Y染色體AZF基因缺失檢測與男性不育

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1、Y染色體AZF基因缺失檢測與男性不育 　　Y染色體 少精液癥 基因缺失 不育 男性 　　目前世界上已婚育齡夫婦中約10%～15％的夫婦不育，其中男性不育因素約占50％，引起男性不育常見原因有營養(yǎng)不良、內(nèi)分泌疾病、環(huán)境毒物、生殖道炎癥、精索靜脈曲張、隱睪、核型異常(克氏征)及免疫異常等因素，其中由于遺傳缺陷包括基因突變和染色體異常所引起的精子發(fā)生障礙約占30%以上［1］。除輸精管梗阻、腮腺炎病毒感染等明確原因外，還有相當(dāng)一部分精子發(fā)生障礙的男性不育找不出病因，因此有關(guān)原發(fā)性無精子癥及嚴(yán)重少精子癥的遺傳因素日益受到重視。隨著對精子發(fā)生的細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的深入研

2、究以及分子生物學(xué)檢驗技術(shù)的發(fā)展，人們逐步認識到引起無精癥的基因——無精因子(azoospermia factor，AZF)位于Y染色體長臂(Yq)，這一區(qū)域的異常和大多數(shù)原發(fā)性無精子癥密切相關(guān)?，F(xiàn)將Y染色體微缺失（AZF基因缺失）與男性不育的研究狀況作如下綜述。 　　1Y染色體上AZF區(qū)域及基因分布 　　人類的Y染色體由長臂（Yq）和短臂（Yp）構(gòu)成，其包含了約2％的基因。Y染色體對性發(fā)育和精子發(fā)生是必需的，Y染色體上特殊基因的缺失、點突變和微重排等異常均可影響男性生精功能。由于Y染色體的基因都是單倍體，Y染色體的微缺失即使是一個基因也有可能產(chǎn)生明顯效應(yīng)［2］，Dohle等［3］對

3、原發(fā)性無精子癥和少精子癥患者進行分析，均發(fā)現(xiàn)存在Y染色體微缺失（Y chromosome microdeletions），提示Y染色體微缺失可能是男性原發(fā)不育的一個重要遺傳因素，某些基因片段的丟失可能造成生精障礙，1976年Tiepolo［4］發(fā)現(xiàn)男性不育患者Y染色體長臂1區(qū)1帶（Yq11）存在著斷裂現(xiàn)象，因此提出Y染色體長臂存在與精子發(fā)生相關(guān)基因，并命名為AZF，AZF為多基因家族，Vogt等［4］發(fā)現(xiàn)，Y染色體微缺失存在于3個不同的區(qū)域，即Yq11的近段、中段和遠段，因此認為在這3個區(qū)域內(nèi)均存在AZF基因，分別命名為AZFa，AZFb和AZFc。有研究人員［5］發(fā)現(xiàn)在AZFb和AZFc之間

4、還存在AZFd，但該區(qū)是否存在仍有爭議。 　　1.1AZFa區(qū) 　　AZFa位于Yq近側(cè)缺失區(qū)間interval 5內(nèi)，估計長度為1～3Mb。AZFa包含的基因有USP9Y，DBY，TB4Y和UTY，這些基因均與X染色體有同源性并在許多組織中表達，也是男性遺傳性不育相關(guān)的AZFa候選基因［6］，其中USP9Y是AZFa的最佳候選基因。USP9Y是最早發(fā)現(xiàn)的AZFa候選基因，大小為159kb含有46個外顯子，對原發(fā)性無精癥和嚴(yán)重少精癥患者進行USP9Y檢測時發(fā)現(xiàn)USP9Y缺失的病例均表現(xiàn)為原發(fā)性無精子癥，表明USP9Y的微缺失將導(dǎo)致生精障礙及睪丸發(fā)育不良，但其缺失率較低。單純AZFa

