第三講 利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析課件.ppt

《第三講 利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析課件.ppt》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《第三講 利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析課件.ppt（68頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、利 用 基 因 芯 片 進(jìn) 行基 因 表 達(dá) 譜 分 析第 三 講 RNA的 檢 測(cè) : 表 達(dá) 豐 度 ， 剪 切 體 DNA的 檢 測(cè) ： SNP， CGH， Methylation cDNA 芯 片 的 主 要 用 于 ： 表 達(dá) 譜 芯 片 ， CGH 寡 核 苷 酸 芯 片 主 要 用 于 ： 診 斷 芯 片 ， SNP分 型 芯片 基 因 芯 片 應(yīng) 用 More Microarray Applications Chromosomes DNA Gene promoters mRNA mRNA variants microRNAs aCGH SNPs miRNADNA RNAChIP

2、/LA GeneExpression AlternateSplicing 雙 色 熒 光 系 統(tǒng) cDNA芯 片 技 術(shù) 及 載 有 較 長 片 段 的 寡 核 苷 酸 芯 片 實(shí) 驗(yàn) 組 及 對(duì) 照 組 兩 種 組 織 的 mRNA在 反 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA的 過 程 中 分 別 標(biāo) 記 上 Cy3和 Cy5兩 種 熒 光 ，制 備 成 探 針 ， 競(jìng) 爭(zhēng) 性 地 與 芯 片 上 的 核 酸 片 段 進(jìn) 行雜 交 兩 種 波 長 的 激 光 掃 描 讀 取 競(jìng) 爭(zhēng) 雜 交 的 結(jié) 果 ， 通 過計(jì) 算 機(jī) 處 理 就 能 確 定 芯 片 上 基 因 所 結(jié) 合 探 針 的 量 ，通 過 計(jì)

3、算 兩 種 熒 光 強(qiáng) 度 的 比 值 來 判 斷 兩 種 組 織 中基 因 表 達(dá) 是 否 有 變 化 。 雙 熒 光 系 統(tǒng) 芯 片 的 原 理 及 流 程 圖 單 色 熒 光 系 統(tǒng) 較 短 的 寡 核 苷 酸 芯 片 如 Affymatrix芯 片 ；載 有 較 長 片 段 的 寡 核 苷 酸 芯 片 也 可 使 用 ，如 Illumina芯 片 實(shí) 驗(yàn) 組 和 對(duì) 照 組 分 別 用 同 樣 的 熒 光 物 質(zhì) 標(biāo)記 （ 或 生 物 素 biotin） ， 分 別 與 芯 片 雜 交 ，即 一 張 芯 片 只 雜 交 一 個(gè) 樣 本 根 據(jù) 雜 交 結(jié) 果 判 斷 待 測(cè) 樣 品 同

4、 芯 片 上 哪 個(gè)片 段 結(jié) 合 ， 通 過 與 對(duì) 照 組 的 比 較 轉(zhuǎn) 化 成 基因 表 達(dá) 的 改 變 單 熒 光 系 統(tǒng) 芯 片 的 原 理 及 流 程 圖 單 通 道 和 雙 通 道 的 比 較 單 通 道 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 重 復(fù) 性 更 好 ， 使 得 比 較 不同 樣 品 之 間 各 種 基 因 表 達(dá) 的 相 對(duì) 比 例 是 可靠 的 。 進(jìn) 行 多 個(gè) 樣 品 之 間 （ 芯 片 之 間 ） 的比 較 時(shí) ， 只 需 在 多 個(gè) 樣 本 中 設(shè) 置 對(duì) 照 。 由于 點(diǎn) 樣 的 是 寡 核 苷 酸 ， 探 針 無 法 檢 測(cè) 。 雙 通 道 （ 點(diǎn) 樣 cDNA） 重 復(fù)

5、 性 相 對(duì) 較 差 ， 但是 探 針 可 以 測(cè) 序 驗(yàn) 證 。 雙 色 法 需 在 每 次 雜交 檢 測(cè) 中 設(shè) 置 對(duì) 照 ， 只 能 進(jìn) 行 兩 個(gè) 樣 品 之間 的 比 較 ， 芯 片 之 間 的 比 較 并 不 可 靠 Expression Analysis Arrays （ Affymetrix) Unique PM-MM Probe Design11-20 pairs of 25mer probeAAAAA3UTR Each gene is represented on the probe array by multiple probe pairs Each probe pai

