體內(nèi)藥物分析常用生物樣品處理方法和方法學驗證

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1、體內(nèi)藥物分析的樣品處理和方法學驗證 1 1.為 什 么 要 對 生 物 樣 品 進 行 處 理 ？2.有 哪 些 生 物 樣 品 ？3.有 哪 些 樣 品 處 理 方 法 ？ 各 自 的 特 點 。4.如 何 對 分 析 方 法 進 行 驗 證 ？5.有 哪 些 參 考 標 準 ？ 2 生物樣品進行前處理的目的在于：1 藥 物 進 入 體 內(nèi) 后 ， 經(jīng) 吸 收 、 分 布 、 代 謝 ， 然 后 排 出體 外 。 在 體 液 、 組 織 和 排 泄 物 中 除 了 游 離 型 （ 原 型 ）藥 物 之 外 ， 還 有 藥 物 的 代 謝 物 、 藥 物 與 蛋 白 質(zhì) 形 成 的結(jié) 合 物

2、、 以 及 藥 物 或 其 代 謝 物 與 內(nèi) 源 性 物 質(zhì) ， 如 葡 萄糖 醛 酸 、 硫 酸 形 成 的 葡 萄 糖 醛 酸 甙 、 硫 酸 酯 綴 合 物 等多 種 形 式 存 在 ， 需 要 分 離 后 測 定 藥 物 及 代 謝 物 。 3 一、處理的目的 2 生 物 樣 品 的 介 質(zhì) 組 成 比 較 復(fù) 雜 。 如 在 血 清 中 既 含 有 高分 子 的 蛋 白 質(zhì) 和 低 分 子 的 糖 、 脂 肪 、 尿 素 等 有 機 化 合 物 ，也 含 有 Na 、 K 、 Cl-等 無 機 化 合 物 。 這 些 成 分 會 嚴 重 影 響測 定 的 準 確 性 和 靈 敏 度

3、 ， 同 時 會 污 染 儀 器 。 因 此 ， 為 了 保護 儀 器 ， 提 高 測 定 的 靈 敏 度 ， 保 證 檢 測 結(jié) 果 的 準 確 性 和 可靠 性 ， 必 須 對 樣 品 進 行 前 處 理 。 4 560%以 上 精 力 和 花 費 用 在 樣 品 前 處 理 上 生 物 樣 品 包 括 各 種 體 液 和 組 織 ， 但 實 際 上 最 常 用 的是 比 較 容 易 得 到 的 血 液 （ 全 血 、 血 漿 、 血 清 ） 、 尿 液 、 糞便 、 唾 液 。 在 一 些 特 定 的 情 況 下 選 用 乳 汁 、 腦 脊 液 等 。 6 二、生物樣品的種類 全 血 不

4、 易 保 存 ， 且 血 細 胞 中 含 有更 多 的 干 擾 物 質(zhì) ， 影 響 測 定 ， 故很 少 采 用 全 血 測 定 藥 物 濃 度 。 僅適 用 于 血 漿 藥 物 濃 度 太 低 或 者 血漿 藥 物 濃 度 波 動 大 ， 且 難 以 控 制的 藥 物 如 ： 環(huán) 孢 霉 素 A。 7 測 定 通 常 是 指 測 定 血 漿 或血 清 中 的 藥 物 濃 度 ， 而 不 是 指 含 有 血 細胞 的 全 血 中 的 藥 物 濃 度 。 將 采 取 的 血 液 置 含 有 （ 如 ： 肝 素 、EDTA） 的 試 管 中 ， 混 合 后 ， 3000至 4000 r/min離

5、心 ， 分 離 血 細 胞 ， 上 清 液 即 為 血漿 。 8 9血漿中含有的物質(zhì)種類和比例 血 清 是 在 采 血 后 不 加 任 何 抗 凝 劑 ， 于 室 溫 下 靜 置 15-30 min， 待 其 自 然 凝 結(jié) 后 ， 離 心 ， 分 離 出 上 清 液 。 血 清顏 色 較 血 漿 更 淺 ， 成 分 較 血 漿 少 了 大 部 分 的 纖 維 蛋 白 ，更 易 進 行 處 理 ， 且 血 漿 及 血 清 中 的 藥 物 濃 度 測 定 值 通 常是 相 同 的 。 10 一 般 認 為 ， 當 藥 物 在 體 內(nèi) 達 到 穩(wěn) 定 狀 態(tài) 時 ， 血 漿 中 藥物 濃 度 與