5、的缺失較少見，約占Y染色體微缺失的1％～5％，但AZFa缺失的患者最為嚴(yán)重，大多表現(xiàn)為唯支持細胞綜合征（SCOS），同時有睪丸體積的縮小。 　　1.2AZFb區(qū) 　　AZFb位于Y染色體缺失區(qū)間interval 5～6近側(cè)端，大小約1～3Mb。已識別的AZFb區(qū)基因有：RBMY(RNA binding motif Y chromosome)，CDY(chromodomin Y)，XKRY，SMY和eif-1。最佳候選基因RBMY是第一個被確定與精子發(fā)生相關(guān)的基因。RBMY家族，是1993年英國學(xué)者Ma等［7］首次分離和克隆定位于Y染色體長臂的DNA片段，該片段的氨基酸序列與RNA結(jié)

6、合家族中的識別基序(RNA recognition motif，RRM)具有明顯的同源性。RRM在睪丸內(nèi)特異性表達，研究表明［8］所有AZFb缺失的男性均未發(fā)現(xiàn)RBMY基因的完全缺失，提示RBMY的活性拷貝是不能被去除的。另外CDY基因也是與精子發(fā)生密切相關(guān)的基因家族，它包括3個成員，分別為CDY1major、CDY1minor和CDY2。CDY的功能目前還不完全清楚，可能與精子的發(fā)生有關(guān)，尤其CDY1作用較明顯。AZFb基因全部缺失的患者表現(xiàn)為生精阻滯，主要停留在精母細胞或精子細胞階段，部分缺失時，臨床表現(xiàn)多樣化，包括SCOS，無精子癥或少精子癥；如果同時伴有AZFa或AZFc的缺失，則表現(xiàn)

7、為SCOS或生精阻滯。 　　1.3AZFc區(qū) 　　AZFc位于異染色質(zhì)鄰近異染色質(zhì)區(qū)，長度約為1.5 Mb，近側(cè)區(qū)又劃分出AZFd區(qū)。目前已識別的AZFc基因有DAZ（deleted in azoospermia，DAZ），PRY，BPY2，TTY2，CDY和RBMY。最佳候選基因是DAZ基因，DAZ為多拷貝基因，稱為DAZ家族［9］。DAZ編碼的蛋白質(zhì)與RBMY基因家族編碼的蛋白質(zhì)有相似的結(jié)構(gòu)并在生精細胞中特異表達，表明其可能與RNA的代謝相關(guān)。DAZ只在睪丸特異性表達，表明DAZ基因只參與男性特有的生理過程，從另一方面也支持了DAZ是影響精子生成的重要基因的假設(shè)。AZFc基因缺

8、失是精子生成障礙的最常見原因［3］，約占Y染色體微缺失的60％，所以AZFc區(qū)缺失常作為原發(fā)性無精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者的主要篩查基因。AZFc缺失的患者臨床表現(xiàn)多種多樣，可表現(xiàn)為無精癥，也可表現(xiàn)為精子計數(shù)正常但伴有精子形態(tài)異常［10］。AZFc微缺失的患者為輕度少精或精子數(shù)目。 　　1.4AZFd區(qū) 　　AZFd是新發(fā)現(xiàn)的位于AZFb和AZFc之間的第四個AZF區(qū)。AZFd缺失多見于輕度少精癥，其基因型和相關(guān)表型有待進一步研究。 　　2Y染色體AZF缺失發(fā)生機制　　Y染色體AZF缺失的機制說法不一，主要認為：Y染色體在精子發(fā)生過程中，由于胚細胞快速分裂，與卵子發(fā)生過程相比具

9、有更多的突變機會。Y染色體不能像常染色體一樣進行DNA修復(fù)。Y染色體是單倍體，故一個基因缺失就能發(fā)生效應(yīng)。另外X和Y染色體之間或Y染色體本身不平衡的姐妹染色體單體交換時，同源或相似的重復(fù)序列之間異常重組。Siffroi等［11］證明Y染色體長臂大的缺失與Y染色體的不穩(wěn)定性有關(guān)。但也有學(xué)者認為［12］，Y染色體AZF基因缺失形成是一種隨機事件，不依賴Y染色體出現(xiàn)的背景，可能是其它遺傳或環(huán)境因素所致。 　　3Y染色體AZF基因缺失檢測狀況　　　　男性不育患者中Y染色體微缺失發(fā)生率約為10%［13］，文獻報道［14］為1%～55.5%，之所以缺失頻率范圍如此大，可能有以下幾點原因：①研究對象入