6、r consists of a perfect match and a mismatch oligonucleotide Perfect MatchMismatch ChipProbe Pair Probe cell or feature PM-MM探 針 設(shè) 計(jì) 的 優(yōu) 勢(shì) 靈 敏 度 的 提 高 將 已 克 隆 的 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物以 不 同 的 濃 度 摻 入 到 組織 樣 品 中 。 經(jīng) 過 標(biāo) 記 的樣 品 與 Affymetrix Genechip人 類 基 因 組芯 片 雜 交 ， 在 克 隆 轉(zhuǎn) 錄產(chǎn) 物 濃 度 低 于 8pM時(shí) ，PM單 獨(dú) 探 針 無 法 探 測(cè)出 相 應(yīng)

7、的 濃 度 變 化 ， 而與 MM探 針 聯(lián) 合 使 用 則可 以 探 測(cè) 出 。 單 鏈 和 雙 鏈 探 針 雙 鏈 探 針 在 液 相 條 件 下 自 我 復(fù) 性 從而 大 大 降 低 與 固 著 的 靶 DNA雜 交的 機(jī) 會(huì) ， 從 而 降 低 了 探 測(cè) 靈 敏 度 ，因 此 需 更 多 的 探 針 量 。 單 鏈 ， 使 雜 交 靈 敏 度 提 高 基 因 芯 片 實(shí) 驗(yàn) 流 程 及 方 法 cDNA microarrayTWO CHANNEL MICROARRAY Affymetrix Expression Analysis Reverse Transcriptasein vit

8、ro transcriptionmRNAcDNAFragmentation of cRNA cRNAGeneChip Hybridization標(biāo) 記 實(shí)驗(yàn)過程 樣本制備 樣本標(biāo)記預(yù)雜交雜交洗滌染色（如生物素標(biāo)記）掃描數(shù)據(jù)分析 Hybridization process of GeneChipLabeling cRNA fragment Hybridization mixtureEukaryoticH yb.ControlControlOligo B2 hybridization（ 16hour）Data analysis Scan Wash & stain 樣 本 制 備 表 達(dá) 譜 基 因

9、 芯 片 研 究 的 對(duì) 象 是 樣 本 中 的mRNA， 抽 提 出 的 mRNA需 要 經(jīng) 過 反 轉(zhuǎn) 錄酶 的 作 用 轉(zhuǎn) 變 為 cDNA， 同 時(shí) 進(jìn) 行 熒 光 標(biāo) 記 ，標(biāo) 記 好 的 cDNA靶 分 子 就 可 用 于 雜 交 。 基 因 芯 片 實(shí) 驗(yàn) 中 的 RNA抽 提 大 都 采 用 分 子生 物 學(xué) 中 傳 統(tǒng) 的 方 法 ， 但 要 求 必 須 能 夠 盡可 能 多 的 抽 提 出 組 織 中 的 RNA分 子 ， 保 持實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 信 息 與 組 織 中 mRNA拷 貝 數(shù) 信 息之 間 的 平 行 性 。 mRNA的 純 化 方 法 兩 步 法 ： 從 樣

10、本 中 制 備 總 RNA， 再 從 總 RNA中 分離 mRNA, 總 RNA中 包 括 rRNA、 tRNA和 mRNA，其 中 以 上 是 rRNA和 tRNA， 分 離 mRNA的原 理 一 般 利 用 真 核 生 物 的 mRNA的 端 都 有polyA尾 ， 用 poly（ dT） -纖 維 素 親 和 層 析 純 化mRNA。 一 步 法 ： 從 組 織 樣 本 中 直 接 用 poly（ dT） -纖 維素 親 和 層 析 純 化 mRNA， 這 種 方 法 簡 便 ， 但 RNA的 純 度 不 夠 ， 當(dāng) 組 織 量 少 或 對(duì) RNA質(zhì) 量 要 求 不 高時(shí) 可 采 用 逆