6、藥 物 在 作 用 點 的 濃 度 緊 密 相 關(guān) ， 即 血 漿 中 的 藥 物 濃度 反 映 了 藥 物 在 體 內(nèi) （ 靶 器 官 ） 的 狀 況 ， 因 而 血 漿 濃 度 可 作為 作 用 部 位 藥 物 濃 度 的 可 靠 指 標 。 血 漿 和 血 清 可 以 穩(wěn) 定 的 冰 凍 保 存 ， 一 般 儲 存 在 -20 的條 件 ， 長 期 保 存 時 可 以 保 存 在 -80 的 條 件 下 ， 是 生 物 樣 品檢 測 中 最 常 用 的 樣 本 。 11 尿 液 主 要 成 分 是 水 、 尿 素 及 無 機 鹽 類 。 尿 樣 采 集 后 ， 為 了保 存 ， 常 會

7、加 入 防 腐 劑 。體 內(nèi) 藥 物 清 除 主 要 是 通 過 尿 液 排 出 ， 藥 物 可 以 原 型 或 代 謝物 及 其 綴 合 物 等 形 式 排 出 。尿 液 中 藥 物 濃 度 較 高 ， 但 尿 液 濃 度 受 尿 量 的 影 響 ， 通 常 變化 較 大 ， 應(yīng) 測 定 一 定 時 間 內(nèi) 排 入 尿 中 藥 物 的 總 量 。 12 唾 液 中 所 含 成 分 比 較 簡 單 ， 且 容易 獲 得 ， 但 是 只 有 少 數(shù) 藥 物 的 唾液 濃 度 和 血 漿 游 離 藥 物 濃 度 具 有相 關(guān) 性 ， 實 際 使 用 不 多 ， 當 藥 物血 漿 結(jié) 合 率 高 的

8、 時 候 ， 唾 液 中 藥物 的 濃 度 極 低 ， 很 難 檢 測 。 13 采 樣 后 除 立 即 分 析 外 ， 為 防 止 藥 物 發(fā) 生 變 化 ， 應(yīng) ： 短期 保 存 ， 可 4 冷 藏 ； 長 期 保 存 ， 可 -20 冷 凍 ， 不要 反 復(fù) 凍 融 ， 必 要 時 可 以 加 入 和 。 14 主 要 應(yīng) 考 慮 ， 和三 個 方 面 的 問 題 。 151.沉 淀 蛋 白 PPT2.液 液 萃 取 LLE3.固 相 萃 取 SPE 16 有機溶劑沉淀法 加 入 水 溶 性 的 有 機 溶 劑 ， 可 使 蛋 白 質(zhì) 的 分 子 內(nèi) 及 分 子 間的 氫 鍵 發(fā) 生 變

9、 化 而 使 蛋 白 質(zhì) 凝 聚 。 常 用 的 有 機 溶 劑 有 ：、 乙 醇 、 丙 醇 、 丙 酮 、 四 氫 呋 喃 等 。 血 漿 或 血 清 與 有 機 溶 劑 的 體 積 比 為 1:3時 ， 就 可 以 將90%以 上 的 蛋 白 質(zhì) 除 去 ， 采 用 低 溫 高 速 速 離 心 機16000r/min離 心 10min 便 可 將 析 出 的 蛋 白 質(zhì) 完 全 沉 淀 。 實 際 應(yīng) 用 中 ， 多 是 取 50uL的 血 漿 ， 加 入 500uL的 有 機 溶劑 ， 渦 旋 離 心 后 ， 取 上 清 進 樣 ；若 沉 淀 后 ， 信 號 相 應(yīng) 不 好 ， 可 嘗

10、 試 更 換 有 機 溶 劑 或 者在 沉 淀 時 ， 加 入 酸 或 堿 ， 調(diào) 節(jié) pH值 ， 可 能 會 對 結(jié) 果 影響 很 大 ；常 用 的 酸 堿 有 ： 鹽 酸 ， 甲 酸 ， 乙 酸 ， 氨 水 等 。 17 優(yōu) 點 ： 操 作 簡 單 ， 為 方 法 開 發(fā) 中 最 先 考 慮 使 用 的 。缺 點 ： 只 使 用 于 樣 品 中 濃 度 較 高 的 藥 物 測 定 ； 且 處 理后 ， 樣 品 中 仍 然 會 存 在 很 多 干 擾 物 質(zhì) ， 對 結(jié) 果 產(chǎn) 生 干擾 ； 殘 余 的 雜 質(zhì) 會 堵 塞 色 譜 柱 ， 污 染 儀 器 。 18 中 性 鹽 能 將 與 蛋

