2019-2020年高考生物二輪復(fù)習(xí) 1.2.1《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》教案 中圖版選修3.doc

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2019-2020年高考生物二輪復(fù)習(xí) 1.2.1《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》教案 中圖版選修3 【教學(xué)目標(biāo)】 1.能夠簡(jiǎn)述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程、條件及應(yīng)用。 2.運(yùn)用材料，使學(xué)生進(jìn)一步了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的研究熱點(diǎn)、發(fā)展趨勢(shì)和應(yīng)用前景，以開(kāi)拓視野，增強(qiáng)科技意識(shí)。 【教學(xué)方法】 運(yùn)用講授、自學(xué)以及討論相結(jié)合的方法 【教學(xué)重點(diǎn)】 細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程、條件及應(yīng)用 【教學(xué)難點(diǎn)】 細(xì)胞培養(yǎng)中的相關(guān)名詞、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用前景 【教學(xué)過(guò)程】 1.創(chuàng)設(shè)情景，導(dǎo)入新課 應(yīng)用目前人類(lèi)面臨的一些困惑或難題，如皮膚燒傷的植皮等問(wèn)題，引出進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的目的，解決兩個(gè)問(wèn)題：（1）為什么要進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)？（2）什么是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)？ 2.利用材料，引導(dǎo)自學(xué)與討論 （1）運(yùn)用錄像資料，引導(dǎo)學(xué)生自學(xué)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程，并通過(guò)相互討論，嘗試解決動(dòng)物細(xì)胞中的有關(guān)名詞，如接觸抑制、貼壁生長(zhǎng)、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等； （2）聯(lián)系已有的知識(shí)，引導(dǎo)學(xué)生嘗試解決第三個(gè)問(wèn)題：如何進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)？包括動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程、條件等。 3.歸納總結(jié)，聯(lián)系實(shí)際，聯(lián)系實(shí)際，拓展延伸 通過(guò)對(duì)上述三個(gè)問(wèn)題的解決，學(xué)生初步了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在此基礎(chǔ)上，以實(shí)例為抓手，聯(lián)系實(shí)際，進(jìn)一步了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的研究熱點(diǎn)、發(fā)展趨勢(shì)和應(yīng)用前景，以開(kāi)拓視野，增強(qiáng)科技意識(shí)。 實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)是用無(wú)菌操作的方法將動(dòng)物體內(nèi)的組織(或器官)取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)．使其不斷地生長(zhǎng)、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過(guò)程的生命現(xiàn)象。 細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn)，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分化等的影響；二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞骨架等)、細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育等過(guò)程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的—種簡(jiǎn)便易行的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)我們也不可忽略的另一個(gè)因素，那就是它脫離樂(lè)生物機(jī)體后的—些變化。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等 為此有必要使學(xué)生在細(xì)胞培養(yǎng)方面得到一些初步的感性知識(shí)，了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作過(guò)程，觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特征，對(duì)原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞有一個(gè)基本概念。 本實(shí)驗(yàn)分兩次進(jìn)行．即清洗與消毒和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察。 Ⅰ清洗與滅菌 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過(guò)除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無(wú)菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無(wú)油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，哪怕殘留0．1個(gè)，也可能影響細(xì)胞生長(zhǎng)。滅菌手段的選擇十分重要，對(duì)不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對(duì)，即使達(dá)到了無(wú)菌卻使被滅菌藥品喪失了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。 三、實(shí)驗(yàn)材料、用品 材料：無(wú)臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0．22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0．22 μm，過(guò)濾器(直徑25)。 藥品：70％或75％酒精，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液(來(lái)蘇兒水)，0．5％過(guò)氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))，DEPC水[體積分?jǐn)?shù)0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。 儀器：超凈臺(tái)，干燥箱，高壓鍋，過(guò)濾器，過(guò)濾泵。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 (一)清洗 1．新玻璃器皿的清洗先用自來(lái)水刷洗，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。 2．使用過(guò)的玻璃器皿的清洗 (1)使用過(guò)的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。 (2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來(lái)水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。 (3)浸酸性洗液過(guò)夜。 (4)從酸性洗液撈出后自來(lái)水沖洗10．15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。 (5)包裝(牛皮紙或一般紙)。 (6)高壓(15磅20 min)或干熱(170℃2 h)滅菌。 (7)貯存?zhèn)溆谩? 3．膠塞的處理 (1)新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸l(wèi)O-20 min。 (2)自來(lái)水清洗10次。 (3)再用1％稀鹽酸浸泡30 min。 (4)自來(lái)水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌(見(jiàn)(二)消毒與滅菌)。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過(guò)蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。 （二）消毒 1．物理消毒法 (1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺(tái)面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。 (2)干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160℃，保溫90－120 min。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需180℃，保溫5－8 h。 (3)濕熱滅菌 此方法也稱(chēng)為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類(lèi)、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無(wú)機(jī)溶液(如Hanks液、PBS、20SSC等)。手動(dòng)高壓滅菌鍋操作如下： ①首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。 ②加熱高壓鍋。將放氣閥打開(kāi)，放氣5—10 min，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。 ③待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。 ④停止加熱，待壓力自然下降至0再打開(kāi)放氣閥排汽，開(kāi)蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。 電熱自動(dòng)滅菌鍋使用說(shuō)明(型號(hào)：SANYO Autoclave MLS-3020)： ①放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導(dǎo)氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位。 ②打開(kāi)高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1／3－2／3處。 ③打開(kāi)電源。 ④設(shè)定高壓溫度及時(shí)間，高壓鍋的溫度范圍為105－121℃，高壓滅菌一般采用121℃20—30 min。 ⑤把待高壓的物品置于高壓鍋內(nèi)，順時(shí)針?lè)较驅(qū)xhaust鈕旋至close位置。 ⑥關(guān)閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點(diǎn)剛出現(xiàn)為止。 ⑦按start鈕，開(kāi)始高壓，在溫度達(dá)80℃時(shí)顯示器開(kāi)始顯示溫度，當(dāng)溫度達(dá)到所需的設(shè)定溫度時(shí)，在顯示屏的左下角有一長(zhǎng)形的指示燈閃亮，直到高壓時(shí)間結(jié)束后指示燈滅，此時(shí)蜂鳴器報(bào)警一聲。當(dāng)壓力降至0 MPa時(shí)，蜂鳴器再報(bào)警一聲。溫度降至80℃時(shí)，蜂鳴器報(bào)警10次。顯示屏溫度指示消失，此時(shí)才可打開(kāi)鍋蓋。 ⑧關(guān)電源，開(kāi)高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。 (4)濾過(guò)除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號(hào)按直徑大小劃分。如過(guò)濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號(hào)的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以過(guò)濾泵使用。過(guò)濾量較小的液體常用注射器推動(dòng)的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌最為保險(xiǎn)，但對(duì)于較粘稠難濾過(guò)的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。 ①在過(guò)濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0．22μm。 ②用布包好，濕熱滅菌后使用。 2．化學(xué)消毒法 常用的消毒液有如下幾種： (1)70％(或75％)酒精：超凈臺(tái)里常備70％酒精棉球(衛(wèi)生級(jí)酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺(tái)面的消毒。 (2)0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺(tái)面的清潔。超凈臺(tái)旁應(yīng)常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。 (3)來(lái)蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無(wú)菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請(qǐng)按瓶上說(shuō)明。 (4)0．5％過(guò)氧乙酸：是強(qiáng)效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進(jìn)行。 (5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門(mén)窗緊閉1—3 d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺?。 (6)37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門(mén)窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達(dá)到消毒空氣的目的。 3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。 五、注意事項(xiàng) 1．清洗玻璃制品時(shí)，浸酸之后一定要用自來(lái)水沖洗10—15次。因?yàn)闅埓娴南匆簩?duì)細(xì)胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時(shí)要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬(wàn)不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個(gè)清洗。如沒(méi)有洗凈會(huì)影響下一次使用的效果。 2．干熱滅菌時(shí)，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過(guò)100℃時(shí)，不能再打開(kāi)烤箱門(mén)。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開(kāi)烤箱門(mén)。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。． 3．高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。 4．牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機(jī)溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。 5．濾過(guò)除菌時(shí)，濾器在使用前先裝好濾膜(有時(shí)可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過(guò)酶類(lèi)制劑時(shí)應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進(jìn)行。過(guò)濾時(shí)壓力不宜過(guò)大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時(shí)微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過(guò)濾膜。裝濾膜時(shí)位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時(shí)，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進(jìn)入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。 6．使用化學(xué)消毒法時(shí)，配制75％酒精應(yīng)用衛(wèi)生級(jí)，不要用化學(xué)純、分析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來(lái)蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對(duì)皮膚有刺激性?？諝庀緯r(shí)，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因?yàn)榧兹┗蛉樗峒訜岷蠓懦龅恼魵鈱?duì)人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。 六、思考題 1．哪些物品適合于高壓滅菌，并說(shuō)明理由。 2．紫外線消毒的適用范圍和目的是什么? II、傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過(guò)程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況 二、實(shí)驗(yàn)原理 傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。 這種培養(yǎng)，第一步也是制備細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層時(shí)，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽)的混合物，做為消化液。 細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，必須滿(mǎn)足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長(zhǎng)因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無(wú)菌條件。 三、實(shí)驗(yàn)用品 1、器材 解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9．9xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。 此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。 2、試劑 L磷酸鹽緩沖液(PBs) 無(wú)鈣、鎂溶液 細(xì)胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTA EMEM液 3%谷氨酰胺 o．5％臺(tái)盤(pán)藍(lán)染液等 3、材料 喉癌細(xì)胞 四、實(shí)驗(yàn)方法 在做傳代細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞是否已長(zhǎng)成致密單層，如已長(zhǎng)成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。 1.營(yíng)養(yǎng)液配制: EMEM液 90% 犢牛血清 10% 雙抗(1萬(wàn)單位／m1) 加至約100單位／m1 3％谷氛酞胺 1m1 7．4％NaHCO3 調(diào)pH至6．8—7．0 2．換液: 在酒精燈旁打開(kāi)瓶塞，倒去瓶中的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液。 3.消化與分裝 在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動(dòng)，將溶液倒出。重復(fù)上述動(dòng)作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o．5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿(mǎn)細(xì)胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)縫隙(針孔大小的空隙)，如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進(jìn)行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時(shí)，可倒去消化液，加入新配制的營(yíng)養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營(yíng)養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層至瓶壁細(xì)胞全部脫落下來(lái)為止。此時(shí)，可繼續(xù)輕輕地吹打細(xì)胞懸液，以使細(xì)胞散開(kāi)。隨之進(jìn)行分裝。 4．培養(yǎng) 分裝好的細(xì)胞瓶上，做好標(biāo)志，注明細(xì)胞代號(hào)、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細(xì)胞均勻分布，以免堆積成團(tuán)。然后置于37℃培養(yǎng)。 5.觀察 (1)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的幾個(gè)問(wèn)題； 細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察，觀察的重點(diǎn)如下： A.首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度 B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細(xì)胞是否生長(zhǎng)。 C.如細(xì)胞已生長(zhǎng)，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長(zhǎng)階段。觀察時(shí)可參照(2)的描述進(jìn)行。 D．觀察完畢，可用臺(tái)盤(pán)藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。以確定死、活細(xì)胞的比例。 (2)細(xì)胞的生長(zhǎng)階段及其形態(tài)特征 傳代培養(yǎng)的細(xì)胞需逐日進(jìn)行觀察，注意細(xì)胞有無(wú)污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。—般中層培養(yǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)開(kāi)始，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)、繁殖、衰老及死亡的全過(guò)程。它是一個(gè)連續(xù)的生長(zhǎng)過(guò)程，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個(gè)時(shí)期，但各期間無(wú)明顯絕對(duì)界限。現(xiàn)分別描述如下： A．游離期：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，由于細(xì)胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細(xì)胞膜的彈性。所以，此時(shí)細(xì)胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)h。 B．吸附期(貼壁)：由于細(xì)胞的附壁持性，細(xì)胞懸液靜置培養(yǎng)一段時(shí)間(約7—8h)后，便附著在瓶壁上(此期不同細(xì)胞所需時(shí)間不同)。在顯微鏡下觀察時(shí)可見(jiàn)瓶壁上有各種形態(tài)的細(xì)胞，如圓形、扁形、短菱形。細(xì)胞的特點(diǎn)，大多立體感強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，透明。 C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細(xì)胞進(jìn)入繁殖期，加速了細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。此期包括由幾個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞島(即由少數(shù)細(xì)胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細(xì)胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到細(xì)胞鋪滿(mǎn)整個(gè)瓶壁(即所謂形成細(xì)胞單層)的過(guò)程。此期細(xì)胞形態(tài)為多角形(呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞的特征)。細(xì)胞特點(diǎn)：透明，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚，并可隱約見(jiàn)到細(xì)胞核。根據(jù)細(xì)胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長(zhǎng)狀況分為四級(jí)。以“十”的多少表示如下： 十：細(xì)胞占瓶壁有效面積(也就是細(xì)胞能生長(zhǎng)的瓶壁面積)的25％以?xún)?nèi)有新生細(xì)胞。一般要觀察3—5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，然后加以綜合分析判斷。 十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的25—75％以?xún)?nèi)具新生細(xì)胞。 十十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細(xì)胞。細(xì)胞排列致密。但仍有空隙。 十十十十：細(xì)胞占瓶壁95％以上，細(xì)胞已長(zhǎng)滿(mǎn)或接近長(zhǎng)滿(mǎn)單層，細(xì)胞致密，透明度好。 從十十一十十十十為細(xì)胞的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期(或稱(chēng)為指數(shù)增長(zhǎng)期)。 D．維持期：當(dāng)細(xì)胞形成良好單層后，細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂都減緩，并逐漸停止生長(zhǎng)，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為細(xì)胞生長(zhǎng)的接觸抑制。此時(shí)細(xì)胞界限逐漸模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時(shí)營(yíng)養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。 E．衰退期：由于溶液中營(yíng)養(yǎng)的減少和日齡的增長(zhǎng)，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時(shí)細(xì)胞間可出現(xiàn)空隙，細(xì)胞中顆粒進(jìn)一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細(xì)胞經(jīng)固定染色處理后，可見(jiàn)細(xì)胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，細(xì)胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來(lái)。 五、思 考 題 1．簡(jiǎn)述細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作程序及注意鄉(xiāng)項(xiàng)。 3．細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么? 3．簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長(zhǎng)階段。