11、 轉(zhuǎn) 錄 ： 合 成 cDNA一 鏈 mRNA逆 轉(zhuǎn) 錄 合 成 cDNA時(shí) 用 poly（ dT） 作引 物 ， 可 以 直 接 用 總 RNA作 為 摸 板 進(jìn) 行 逆 轉(zhuǎn)錄 標(biāo) 記 ， 簡 化 步 驟 ， 減 少 mRNA的 損 失 ， 從而 減 少 對(duì) 組 織 的 需 求 ， 也 避 免 了 從 總 RNA中純 化 mRNA的 工 作 總 RNA的 純 度 不 如 mRNA高 ， 直 接 從 總 RNA進(jìn) 行 mRNA的 逆 轉(zhuǎn) 錄 在 一 定 程 度 上 會(huì) 影 響 到逆 轉(zhuǎn) 錄 標(biāo) 記 的 效 率 ， 需 要 盡 可 能 保 證 總 RNA的 純 度 樣 本 量 從 多 少 總 R

12、NA中 進(jìn) 行 逆 轉(zhuǎn) 錄 才 能 滿 足 實(shí) 驗(yàn)需 要 ？ 非 擴(kuò) 增 ： 20微 克 ； 擴(kuò) 增 ： 1微 克 有 些 情 況 下 ， 樣 本 極 為 稀 有 ， 不 可 能 得 到大 量 的 mRNA靶 分 子 基 因 芯 片 實(shí) 驗(yàn) 對(duì) 總 RNA量 的 需 求 在 一 定 程度 上 限 制 了 該 技 術(shù) 的 推 廣 發(fā) 展 方 向 ： 提 高 檢 測(cè) 靈 敏 度 ， 減 少 基 因 芯片 實(shí) 驗(yàn) 樣 本 用 量 核 苷 酸 的 修 飾 方 法 熒 光 標(biāo) 記 ： 需 避 光 ， 合 成 效 率 低 ， 不 同 的 熒 光 修飾 會(huì) 影 響 標(biāo) 記 效 率 ， 如 Cy3標(biāo) 記 的

13、和 Cy5標(biāo) 記 的NTP摻 入 到 DNA和 RNA鏈 中 的 效 率 是 不 一 樣 的 ；最 終 也 導(dǎo) 致 成 本 高 熒 光 標(biāo) 記 ： 標(biāo) 記 分 子 在 特 定 的 波 長 范 圍 被 激 光 光源 激 發(fā) 出 熒 光 ， 從 而 對(duì) 含 有 標(biāo) 記 分 子 的 樣 本 進(jìn) 行檢 測(cè) 。 如 花 青 素 （ Cyanin） Cy3、 Cy5， 其 激 發(fā)和 發(fā) 射 波 長 分 別 為 ： 550/570和 649/670。 大 部 分掃 描 儀 都 能 對(duì) 這 兩 種 熒 光 標(biāo) 記 進(jìn) 行 圖 像 處 理 。 這種 標(biāo) 記 方 法 沒 有 同 位 素 標(biāo) 記 的 限 制 ； 而

14、 且 具 有 極高 的 靈 敏 度 ， 能 夠 進(jìn) 行 定 量 檢 測(cè) 生 物 素 標(biāo) 記 的 dNTP ： 利 用 biotin-Streptavidin phycoerythrin Fluorescent dye的 結(jié) 合 進(jìn) 行 檢 測(cè) ，標(biāo) 記 探 針 穩(wěn) 定 ， 不 失 活 ， 并 能 配 用 多 種 檢 測(cè) 系 統(tǒng) ， 簡單 方 便 ， 掃 描 成 本 較 低 。 熒 光 素 標(biāo) 記 的 dNTP： Cy3-的 dNTP ， Cy5-的 dNTP 同 位 素 標(biāo) 記 的 dNTP amino allyl （ 氨 烯 丙 基 ） NTP ： 便 宜 ， 摻 入 DNA和RNA鏈 的