11、 白 質(zhì) 水 合 的 水 置 換 出 來 ， 從 而 使 蛋白 質(zhì) 脫 水 而 沉 淀 。 常 用 的 中 性 鹽 ： 飽 和 硫 酸 胺 、 硫 酸 鈉 、鎂 鹽 、 磷 酸 鹽 及 枸 櫞 酸 鹽 等 。 的 方 法 與 有 機 溶 劑 提取 法 常 并 用 ， 藥 物 的 回 收 率 較 高 。加入中性鹽 19 2020 加入強酸 當 pH低 于 蛋 白 質(zhì) 的 等 電 點 時 ， 蛋 白 質(zhì) 以 陽 離 子 形式 存 在 ， 加 入 強 酸 ， 可 與 蛋 白 質(zhì) 陽 離 子 形 成 不 溶 性 鹽而 沉 淀 。 常 用 的 強 酸 有 ： 等 。 血 清 與 強酸 的 比 例 為 1

12、:0.6混 合 ， 高 速 離 心 ,就 可 除 去 蛋 白 質(zhì) 。在 酸 性 下 分 解 的 藥 物 不 宜 用 本 法 除 蛋 白 。 當 pH高 于 蛋 白 質(zhì) 的 等 電 點 時 ， 金 屬 陽 離 子 與 蛋 白質(zhì) 分 子 中 帶 陰 電 荷 的 羧 基 形 成 不 溶 性 鹽 而 沉 淀 。 常 用的 沉 淀 劑 有 ： CuS04-Na2W04 , -NaOH等 。 含 藥 物 血清 與 沉 淀 劑 的 比 例 為 1:2混 合 ， 高 速 離 心 、 分 離 后 得 上清 液 。 21 加入鋅鹽或銅鹽沉淀劑 在 測 定 一 些 酸 不 穩(wěn) 定 及 蛋 白 結(jié) 合 牢 的 藥 物

13、 時 ， 常 需 用酶 解 法 。在 測 定 尿 中 的 藥 物 濃 度 時 ， 由 于 尿 中 藥 物 主 要 以 綴 合物 的 形 式 排 除 ， 較 原 型 藥 物 具 有 較 大 的 極 性 ， 不 易 被有 機 溶 劑 提 取 ， 常 用 酶 水 解 的 方 法 。 22 酶解法 超 速 離 心 法平 衡 透 析 法最 主 要 的 應(yīng) 用 在 測 定 血 漿 中 游 離 的 藥 物 濃 度 和 藥 物 的血 漿 蛋 白 結(jié) 合 率 。 23 其他的一些去除蛋白質(zhì)的方法： 藥 物 在 體 內(nèi) 吸 收 ， 需 經(jīng) 跨 膜 轉(zhuǎn) 運 ， 所 以 多 數(shù) 藥 物具 有 一 定 的 脂 溶 性

14、， 而 生 物 樣 品 中 大 多 數(shù) 內(nèi) 源 性 雜 質(zhì)是 強 極 性 的 水 溶 性 物 質(zhì) ， 所 以 可 以 根 據(jù) 藥 物 分 子 與 基質(zhì) 之 間 極 性 的 差 異 ， 使 用 適 當 的 有 機 溶 劑 提 取 藥 物 ，有 機 溶 劑 提 取 可 一 次 除 去 大 部 分 雜 質(zhì) 。 24 有 機 溶 劑 應(yīng) 選 擇 穩(wěn) 定 ， 易 揮 發(fā) ， 低 毒 性 ， 不 與 水 相 混 溶 的溶 劑 。 常 用 的 有 機 溶 劑 有 ：等 。 應(yīng) 用 本 法 時 需 要 考 慮 所 選 、及 等 。 酸 性 藥 物 的 解 離 ： AH + H2O A- + H+ 堿 性 藥