10、選的標(biāo)準(zhǔn)不同，可能是無精子癥、少精子癥和不育癥，但精子計數(shù)正常以及這幾種人群的不同組合。無精和少精只是一個癥狀，本身就代表不同病因的不均一性。②選取STS標(biāo)記位置的密度及位置不同。③病史不清，實驗室檢查不全面。④不同地域、種族間可能存在差異。Vogt［4］總結(jié)1992～1996年發(fā)表的19篇文獻，AZF缺失平均發(fā)生率為10.2%，Oliva等［15］在186例不育者中發(fā)現(xiàn)Y染色體微缺失10例(5.38%)、無精子者占16%(8/50)，少精子占1.47%(2/136)；譚超等［16］對成都地區(qū)42例原發(fā)性男性不育癥患者AZF基因研究表明微缺失的總體發(fā)生率為19.1%，而AZFc區(qū)缺失要比AZF

11、a及AZFb區(qū)更常見，分別占缺失的47.6%、11.9%及23.8%。劉雅峰等［17］對廣州地區(qū)175例原發(fā)性生精障礙患者AZF研究結(jié)果總?cè)笔蕿?0.9%，其中AZFc區(qū)占缺失的比率高達78.9%。Foresta等［18］在對男性不育癥患者Y染色體分析時發(fā)現(xiàn)無精子癥患者的AZFc區(qū)基因缺失率最高，缺失的區(qū)域以AZFc的DAZ家族最多見，提示AZFc區(qū)的缺失是整個AZF缺失區(qū)域的熱區(qū)，可將此基因片段缺失作為無精子癥和嚴(yán)重少精子癥病因篩選的主要候選基因。 　　4Y染色體AZF基因檢測方法及臨床意義　　目前，針對AZF基因缺失的檢測主要采用Y染色體特異性序列標(biāo)簽位點(sequence tag

12、ged sites，STS)引物行PCR擴增，檢測光鏡下分辨不出來的Y染色體微缺失。作為基因物理圖譜的STS是一段已知核苷酸序列的DNA片段，可真實反映染色體上不同的基因序列，診斷Y染色體微缺失的基因診斷策略是設(shè)計引物對AZFa、AZFb、AZFc 3個區(qū)域進行缺失篩查，每個區(qū)域選擇2～3個STS位點進行PCR擴增，既在同一PCR反應(yīng)體系中加入數(shù)對AZF區(qū)域STS引物，如果這些引物的退火溫度相近并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，就可以同時擴增一份DNA樣品中不同基因位點的不同序列，AZF基因的某一片段則相應(yīng)的電泳圖譜上這一區(qū)帶就會消失，一旦發(fā)現(xiàn)缺失，單獨擴增缺失位點以確認［19］。不同的研究者進行Y染色

13、體AZF缺失分析時選用的STS數(shù)目有很大的差異，從5～118個不等，檢測時應(yīng)用多少個Y染色體特異性STS位點及其代表性，國際上尚存爭議，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但將AZF分為AZFa、AZFb、AZFc 3個區(qū)域已被大部分的研究者所接受。歐洲標(biāo)準(zhǔn)化AZF缺失篩查推薦使用3個對照［20］：1份正常男性ＤＮＡ為陽性對照，1份正常女性ＤＮＡ為陰性對照，無菌蒸餾水為空白對照。女性樣品用以監(jiān)控實驗結(jié)果的特異性和污染情況，水空白對照是用來檢測試劑是否被污染。設(shè)計的引物包括:sY14(SRY)、ZFX/ZFY、sY84、sY 86、sY 127、sY 134、sY 254、sY 255。采用上述位點可以檢測到目前已知的95%以上的Yq微缺失，因此這套設(shè)計完全滿足常規(guī)檢測。AZF缺失基因蕊片檢測技術(shù)是未來發(fā)展方向。