15、效 率 與 未 標(biāo) 記 的 NTP相 同 ； 檢 測(cè) 的 時(shí) 候 只需 在 它 的 氨 基 反 應(yīng) 基 團(tuán) 上 偶 聯(lián) Cy系 列 的 染 料 或 其 他染 料 ； 但 實(shí) 驗(yàn) 誤 差 大核 苷 酸 的 修 飾 方 法 標(biāo) 記 方 法 RNA樣 本 不 擴(kuò) 增 進(jìn) 行 標(biāo) 記 ： 在 反 轉(zhuǎn) 錄 的 體系 中 加 入 Cy3或 Cy5標(biāo) 記 過 的 dNTP類 似 物 ，通 過 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 的 作 用 ， 標(biāo) 記 新 合 成 的 cDNA。這 種 實(shí) 驗(yàn) 方 法 效 率 較 低 ， 對(duì) RNA樣 本 需 求量 大 ， 通 常 要 50 200g總 RNA， 1 3g mRNA RNA樣 本

16、 擴(kuò) 增 后 進(jìn) 行 標(biāo) 記 聯(lián) 合 應(yīng) 用 cDNA擴(kuò) 增 和 模 板 指 導(dǎo) 下 的 體 外 轉(zhuǎn) 錄 反 應(yīng)來 完 成 線 性 擴(kuò) 增 。 PCR方 法 ： 同 一 用 量 和 限 制 循 環(huán) 次 數(shù) 的 條 件 下 ， 通 過 RT-PCR可 平 行 的 擴(kuò) 增 實(shí) 驗(yàn) 組 和 對(duì) 照 組 的 RNA樣 本 以 滿 足實(shí) 驗(yàn) 要 求 并 同 時(shí) 進(jìn) 行 熒 光 標(biāo) 記 。擴(kuò) 增 mRNA（ cRNA） 靶 分 子 基 于 T7的 mRNA線 性 擴(kuò) 增 ： 利 用 模 板 指 導(dǎo)下 的 體 外 轉(zhuǎn) 錄 反 應(yīng) 來 完 成 線 性 擴(kuò) 增 。 該 方法 能 從 1 50ng mRNA分 子

17、 出 發(fā) 擴(kuò) 增 出 足夠 數(shù) 量 的 cDNA靶 分 子 。 這 種 擴(kuò) 增 方 法 更 具線 性擴(kuò) 增 mRNA（ cRNA） 靶 分 子 合 成 cDNA二 鏈 在 小 鼠 白 血 病 病 毒 （ MMLV） 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 的 作 用 下 ，反 轉(zhuǎn) 錄 生 產(chǎn) cDNA一 鏈 。 MMLV反 轉(zhuǎn) 錄 酶 會(huì) 在cDNA一 鏈 的 3端 加 上 非 模 板 的 寡 聚 C殘 基 ， 這 時(shí)加 入 3端 帶 有 寡 聚 G的 引 物 ， 可 以 結(jié) 合 到 cDNA的3端 ， 生 成 一 小 段 雙 鏈 的 cDNA， 再 在 DNA聚 合酶 的 作 用 下 延 伸 形 成 加 入 RNa

18、se H， 水 解 掉 RNA模 板 ， 以 殘 留 的 與cDNA一 鏈 配 對(duì) 的 短 片 段 RNA為 引 物 ， 在 DNA聚合 酶 的 作 用 下 生 成 雙 鏈 cDNA mRNA cRNA噬 菌 體 T7 DNA編 碼 的 酶 ，對(duì) T7啟 動(dòng) 子 序 列 具 有 高度 特 異 性 ， 不 能 識(shí) 別 其它 生 物 來 源 的 啟 動(dòng) 子 。是 依 賴 于 DNA的 RNA聚合 酶 ， 具 有 53的 RNA聚 合 酶 活 性 ， 以 含 有 T7啟 動(dòng) 子 序 列 的 雙 鏈 DNA為 模 板 ， 以 NTP為 底 物 ，合 成 與 啟 動(dòng) 子 下 游 的 模板 DNA互 補(bǔ)