15、物 的 解 離 ： B + H 2O B+ + OH- 藥 物 的 解 離 常 數(shù) pKa為 藥 物 解 離 50%時 溶 液 的 pH值 。 25 藥 物 的 提 取 程 度 主 要 取 決 于 水 相 的 pH值 。 對 于 堿 性 藥物 ， 最 佳 pH值 要 高 于 pKa 1-2個 單 位 ； 對 于 酸 性 藥 物 來說 ， 則 要 低 于 pKa值 1-2個 單 位 ； 這 樣 就 可 使 90%的 藥 物以 非 電 離 的 形 式 存 在 從 而 更 易 溶 于 有 機 溶 劑 中 。 常 用 來 調(diào) 節(jié) pH值 的 物 質(zhì) 有 ： 甲 酸 、 乙 酸 、 鹽 酸 或 氨水 、

16、 氫 氧 化 鈉 等 。 26 具 體 的 提 取 模 式 有 兩 種 ， 直 接 提 取 和 反 提 取 法 。 優(yōu) 點 ： 樣 品 經(jīng) 過 提 取 后 ， 可 除 去 大 部 分 雜 質(zhì) ， 比 較 “ 干凈 ” ； 對 有 機 溶 劑 蒸 發(fā) 后 復(fù) 溶 ， 可 以 對 樣 品 進 行 濃 縮 ；大 多 數(shù) 藥 物 具 有 脂 溶 性 ， 應(yīng) 用 范 圍 廣 。 缺 點 ： 費 時 費 力 ， 操 作 繁 瑣 ； 且 對 血 漿 進 行 提 取 時 ， 血漿 中 的 脂 質(zhì) 會 一 起 被 提 取 出 ， 27 方 法 摸 索 中 ， 一 般 是 使 用 以 上 溶 劑 ， 平 行 操

17、作 ， 同 時 提取 ， 附 加 空 白 對 照 ， 比 對 結(jié) 果 ， 判 斷 哪 種 有 機 溶 劑 的 提取 效 果 最 好 ；若 均 不 理 想 ， 可 以 再 混 合 使 用 以 上 溶 劑 ， 調(diào) 整 比 例1:1 ,1:2 ,1:3的 使 用 ；在 摸 索 合 適 的 提 取 溶 劑 同 時 ， 可 根 據(jù) 藥 物 的 酸 堿 性 嘗 試著 添 加 些 酸 、 堿 或 者 離 子 對 試 劑 ， 提 高 回 收 率 ；提 取 過 程 中 ， 一 定 要 嚴 控 pH值 ， 對 于 兩 性 藥 物 則 需 要 使用 緩 沖 溶 液 保 證 提 取 回 收 率 的 穩(wěn) 定 可 重 現(xiàn)

18、 。 28 29 取 血 漿 樣 品 100uL， +同 位 素 內(nèi) 標 20uL， +甲 酸 50uL， +正 己 烷1mL+叔 丁 基 甲 醚 3mL， 渦 旋 震 蕩 10min， 3000r/min離 心 10min， -80 冷 凍 10min， 倒 出 上 層 有 機 層 ， 40 水 浴 氮 氣 吹 干 ， +150uL丙 酮溶 解 ， +50uL丹 磺 酰 氯 丙 酮 溶 液 ， 40 水 浴 孵 育 20min， +磷 酸 鹽 緩 沖液 2mL+叔 丁 基 甲 醚 4mL， 渦 旋 震 蕩 10min， 3000r/min離 心 10min， -80 冷 凍 10min， 倒

19、 出 上 層 有 機 層 ， 40 水 浴 氮 氣 吹 干 ， 流 動 相 復(fù) 溶 。 固 相 萃 取 ( S o l i d P h a s e Extraction， 簡 稱 SPE)是 從 八 十 年 代中 期 開 始 發(fā) 展 起 來 的 一 項 樣 品 前 處 理技 術(shù) 。 由 液 固 萃 取 和 液 相 色 譜 技 術(shù) 相結(jié) 合 發(fā) 展 而 來 。 主 要 通 過 固 相 填 料 對樣 品 組 分 的 選 擇 性 吸 咐 及 解 吸 過 程 ，實 現(xiàn) 對 樣 品 的 分 離 ， 純 化 和 富 集 。 主要 目 的 在 于 降 低 樣 品 基 質(zhì) 干 擾 ， 提 高檢 測 靈 敏 度

