀,達(dá)不到分離的效果。 ②血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細(xì)胞倒人燒杯中,加蒸餾水到原血液的體積,再加40%體積的甲苯,置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0min。 蒸餾水和甲苯作用:使紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 ③分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中,以xxr/min的速度離心10min后,可以明顯看到試管中的液體分為4層。第1層為無(wú)色透明的甲苯層,第2層為白色薄層固體,是脂溶性物質(zhì)的沉淀層,第3層是紅色透明液體,這是血紅蛋白的水溶液,第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。 將試管中的液體用濾紙過(guò)濾,除去脂溶性沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后,分出下層的紅色透明液體。 ④透析 取lmL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中,將透析袋故人盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0),透析12h。 (2)凝膠色譜操作 ①凝膠色譜柱的制作 ②凝膠色譜柱的裝填將色譜柱垂直固定在支架上。計(jì)算所用凝膠量,并稱量。凝膠用 蒸餾水充分溶脹后,配成凝膠懸浮液,在與色譜柱下端連接的尼龍臂打開的情況下,一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi),裝填時(shí)可輕輕敲動(dòng)色譜柱,使凝膠裝填均勻。色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在,一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡,必須重裝。裝填完后,立即連接緩沖液洗脫瓶,在約50cm高的操作壓下,用300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12h,使凝膠裝填緊密。 ③樣品的加入和洗脫 打開色譜柱下端的流出口。使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊,關(guān)閉出口。用吸管小心地將lmL透析后的樣品加到色譜柱的頂端,加樣時(shí)使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng),注意不要破壞凝膠面。加樣后,打開下端出口,使樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后,關(guān)閉下端出口。小心加入物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液(pH為7.0)到適當(dāng)高度,連接緩沖液洗脫瓶,打開下端出口,進(jìn)行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí),用試管收集流出液,每5mL收集一管,連續(xù)收集。 ④注意事項(xiàng) 在凝膠色譜操作過(guò)程中,不能發(fā)生洗脫液流干,露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生這種情況,凝膠色譜柱需要重新裝填。 如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng),說(shuō)明色譜柱制作成功。 要點(diǎn)6 疑難解答 從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻? 凝膠色譜的分離時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分于只能從顆粒之間向下移動(dòng),通過(guò)的路程較短,移動(dòng)速度較快,相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道,通過(guò)的路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢.因此,樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出,相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出,相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出,從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻,就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙,使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò),攪亂洗脫液的流動(dòng)次序,影響分離的效果。- 1.請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來(lái)的問(wèn)題本站不予受理。
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