19、的 NA。 Fragmentation of biotinylated cRNA 芯 片 雜 交 將 靶 分 子 變 性 后 ， 用 預(yù) 雜 交 液 與 芯 片 進(jìn) 行 預(yù) 雜 交1小 時(shí) 左 右 （ cDNA和 長 鏈 寡 核 苷 酸 ， 42度 （ 50 甲 酰 胺 ） ； 短 鏈 寡 核 苷 酸 ， 50度 ） 雜 交 ： 溫 度 同 預(yù) 雜 交 ， 標(biāo) 記 好 的 樣 品 與 雜 交 倉 內(nèi)反 應(yīng) 14-18小 時(shí) 洗 片 ， 掃 描 檢 測(cè) 雜 交 量 依 賴 靶 DNA和 探 針 的 濃 度 ， 當(dāng) 靶 DNA濃度 一 定 時(shí) ， 熒 光 信 號(hào) 強(qiáng) 度 在 一 定 范 圍 內(nèi) 與

20、 探 針 量成 線 性 關(guān) 系 ArrayFragmented cRNA Target RNA:DNA Hybridized ArrayStreptavidin phycoerythrinFluorescent dyeRNA相 對(duì) 不 穩(wěn) 定 雜 交 過 程影 響 雜 交 速 率 和 雜 交 雙 鏈 穩(wěn) 定 性 的 因 素 1 核 酸 濃 度 2 探 針 的 類 型 和 長 度3 堿 基 組 成 4 雜 交 液 成 分（ 1） 離 子 強(qiáng) 度 （ 2） Formamide （ 3） 季 銨 鹽 溶 液 （ 4） 雜 交 加 速 劑 5 不 匹 配 序 列6 雜 交 時(shí) 間 7 雜 交 溫 度

21、原 核 生 物 樣 品 數(shù) 據(jù) 分 析 流 程 圖 Experiment group/control : Hepacellular carcinoma/Normal liver Red: 明 顯 上 調(diào)Yellow: 差 異 不 顯 著Green: 明 顯 下 調(diào) 假 陰 性 ： 一 般 不 關(guān) 心 ， 但 也 要 看 實(shí) 驗(yàn) 目 的 假 陽 性 ： 驗(yàn) 證 基 因 芯 片 結(jié) 果 需 要 傳 統(tǒng) 方 法 的 驗(yàn) 證 新 一 代 芯 片 技 術(shù) 光 纖 微 珠 芯 片n Screening Unlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Op

22、tic Gene Arrays, Steemers, F.J., Ferguson, J.A., Walt, D.R., Nature Biotechnology,18, 91-94, 2000. n Techview: Molecular Biology. Bead-Based Fiber-Optic Arrays, Walt, D.R., Science, 287, 451-452, 2000n Decoding Randomly Ordered DNA Arrays, Kevin L. Gunderson, Genome Research, 14: 870-877, 2004. 微 珠n

23、 3.1 um無 孔 無 熒 光硅 珠n 每 個(gè) 微 珠 單 獨(dú) 質(zhì) 控有 效 的 反 應(yīng) 表 面 積 和 體 積 比低 /無 背 景大 小 均 一 Oligator 合 成 工 廠寡 聚 核 苷 酸 探 針9 6 孔 板 全 自 動(dòng) 化 合 成LIMS 控 制 所 有 過 程年 生 產(chǎn) 能 力 2 0 million 嚴(yán) 格 的 QC 系 統(tǒng)OD2 6 0 檢 測(cè) 產(chǎn) 量MALDI-TOF 質(zhì) 譜 檢 測(cè)UV 毛 細(xì) 管 電 泳實(shí) 時(shí) 數(shù) 碼 色 彩 監(jiān) 控 寡 聚 核 苷 酸 探 針 3 End5 End 5 0 mer 探 針合 成 探 針 從 3 到5 端 ， 保 證 地 址序 列 能

24、 合 成 并 結(jié)合 到 微 珠 上 。 活化 的 微 珠 的 氨 基是 否 只 與 oligo的 5 端 結(jié) 合 ？ 2 3 mer 地 址 序 列7 3 mer 2 3 mer 5 0 mer 探 針 3 End5 End探 針 與 微 珠 連 接寡 聚 核 苷 酸 探 針每 個(gè) 微 珠 上 連 接 1 0 0 萬 左 右 相 同 的 探 針 三 步 法 微 珠 制 備n Raw BeadsSilanization n produces a general coupling molecule an aminen Trimethoxy amino propyl silanen Very sta