20、 。 30 SPE 技 術(shù) 基 于 液 -固 相 色 譜 理 論 ， 采 用 選 擇 性 吸 附 、 選 擇性 洗 脫 的 方 式 對 樣 品 進 行 富 集 、 分 離 、 純 化 ， 是 一 種 包 括液 相 和 固 相 的 物 理 萃 取 過 程 ； 也 可 以 將 其 近 似 地 看 作 一 種簡 單 的 色 譜 過 程 。 較 常 用 的 方 法 是 使 液 體 樣 品 通 過 一 吸 附 劑 ， 保 留 其 中 被 測物 質(zhì) ， 再 選 用 適 當 強 度 溶 劑 沖 去 雜 質(zhì) ， 然 后 用 少 量 良 溶 劑洗 脫 被 測 物 質(zhì) ， 從 而 達 到 快 速 分 離 凈 化

21、與 濃 縮 的 目 的 。 也可 選 擇 性 吸 附 干 擾 雜 質(zhì) ， 而 讓 被 測 物 質(zhì) 流 出 。 31 32 33萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！ 固 相 萃 取 操 作 一 般 有 五 步 ： 活 化 甲 醇 /乙 腈 潤 濕 小 柱 ， 活 化 填 料 ； 平 衡 水 或 適 當 緩 沖 液 沖 洗 平 衡 小 柱 ； 上 樣 將 樣 品 轉(zhuǎn) 移 上 柱 ， 抽 去 廢 液 ； 淋 洗 水 或 緩 沖 液 最 大 程 度 洗 去 干 擾 物 ； 洗 脫 用 小 體 積 的 溶 劑 將 被 測 物 質(zhì) 洗 脫 下 來 并 收 集 。 34 1.正 相 色 譜 原 理2.反 相

22、色 譜 原 理3.離 子 交 換 原 理 35 根 據(jù) 原 理 分 類 ： 36 37 SPE方 法 的 優(yōu) 點 ：1.不 會 發(fā) 生 乳 化 ； 2.適 用 范 圍 廣 ； 3.提 取 效 率 高 ；4.方 便 快 速 ， 可 以 一 次 提 取 分 離 多 種 化 合 物 ；5.溶 劑 消 耗 少 ； 6.易 于 實 現(xiàn) 自 動 化 ；7.離 子 交 換 固 相 萃 取 利 用 離 子 交 換 原 理 ， 同 色 譜 柱 的 依據(jù) 極 性 大 小 的 分 離 原 理 不 同 ， 配 合 使 用 ， 可 以 最 大 限 度的 分 離 出 藥 物 ， 去 除 干 擾 。 目 前 商 品 化 的

23、 固 相 萃 取 小 柱 （ cartridge） 已 經(jīng) 廣 泛 應(yīng) 用 。 38 三 種 方 法 的 比 較 ： 將 藥 物 進 行 化 學 衍 生 化 的 目 的 是 ： 使 藥 物 變 成 具 有 能被 分 離 的 性 質(zhì) ； 提 高 檢 測 的 靈 敏 度 ； 增 強 藥 物 的 穩(wěn)定 性 ； 提 高 對 光 學 異 構(gòu) 體 分 離 的 能 力 等 。藥 物 分 子 中 含 有 活 潑 H者 均 可 被 化 學 衍 生 化 ， 如 ： -COOH、-OH、 -NH2、 -NH-、 -SH等 官 能 團 的 藥 物 都 可 被 衍 生 化 。 39 HPLC中 化 學 衍 生 化 法

24、， 包 括 柱 前 衍 生 化 和 柱 后 衍 生 化 兩種 方 法 。柱 前 衍 生 化 分 析 前 盡 可 能 將 藥 物 進 行 提 取 分 離 后 再 衍 生化 ， 防 止 其 他 含 有 相 同 的 功 能 基 團 的 雜 質(zhì) 也 被 衍 生 化 ，影 響 分 離 。 柱 后 衍 生 化 是 藥 物 經(jīng) 色 譜 柱 分 離 之 后 進 行 的 ，所 以 可 形 成 對 檢 測 器 具 有 高 靈 敏 度 的 衍 生 物 。HPLC法 常 用 的 衍 生 化 試 劑 有 鄰 苯 二 醛 、 丹 磺 酰 氯 、 熒 胺等 。 40 41 待 測 藥 物 的 理 化 性 質(zhì) 及 在 生 物

25、 體 內(nèi) 的 存 在 狀 況 分 析 測 定 的 目 的 與 要 求 生 物 樣 品 的 類 型 與 預(yù) 處 理 方 法 實 驗 室 條 件 42 1. 光 譜 分 析 法 2. 3. 毛 細 管 電 泳 法 4. 5. 同 位 素 法 43 體 內(nèi) 藥 物 分 析 方 法 大 致 可 歸 為 一 下 幾 類 ： 44 1.查 閱 相 關(guān) 文 獻 資 料 ， 了 解 藥 物 的 理 化 性 質(zhì) ， 選 定 內(nèi) 標 物質(zhì) ；2.使 用 標 準 品 ， 掃 描 質(zhì) 譜 條 件 ；3.選 擇 色 譜 柱 和 流 動 相 ， 摸 索 合 適 的 液 相 條 件 ；4.依 據(jù) 樣 品 基 質(zhì) ， 配 制

26、 模 擬 生 物 樣 品 ， 選 擇 相 應(yīng) 的 樣 品 處理 方 法 ， 處 理 后 進 樣 分 析 ；5.調(diào) 整 樣 品 處 理 方 法 或 液 相 條 件 ， 并 可 進 一 步 優(yōu) 化 質(zhì) 譜 參數(shù) ； 6.根 據(jù) 檢 測 目 的 ， 設(shè) 定 定 量 范 圍 ， 對 方 法 進 行 考 察 。 方 法 學 驗 證 （ validation） 生 物 樣 品 測 定 的 關(guān) 鍵 是 方 法 學 的 確 證 。 方 法 學 確 證 是整 個 藥 代 動 力 學 研 究 的 基 礎(chǔ) 。 這 是 藥 代 動 力 學 研 究 有 別 于其 它 藥 理 毒 理 研 究 的 特 殊 之 處 。 所

27、有 藥 代 動 力 學 研 究 結(jié) 果 ，都 依 賴 于 生 物 樣 品 的 測 定 ， 只 有 可 靠 的 方 法 才 能 得 出 可 靠的 結(jié) 果 ， 因 此 必 須 對 所 建 立 的 方 法 進 行 驗 證 。 并 且 在 實 際樣 品 檢 測 過 程 中 還 應(yīng) 進 行 方 法 學 質(zhì) 控 ， 制 備 隨 行 標 準 曲 線并 對 質(zhì) 控 樣 品 進 行 測 定 ， 以 確 保 檢 測 方 法 的 可 靠 性 。 45 46 1. 特 異 性 和 靈 敏 度2. 標 準 曲 線 和 線 性 范 圍3. 批 內(nèi) 精 密 度 和 準 確 度4. 批 間 精 密 度 和 準 確 度5. 稀

28、 釋 效 應(yīng) 6. 定 量 下 限7. 回 收 率 8. 基 質(zhì) 效 應(yīng)9. 殘 留 效 應(yīng)10. 穩(wěn) 定 性 （ 標 準 溶 液 穩(wěn) 定 性 、融 解 樣 品 穩(wěn) 定 性 、 長 期 穩(wěn) 定 性 、 凍/融 循 環(huán) 穩(wěn) 定 性 、 進 樣 器 中 樣 品 穩(wěn)定 性 等 ）化 學 藥 物 臨 床 藥 代 動 力 學 研 究 技 術(shù) 指 導 原 則 47 Guideline on bioanalytical method validation - EMEA考 察 方 法 ： 測 定 至 少 六 份 不 同 來 源 的 合 適 的 空 白 生 物 基 質(zhì)結(jié) 果 要 求 ： 在 化 合 物 出 峰

29、位 置 ， 干 擾 成 分 的 信 號 大 小 不 得 超 過 定 量 下 限 中 分 析 物 信 號 高 度 的 20%；在 內(nèi) 標 的 出 峰 位 置 ， 雜 質(zhì) 響 應(yīng) 不 得 超 過 內(nèi) 標 信 號 的 5%。 48 考 察 方 法 ： 跟 在 最 高 濃 度 的 樣 品 之 后 ， 連 續(xù) 進 樣 三 遍 空 白 樣 品 ULOQ - Blank - ULOQ - Blank - ULOQ - Blank結(jié) 果 要 求 ： 空 白 樣 品 中 分 析 物 的 信 號 應(yīng) 小 于 定 量 下 限 中 分 析 物 信 號 的 20%； 內(nèi) 標 的 信 號 應(yīng) 小 于 5%。 49 考 察