25、ble compared to other techniquesActivationn Prepares the bead to attach the Oligo n Cyanuric Chloriden Immobilization of DNAn Complexityn Discrete reactionsn 96 Well microtiter plate NH2OH N NNNH ClCl n 每 種 (微 珠 +探 針 )單 獨(dú) 合 成 并 QCn 不 同 種 微 珠 混 合 在 一 起 形 成 微 珠 池 (1624 24,000+種 微 珠 )寡 聚 核 苷 酸 探 針高 雜 交

26、 特 異 性全 長 序 列 探 針定 制 靈 活1 0 0 %質(zhì) 量 檢 控 QC Bead ProductionSynthesis of Oligos Activated Bead Plates+Oligo Plates Gilson 9 6 Tip Robot Oven Pooled Bead SetQC acid etchstrandcladdingstrandcore Photo-resistSilicon waferplasmaetchingcleaningOptical fiber 3 m beads in wells 芯 片 的 組 裝 將 微 珠 池 內(nèi) 微 珠 倒 入 蝕 刻

27、 光 纖 ， 微 珠 無序 自 組 裝 進(jìn) 入 小 孔 ， 每 根 光 纖 上 帶 一 個(gè)微 珠每 種 微 珠 大 約 有 3 0 個(gè) 重 復(fù)芯 片 的 組 裝消 除 系 統(tǒng) 隨 機(jī) 誤 差高 重 復(fù) 性微 珠 之 間 間 距 均 一 光 纖 束 -微 珠芯 片 的 組 裝 傳 統(tǒng) 芯 片 圖 Random Bead AssemblyMixture of Different Bead Types 6 x2 Whole Genome Bead Chip Bead Pool is pipetted on the Substrate No Information of Bead Identity a

28、nd location on Array Decoder hybridization 1 Decoder hybridization 2 芯 片 解 碼 n Gunderson et al. (2004) Decoding randomly ordered DNA arrays. Genome Research 14, 870-877. 4 .芯 片 解 碼 XY = total number of codesX = total number of colors or statesY = total number of hybridization stagesSingle IllumiCode

29、 StrategyExample: 3 8 = 6 ,5 6 1 4 8 = 6 5 ,5 3 6 每 張 芯 片 上 每 個(gè) 微 珠 每 個(gè) 特 性 都 被 質(zhì) 控(100%QC) 位 置 和 強(qiáng) 度 控 制 有 多 少 重 復(fù) 小 部 分 不 合 格 地 被 撿 出 是 Illumina 出 廠 前 的 生 產(chǎn) 步 驟 每 個(gè) 芯 片 在 出 廠 前 已 通 過 解 碼 和 質(zhì) 控解 碼 CD 隨 芯 片 送 至 用 戶 處芯 片 解 碼 Decoding Quality Metricsn % of Beads Loaded: 98%n % of Beads Decoded: 98%n B

30、ead Type Representation: 30 n Error Rate: 0.05%n Presence of all Bead Typesn Decoding Intensities of each stagen Focus Metricsn All parameters monitored in real time Decoding Quality Metrics BeadArray FormatsSentrix Array Matrix Sentrix BeadChip Formats Human-6HumanRef-8 Universal-1 6Custom-1 6 Huma

31、n-1 BeadStation掃 描 系 統(tǒng) 激 光 共 聚 焦 掃 描 系 統(tǒng) 高 分 辨 率 , 0 .8 micron 雙 色 激 光 at 5 3 2 & 6 3 5 nm 超 高 分 辨 率全 自 動(dòng) 化 定 位 ,掃 描 n Confocal laser scanning systemn Sub-micron, 0.8 micronn Two lasers 532, 635 nmn Supports Cy3 & Cy5 imagingn Auto-focusing, centering and tilting without photo bleachingn Supports genotyping, gene expression applicationsn Scans both Array Matrix and BeadChip microarrays Analytical Fluorescent Image