30、 方 法 ： 連 續(xù) 測 定 六 份 定 量 下 限 濃 度 的 樣 品 ， 統(tǒng) 計 準 確 度 和 精 密 度結(jié) 果 要 求 ： 準 確 度 應(yīng) 在 80% - 120%之 間 ； 精 密 度 結(jié) 果 小 于 20%； 同 時 定 量 下 限 處 信 號 響 應(yīng) 值 應(yīng) 至 少 為 空 白 樣 品 的 5倍 。 50 結(jié) 果 要 求 ： 校 正 曲 線 應(yīng) 至 少 包 括 六 個 濃 度 點 以 及 一 個 Matrix Blank 和 一 個 Control Zero 點 （ 僅 作 參 考 ， 不 納 入 校 正 曲線 的 計 算 ） ， 必 要 時 可 以 做 雙 份 測 定 ； 各

31、個 濃 度 點 的 準 確度 應(yīng) 在 85% - 115%之 間 ， 精 密 度 應(yīng) 小 于 15%， 定 量 下 限 處為 80% - 120%和 20%； 對 不 符 合 要 求 的 濃 度 點 可 以 排 除 計算 ， 但 至 少 有 75%以 上 的 濃 度 點 符 合 要 求 ； 方 法 驗 證 期 間應(yīng) 至 少 提 供 三 條 以 上 的 合 格 的 標 準 曲 線 納 入 統(tǒng) 計 。 51 考 察 方 法 ： 測 定 四 個 濃 度 的 Q C樣 品 ， 分 別 為 LLOQ ， low Q C， medium Q C， high Q C， 每 個 濃 度 至 少 測 定 5份

32、；結(jié) 果 要 求 ： ： 每 個 濃 度 Q C樣 品 測 定 結(jié) 果 的 均 值 應(yīng) 在 理 論 濃 度 的 85% -115%之 間 ， LLOQ 處 在 80%-120%之間 ； ： 至 少 兩 天 測 定 至 少 三 批 Q C樣 品 ， 每 個 濃 度 Q C樣 品 測 定 結(jié) 果 的 總 平 均 值 應(yīng) 在 理 論 濃 度 的 85% - 115%之 間 ， LLOQ 處 在 80%-120%之 間 。 52 將 標 準 品 加 入 到 生 物 基 質(zhì) 中 配 制 成 的 模 擬 生 物 樣 品 ， 用作 方 法 學 驗 證 中 的 考 察 樣 品 和 樣 品 測 定 中 的 方

33、法 學 質(zhì) 控 。濃 度 不 超 過 LLOQ 的 3倍 ；濃 度 一 般 為 定 量 范 圍 的 中 間 濃度 ；濃 度 至 少 為 ULOQ 的 75%。 質(zhì) 控 樣 品 推 薦 由 獨 立 人 員 一 次 性 配 制 ， 進 樣 分 析 合 格 后分 裝 ， 冰 凍 儲 存 ， 每 次 取 足 夠 數(shù) 量 的 樣 品 使 用 ， 剩 余 丟 棄 。 53 考 察 方 法 ： 測 定 四 個 濃 度 的 Q C樣 品 ， 分 別 為 LLOQ ， low Q C， medium Q C， high Q C， 每 個 濃 度 至 少 測 定 5份 ；結(jié) 果 要 求 ： ： 統(tǒng) 計 每 個 濃

34、 度 Q C樣 品 測 定 結(jié) 果 間 的 CV%值 應(yīng) 小 于 15% ， LLOQ 處 小 于 20%； ： 統(tǒng) 計 每 個 濃 度 所 有 Q C樣 品 測 定 結(jié) 果 間 的 CV%值 應(yīng) 小 于 15% ， LLOQ 處 小 于 20%。 54 考 察 方 法 ： 將 5倍 于 ULOQ 濃 度 的 Q C樣 品 ， 使 用 空 白 基 質(zhì) 連 續(xù) 稀 釋 。 每 個 濃 度 稀 釋 ， 至 少 測 定 5份 樣 品 ；結(jié) 果 要 求 ： 每 個 稀 釋 濃 度 的 準 確 度 偏 差 和 精 密 度 應(yīng) 在 15% 之 內(nèi) 。 55 8.1分 析 物 和 內(nèi) 標 的 標 準 貯 備

35、 液 (Stock)和 標 準 工 作 液(Working)的 穩(wěn) 定 性8.2樣 品 冰 凍 /融 三 次 解 穩(wěn) 定 性 ， Freeze/Thaw， F/T8.3樣 品 融 解 后 短 期 穩(wěn) 定 性 ， Thawed8.4樣 品 冰 凍 的 長 期 穩(wěn) 定 性 ， Long-term8.5處 理 后 樣 品 溶 液 在 進 樣 器 中 的 穩(wěn) 定 性 56 穩(wěn) 定 性 考 察 內(nèi) 容 和 操 作 主 要 是 根 據(jù) 樣 品 的 實 際 儲 存條 件 設(shè) 計 ， 所 考 察 的 凍 /融 循 環(huán) 數(shù) 和 儲 存 時 間 均 應(yīng) 相 等或 超 過 實 際 樣 品 。 標 準 溶 液 穩(wěn) 定

36、 性 考 察 應(yīng) 將 stock solution稀 釋 至 合 適的 濃 度 范 圍 之 內(nèi) ， 結(jié) 果 新 /舊 兩 份 標 準 溶 液 的 Diff%值應(yīng) 在 5%之 內(nèi) 。 樣 品 的 穩(wěn) 定 性 應(yīng) 使 用 Low和 High濃 度 的 Q C樣 品 進行 考 察 ， 每 個 濃 度 測 定 三 份 ， 結(jié) 果 的 均 值 與 理 論 濃 度的 DEV%值 應(yīng) 在 15%之 內(nèi) 。 57 考 察 方 法 ： 在 LQ C和 HQ C兩 個 濃 度 基 礎(chǔ) 上 ， 取 至 少 6份 不 同 來 源 的 空 白 生 物 基 質(zhì) ， 提 取 后 加 入 標 準 和 內(nèi) 標 溶 液 做 為

37、考 察 組 ； 對 照 組 使 用 不 含 有 基 質(zhì) 的 純 溶 液 ， 濃 度 相 當 于 加 入 的 LQ C和 HQ C的 濃度 ； 計 算 基 質(zhì) 效 應(yīng) 因 子 MF和 內(nèi) 標 校 正 的 MF。結(jié) 果 要 求 ： 內(nèi) 標 校 正 的 MF的 CV%值 應(yīng) 不 大 于 15%。 58 59 考 察 方 法 ： a組 ： 使 用 配 制 三 個 濃 度 的 QC樣 品 ， 各 測 定 三 份 ； b組 ： 使 用 配 制 三 個 濃 度 的 QC樣 品 ，各 測 定 三 份 ；結(jié) 果 要 求 ： 絕 對 基 質(zhì) 效 應(yīng) =響 應(yīng) 值 a/響 應(yīng) 值 b*100%； 各 濃 度 質(zhì) 控

38、 的 分 析 物 和 內(nèi) 標 的 絕 對 基 質(zhì) 效 應(yīng) 均 值 在 85% -115%之 間 ， 相 對 標 準 偏 差 小 于 15%。 60 考 察 方 法 ： 使 用 6份 不 同 來 源 的 生 物 基 質(zhì) ， 測 定 LLOQ ，每 份 基 質(zhì) 重 復(fù) 測 定 3份 ；結(jié) 果 要 求 ： 準 確 度 應(yīng) 在 80% - 120%之 間 ； 每 個 基 質(zhì) 至 少有 2個 符 合 要 求 算 合 格 ； 6批 基 質(zhì) 中 ， 至 少 有 5批 合 格 算 通 過 。 61 考 察 方 法 ： a組 ： 測 定 三 個 濃 度 的 Q C樣 品 各 六 份 ， 流 動 相 復(fù) 溶 ； b組 ： 使 用 等 量 空 白 基 質(zhì) 代 替 Q C樣 品 ， 共 測 定 18份 ， 提 取 后 吹 干 ， 使 用 等 體 積 的 折 算 后 相 當 于 Q C濃 度 的 溶 液 復(fù) 溶 ；結(jié) 果 要 求 ： 計 算 3個 濃 度 的 Q C樣 品 的 CV%值 應(yīng) 小 于 15%。 62 舉 例 ： 地 西 泮 HPLC-MS/MS分 析 方 法 驗 證 報 告 63 64